miR-196a通過PI3K/AKT信號通路促進口腔鱗狀細胞癌增殖、侵襲

宋洪寧 崔碩 雷印濤 劉敏

(山東第一醫科大學第二附屬醫院口腔頜面外科,山東 泰安 271000)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)在機體惡性腫瘤中排名第6,男女中發病率均較高,據統計,每年新發病例超過50萬〔1〕,且病例數量有逐年增加的態勢,發病年齡也更傾向青壯年,OSCC特點顯著,具備較強的周圍區域的侵犯性,相關引流區淋巴結轉移率也較高,短期愈合率較低,目前對其發病機制及深層次干擾因素仍缺乏了解,因此進一步研究其分子調控機制,尋找新的腫瘤標志物,有利于腫瘤發生前期的確認,便于盡早醫學干涉,對于OSCC患者,大大提高其治愈率,對預后改進意義重大。微小RNA(miRNA)被歸納為一類不可或缺的轉錄后調控因子,幾乎介入了細胞體所有生存活動,不論是細胞族群的壯大、細胞向不同方向的演化、細胞的湮滅,還是構筑血管、腫瘤的變化演進及遠處播散等,近年均受到廣泛關注并成為研究熱點,對其和OSCC間的研究也越來越多,從表達研究到對腫瘤細胞生物學功能的影響,從醫療遴選探索到早期檢測〔2〕,進一步揭示其內涵機制,能為OSCC的鑒別甄選、極富針對性的靶向手段、疾病演化進展等在學術上予以支持。miR-196a是miRNA中的重要成員,由同源異形盒基因家族(HOX)基因座轉錄而來,其在多種惡性腫瘤中異常高表達〔3〕,且這種高表達與淋巴結受侵犯范圍和相關疾病的分期存在密切關系,此外,瘤體細胞產生的對化療藥物的某些不敏感現象也與其有關系。本文通過分析HOK和SCC9細胞中miR-196a的表達情況、抑制miR-196a表達對SCC9細胞增殖、侵襲功能的影響,研究其與OSCC的關系,同時分析其是否通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路發揮作用,為了解miR-196a機制,開發安全有效的OSCC新型靶向針對性方法開拓新思路。

1 資料與方法

1.1標本、試劑和儀器 正常人口腔角質形成細胞(HOK)和OSCC細胞系(SCC)9由泰山醫學院實驗室贈予;胎牛血清、DMEM培養基、Opti-MEM培養基、蛋白裂解液放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、噻唑藍染色法(MTT)-8試劑盒均購自江蘇碧云天公司,胰蛋白酶、LipofectaminTM2000、DNA聚合酶和Trizol Reagent 來源于Invitrogen(美國),SYBR Premix Ex Taq、Prime Script RT相關產品Takara(日本),miR-196a、U6和miR-196a inhibitor、miR-196a inhibitor NC源自銳博(中國廣州),Transwell小室購自Corning(美國),PI3K抗體(cat.no.4257)、p-PI3K抗體(cat.no.17366)、AKT抗體(cat.no.9272)、p-AKT抗體(cat.no.9611)、FOXO1抗體(cat.no.2880)和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology(美國),Roche 480 Real-time PCR儀購自Thermo Fisher(美國),WB電泳裝置、轉膜儀和成像儀源自Bio-Rad(美國)。

1.2HOK、SCC9細胞培養和轉染 HOK和SCC9細胞采用DMEM培養基(成分是10%胎牛血清)進行繁育,相關進行細胞培養的環境設定為溫度37 ℃、CO2濃度5%,期間采用倒置顯微鏡進行檢查,分析細胞狀態,規定是1～2 d換液一次,以保證細胞的良好生存條件,當細胞生長密度達80%時,滴入胰酶〔內有乙二胺四乙酸(EDTA)〕進行消化分解,并進一步傳代繁育,在后續研究步驟需遴選情況良好的細胞進行。將miR-196a inhibitor引入至SCC9,實驗分為Control、Inhibitor NC、miR-196a inhibitor 3組,依據“LipofectamineTM2000”相關產品介紹執行實驗程序。

1.3qRT-聚合酶鏈反應(PCR)分析計算miR-196a的表達水平 嚴格遵循Triozol RNA分離試劑盒的產品使用介紹分離HOK、SCC9細胞的RNA,使用微量分光光度計度量RNA的濃度和純度,A260/A280數值大小作為RNA溶液是否符合相應純度標準的參考,該數值限定于1.8～2.1之間較為理想。引物序列:miR-196a正義:5′-CTGGAGTAGGTAGTTTC-ATGTTG-3′,miR-196a反義:5′-GTGCAGGGTCCG-AGGT-3′,U6正義:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,U6反義:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采取“SYBR? Green策略”反轉錄,獲取cDNA,接著采用“SYBR ? Premix Ex Taq TMⅡ”完成后續PCR實驗步驟,冰上配制PCR相關作用溶液,采用兩個階段的步驟進行PCR擴增,基本順序為:預變性:95 ℃,30 s(1個循環),PCR:95 ℃,5 s 60 ℃,30 s(40個循環),循環結束后,設置溫度從60 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。實驗重復3次,根據實驗數據分析出兩種基因的相對表達量(miR-196a和內參U6),最終統計結果是通過2-△△Ct公式建立。

1.4MTT檢測轉染后細胞增殖情況 用胰蛋白酶(濃度為0.25%)處理分解,每個孔中添入等體積量完全培養基(即不添加血清及抗生素),對胞體進行再次懸浮,取0.1 ml到96孔板中,控制細胞密度約2 000個/孔,每組設3個復孔;測定時間點為轉染后0 h,12 h,24 h,48 h。將MTT試劑(10 μl)加入各孔中,并在 37 ℃下再孵育4 h。洗去上清液,用二甲基亞砜(DMSO)溶解晶體。接著將吸光度值標定在490 nm條件下進行檢測。

1.5Transwell侵襲實驗檢測轉染后細胞侵襲能力 將24孔板置入Transwell室內,牛血清白蛋白(BSA)進行重懸操作,控制其密度大約為1×104個/ml,將300 μl細胞懸液加入遷移小室后接著在37 ℃環境下培養48 h,膜底以冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,再選4%甲醛進行穩態,室溫0.5 h,而后滴入0.1%紫羅蘭作用10 min;對標記出的圖像進行采集,接著通過軟件統計分析其中穿過室膜細胞數量。

1.6Western印跡分析計算轉染后4種蛋白數值情況 細胞遴選處于對數繁殖狀態,轉染操作經歷24 h,混合RIPA、部分蛋白酶抑制劑、蛋白酶抑制劑(DMSF)并進行消融,取50 μg蛋白提取物進行10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)實驗,后續把蛋白遷移至硝酸纖維素膜,用三乙醇胺緩沖鹽溶液稀釋(TBS)配制5%脫脂奶粉,封閉處理60 min,然后將依固定百分比稀釋一抗(1∶500)和磷酸甘油醛脫氨酶(GAPDH)一抗(1∶1 000)混合其中,4 ℃孵育一晚,三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽液(TBST)處理3次再混合二抗(1∶10 000),室溫放置1 h,后續ECL顯影曝光拍照,用ImageJ測量灰度值,重復3次實驗,數值用蛋白/GAPDH計算,該比值即代表蛋白水平。

1.7采用生物信息學、Western印跡方法預測分析靶標蛋白FOXO1 采用最常用的生物信息學在線軟件TargetScan,版本7.1,通過聯網(www.targetscan.org/vert_71)查詢miR-196a與FOXO1之間可能存在的靶標關系結合位點;Western印跡方法分析轉染后FOXO1、p-FOXO1蛋白表達情況,步驟同前。

1.8統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行配對樣本t、χ2檢驗。

2 結 果

2.1miR-196a在HOK和SCC9細胞中的表達 應用qRT-PCR分析計算miR-196a于兩種細胞內情況,熔解曲線呈單峰,擴增產物純度佳,無二聚體形成,與HOK(1.015±0.041)相比,SCC9 miR-196a 相對表達量(1.729±0.085)顯著升高,說明在SCC9內其數值水平顯著大于HOK(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-196a及U6基因qRT-PCR擴增、熔解曲線

2.2qRT-PCR分析計算轉染后miR-196a的表達量 與control組、inhibitor-NC組相比,miR-196a inhibitor組miR-196a表達量明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 3組轉染后miR-196a表達及MTT實驗檢測轉染后不同時間點細胞增殖能力

2.3MTT檢測轉染后細胞增殖情況 與control組和inhibitor-NC組相比,miR-196a inhibitor組在轉染0 h、12 h、24 h細胞增殖能力無明顯改變(P>0.05);轉染后48 h,miR-196a inhibitor組細胞增殖能力顯著下降,提示抑制miR-196a的表達能顯著降低SCC9細胞的增殖能力,且在轉染48 h后較為顯著(P<0.05)。見表1。

2.4Transwell侵襲實驗檢測轉染后細胞侵襲能力 24 h后,與control組、inhibitor-NC組比較,miR-196a inhibitor組SCC9細胞侵襲能力顯著下降(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 3組細胞中4種蛋白、24 h后SCC9細胞侵入下室數目

圖2 3組Transwell 24 h細胞侵襲(結晶紫染色,×100)

2.5Western印跡分析計算轉染后蛋白數值 與control組、inhibitor-NC組相比,miR-196a inhibitor組p-AKT、p-PI3K明顯下降(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 Western印跡檢測3組細胞AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表達

2.6采用生物信息學、Western印跡預測分析靶標蛋白FOXO1 根據TargetScan7.1給出的數據結果,經過分析,可知在FOXO1的3′UTR處存在與miR-196a相結合的位點,miR-196a inhibitor組FOXO1、p-FOXO1相對表達量(2.560±0.009、0.407±0.046)與inhibitor-NC組(0.622±0.013、2.137±0.366)相比,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

(A)生物信息學預測FOXO1為miR-196a的靶基因;(B)3組細胞中FOXO1、p-FOXO1蛋白電泳

3 討 論

OSCC在我國的口腔惡性腫瘤中的發生可能性高,該疾病初期就表現較強的轉移能力,容易導致術后瘤體的再生長,意味著疾病治療的失敗,且對OSCC晚期患者,外科的介入和放化療都很難有效改良生存曲線,對其以后生活影響頗大。因此,早發現、早治療是提高病人預后最好的手段,臨床中迫切需要尋找一種合適的腫瘤標志物,這對于該種疾病的甄別、醫治、預后及能否最大程度恢復生活水平均有影響。

miRNA作為一種具有18～22個長度值核苷酸的RNA,現被劃為小內源性非編碼,主要是借助于調控對應靶向基因的轉錄和翻譯。采集原發于胃的惡性腫瘤病例中發現,miR-196a和轉移存在正相關,提示其在該疾病的原位進展及遠處播散中或許是角色關鍵原因〔4～6〕,通過對血液中miR-196a分析檢測得出結論,其可能影響胃部惡性腫瘤患者的后期輔助性藥物治療效果,并且與預后聯系緊密,miR-196a極有希望被定義為一種分子層面的標志物,發揮胃癌的早期甄別及預后提示作用〔7〕;另據在食管癌的調查取樣分析,miR-196a表達異常升高出現于多個該類腫瘤分型中,不但限于腺癌,甚至體現在Barrett食管病灶中,非正常發育的病例中亦有體現,且這種升高水平和非正常程度存在某種正相關性,更深層次揭示miR-196a成為關鍵原因的可能,指示相關疾病衍化成食管類惡性腫瘤的時間節點,為監測腫瘤進程提供可靠依據〔8〕,且miR-196a基于此介入食管癌進程,從早期指示到后期愈合,其檢測指標聯結疾病預后,在食管癌生存曲線中成為新的評價信號〔9〕;在結直腸癌病種分析發現,miR-196a同樣出現表達數值的異常性,較周圍正常組織,其數值量明顯提升,且這種提升和腫瘤的多種臨床特征呈現相關性,如引流區域的淋巴結是否侵及,外圍器官是否受累,對于正確劃分其分期意義重大,miR-196a亦定義為結腸癌重要的篩選早期病例及判定遠期治療效果的標志物,為該種疾病基因層面的分析治療提供可靠靶點〔10〕;Liu等〔3〕通過研究宮頸惡性腫瘤,對選取的病例進行相關血液分析,發現miR-196a數值異常上調,這種上調并非無序性,而是緊緊圍繞該型腫瘤的相關醫學分期,惡性程度層次、周圍淋巴結浸潤與否展開,最終得出其能誘導相關腫瘤進展,并刺激癌轉移〔11〕,整體起到促癌效應。

miR-196a與口腔惡性腫瘤的關系同樣密切,其在頭頸部鱗癌中可能發揮促癌作用,影響腫瘤細胞的遷移、侵襲和黏附力,頭頸部鱗癌初期的病例中,其miR-196a整體數值明顯升高,這種升高程度在存在淋巴結轉移(LNM)的病例中尤為顯著,miR-196a這種數值的異常情況,跟病例的臨床生命周期緊密聯系,并且miR-196a表達量與患者生存率相關〔12〕,通過分析血液并提取miR-196a進行檢測,使其可以作為有效腫瘤標志物,用于早期診斷〔13〕。這些研究揭示,miR-196a在口腔腫瘤發揮的促癌作用,并與細胞行為存在聯系,參與影響腫瘤轉移,并能側面反映預后情況,與口腔腫瘤分期密切相關,但對于其如何發揮作用仍需要不斷探究?？傮w而言,miR-196a數值的升高表現在不同類別的惡性瘤體中,主要發揮誘導癌發生發展的效能,借助血清檢測手段,提取分析miR-196a數值,以捕獲相關疾病初期的窗口,并能協助分析疾病的轉歸并判定預后,目前關于miR-196a的關系脈絡挖掘還處于初期階段,不論是基本生命活動特性還是相關網絡關系內容仍需深入探索。

PI3K/AKT信號通路介入參與大量復雜的生理活動,影響包括細胞族群的壯大生存、不同方向的演變、相關血管網絡的構建、更新換代等,在腫瘤中PI3K/AKT可能起到控制器的作用,進而影響腫瘤的發展,其異常激活在腫瘤的演變及化學藥物抵抗方面十分重要,PI3K/AKT信號途徑的異常失調性在腫瘤中可以說是普遍存在,與腫瘤的圖譜均有關聯〔14,15〕。通過研究小腸腺癌〔16〕,發現其中PI3K/AKT信號途徑有明顯被激活的跡象,該信號或許能被定義成另一種醫學解決手段。通過對膽管上皮癌患者進行分析〔17〕,發現其中PI3K/AKT信號同樣存在異常表現,加入該相關通路的減活成分可以有效阻礙此類疾病上皮癌細胞繁殖和遷演。研究分析子宮內膜癌患者〔18〕,得出AKT磷酸水平、磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)的沉默,都與該疾病的出現相關,該疾病患者在伴有PTEN非陽性變化、AKT磷酸程度加深情況下,其恢復愈合更加困難,生命周期明顯縮短,PTEN/AKT兩者比值大小可以成為標定子宮內膜癌愈合恢復程度的關鍵指標,相應磷酸化程度高低和該類腫瘤臨床發展級別、組織層面類別、鄰近肌肉受侵犯程度、遠位引流區淋巴結浸潤聯系廣泛。除上述腫瘤,其在白血病〔19〕、胃癌〔20〕、肝癌〔21〕等各種腫瘤內都出現異?；罨?PI3K/AKT主要通過誘使激活AKT的活化進而作用于下游分子發揮作用,活化后AKT具備同時節制大量參加細胞凋亡進程的分子。

FOXO是Forkhead轉錄因子大家族最重要的一個亞群,Forkhead廣泛存在于真核細胞生物中,在哺乳動物中FOXO有4種亞型:FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6〔22〕,其中FOXO1是最早發現的成員,分布廣泛,幾乎遍布各組織器官,許多關鍵細胞功能均受其調控,影響細胞基本生命過程,是一種明確的抑癌基因,表達缺失或下降將激活啟動腫瘤惡性進程,其在多種惡性腫瘤中低表達,并與腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移相關〔23〕,FOXO1與口腔腫瘤的關系亦十分密切,Chan等〔24〕分析30例口腔癌組織標本,發現FOXO1表達相比于正常組織明顯下降,并發現HMG盒轉錄因子(HBP)1是FOXO1的直接下游轉錄靶點。Huang等〔25〕發現,槲皮素是一種有效的抗腫瘤因子,而在表皮生長因子受體(EGFR)過表達的口腔癌中,槲皮素通過FOXO1發揮抑制腫瘤生長的作用。FOXO1又是PI3K/AKT的下游信號,PI3K/AKT通路的激活具有促癌作用,FOXO1是這條通路中的關鍵一環,FOXO1受其負性調控〔26〕,若PI3K/AKT通路上調,相關蛋白量和磷酸化水平均上調,其磷酸化FOXO1能力增強,磷酸化FOXO1的量越高,與血管生成存在聯系的分子含量亦越高,pFOXO1可利于癌血管網構建,AKT通路的激活及FOXO1的磷酸化可以作為癌變傾向的早期生物學標志物〔27〕。