雷帕霉素抑制異動癥大鼠模型紋狀體神經元電活動

許葉 周暢 李建紅 趙振強 王埮 陳志斌

(1海南醫學院,海南 ?？?570102;2海南醫學院第一附屬醫院神經內科;3海南醫學院第二附屬醫院)

帕金森病(PD)是一種常見的神經退行性疾病,其主要的病理解剖特點為中腦黑質致密部(SNc)多巴胺能神經元進行性大量死亡,投射到紋狀體的多巴胺能神經纖維減少而致紋狀體多巴胺含量顯著下降,從而出現一系列運動癥狀和非運動癥狀,嚴重影響患者的正常工作和日常生活。 到目前為止,左旋多巴(L-DOPA)仍然是治療PD最有效的藥物。然而在L-DOPA治療5年后,80%以上PD患者出現療效減退,并且發生難以控制的運動并發癥——L-DOPA誘發異動癥(LID)〔1,2〕。LID一旦出現就會長期保持,不僅阻礙了L-DOPA對PD的進一步治療,而且患者為了改善癥狀需要接受侵入性和風險程度更高的治療,如深部腦電刺激術等。因此闡明LID的發病機制,并尋找有效的干預措施對于PD的治療至關重要。研究表明紋狀體區神經元異常放電是導致患者出現LID的重要原因之一。在LID模型中直接通路中間多棘神經元(MSNs)內的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路被持續激活;阻斷mTOR的信號轉導能明顯減輕LID而不影響L-DOPA對PD的治療作用〔3～5〕,提示mTOR信號的激活可能是導致LID紋狀體神經元異常發電的機制之一,并可能成為治療LID的新靶標。因此,本文對雷帕霉素抑制LID大鼠模型紋狀體神經元電活動展開研究。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級Sprague-Daewley大鼠,雄性,體質量(200±20)g,開熄燈各12 h,溫度控制在20～25 ℃,濕度控制在40%～60%,自由進食進水,試驗前先適應性訓練3～4 d。飼養過程嚴格按照華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心管理條例執行。

1.2試劑和設備 6-羥多巴(OHDA)、左旋多巴甲酯、鹽酸芐絲肼、雷帕霉素、二甲基亞砜(DMSO)、維生素C粉劑(美國sigma公司),阿撲嗎啡(美國Cayman公司),紅霉素軟膏(馬應龍藥業集團有限公司),Tween-20(Beyotime公司),聚乙二醇400散劑(汕頭市迅能貿易有限公司)。桌面數顯腦立體定位儀、微型手持式顱鉆、通用夾持器(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);多通道電路板、多通道電極基座、鎳鉻合金絲、金屬焊接絲、數據采集處理器、USB Data Cables、16通道輸入輸出端口擴充組件及線纜、電極連接適配器(江蘇易格生物科技公司);AB膠(得力集團有限公司);NeuroStudio 128通道、解旋器轉接套裝、Headstage(Bio-Signal Technologies);DELL 雙屏臺式電腦(戴爾股份有限公司);Offline Store軟件;NeuroExplorer軟件。

1.3實驗分組及模型制備 本實驗采用序貫的模式進行實驗分組。首先所有大鼠參照參考文獻〔6〕使用6-0HDA腦立體定位微量注射制成PD模型。以7%水合氯醛麻醉。麻醉后給予6-0HDA(2 μg/μl)(鉆顱坐標:AP:4.2;ML:1.5 mm;DV:-7.8 mm)注入一側SNc。在明確PD造模成功后進一步連續21 d腹腔注射L-DOPA+芐絲肼制作LID模型。隨后所有LID模型大鼠隨機分成2組,其中實驗組連續腹腔注射L-DOPA+雷帕霉素21 d, 1次/d;對照模型(假手術組):在LID模型基礎上,連續腹腔注射L-DOPA+DMSO 共21 d,1次/d。所有建模成功大鼠在7%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔麻醉下通過腦立體定位儀植入多通道電極陣列。觀察到的信號是電極尖端所在位置的平均胞外場電位(mEFP)〔7〕。

1.4行為學實驗及LID評分 術后第14天,頭頸部皮下注射阿撲嗎啡(0.05 mg/kg)誘導大鼠向對側旋轉,5 min后開始觀察,每5 min記錄一次,持續記錄30 min。記錄結果平均>7 r/min或>210 r/30 min為達標PD模型。各組均進行異常不自主運動(AIM)評分〔8〕。雷帕霉素組和對照組給藥后20 min進行評定,20 min/次,共6次,計算120 min內總分數。理想狀態下用藥后每個評分時間點滿分為16分,累計總分為96分。

1.5腦立體定位法多通道電極植入 實驗中采用自制16通道電極,參照參考文獻〔9〕進行制作。電極絲為0.001 3英尺鎳鉻合金絲,排列固定在電路板上,參考電極絲與其余電極絲之間間隔500 μm,其余電極絲間距為350～400 μm。電路板固定在電極基座上。制作完電極后進行手術埋置多通道電極陣列。Sprague-Daewley大鼠以7%水合氯醛0.5 ml/100 g行腹腔麻醉,固定于腦立體定位儀上,常規頭顱手術消毒備皮后,以前囟為原點確定坐標,前后囟相差不超過2 mm,按照Paxinos&Watson大鼠解剖圖譜以右側紋狀體為靶區,手持顱鉆在對應的坐標上鉆孔(鉆顱坐標:AP:-1.5 mm;ML:0.1 mm;DV:-3.8 mm)。去除骨瓣及硬腦膜后將電極緩慢下放至大鼠紋狀體區。手術結束后大鼠放回籠中休養恢復1 w后再進行下一步實驗。

1.6紋狀體神經元放電活動的記錄、整理和分析 連接headstage與大鼠頭部的電極排母,調試Neurostudio多通道數據采集系統,設置濾波參數和閾值線:低頻場電位為200 Hz以下,采樣頻率為2 ks/s;高頻動作電位為300 Hz以上;閾值線為-65 mV。設置完后對數據進行保存記錄。記錄完畢后,數據輸入OfflineSorter軟件,分離提取鋒電位和局部場電位(LFPs),Neuroexplorer分析導出LFPs,Matlab功率譜密度和時頻分析。

1.7電生理 本實驗中紋狀體成功植入多通道電極大鼠共10只,其中假手術組4只,記錄30個神經元;實驗組6只,PD狀態采集神經元72個,LID狀態神經元45個。雷帕霉素干預1 w后神經元39個,雷帕霉素干預2 w后神經元78個。植入電極成功的大鼠分成假手術組和實驗組。實驗組根據大鼠所處實驗狀態不同分為PD組、LID組、雷帕霉素1 w組、雷帕霉素2 w組,用以觀察PD、LID大鼠紋狀體神經元的放電情況及雷帕霉素使用時間長短對于紋狀體神經元異常放電的影響。

1.8電極位點損毀及鑒定 實驗結束后予7%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,連接電流器,對電極排母孔逐一通電損毀,將電極損毀后的大鼠固定在解剖臺上先后使用生理鹽水100～150 ml及200 ml 4%多聚甲醛進行心臟灌注。停止灌流后,斷頭取全腦,4%多聚甲醛浸泡2 h,30%的蔗糖4 ℃過夜,待組織沉降后進行紋狀體冰凍切片觀察。電極所在位點見圖1。

圖1 電極位點損毀及鑒定

1.9統計學分析 釆用SPSS22.0軟件進行分析。滿足正態分布和方差齊性的數據不同組比較采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA),不滿足正態分布和方差齊性的數據采用非參數檢驗。提取的電生理信號通過OfflineSorter、Neuroexplorer軟件分析導出數據。用GraphPadPrism8軟件制圖。

2 結 果

2.1雷帕霉素改善L-DOPA誘導LID大鼠的不自主運動 L-DOPA可以誘發大鼠出現不自主運動,隨著用藥天數逐漸延長,大鼠可表現出偏側扭轉等不自主運動。自用藥第9天起,雷帕霉素組AIM評分較對照組明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 兩組不同天數AIM 評分分)

2.2雷帕霉素顯著抑制LID大鼠紋狀體神經元放電頻率 LID組紋狀體神經元的放電頻率明顯高于假手術組(P<0.001),經過雷帕霉素干預1 w后紋狀體神經元放電頻率明顯較LID組下降(P<0.001),干預2 w后紋狀體神經元放電頻率較干預1 w時略有升高,但兩者無明顯統計學差異(P>0.05)。見圖2、表2。

表2 各組紋狀體神經元及簇狀放電頻率比較

圖2 各組紋狀體神經元放電頻率對比

2.3雷帕霉素改善LID局部場電位變化 局部場電位原始波形圖時頻見圖3。在10 Hz以下的低頻段及10～20 Hz之間的中頻段,PD組色彩最淡,LID組能量明顯高于PD組,經雷帕霉素干預1 w和2 w后能量較LID組明顯降低,低頻組能量經雷帕霉素干預1 w和2 w無顯著性差異,而在20～30 Hz的頻段,雷帕霉素1 w組和假手術組最深能量最低,LID組色彩最淡,能量最高,見圖4。場電位的功率譜分析見圖5A,LID組在0～10 Hz低頻范圍內能量最高,雷帕霉素干預組在15～40 Hz處略微高于LID組。上述結果提示,LID紋狀體神經元存在異常放電情況,雷帕霉素可以有效抑制紋狀體神經元的異常放電,干預時間1 w與2 w對紋狀體異常放電影響無明顯差異。

圖3 各組LFP信號

圖4 各組LFP的時頻分析

2.4雷帕霉素抑制LID簇狀放電頻率 LID組神經元簇狀放電頻率較假手術組及PD組明顯升高(P<0.001),而在雷帕霉素處理1 w及2 w后神經元簇狀放電頻率均下降(P<0.05,P<0.01),雷帕霉素1 w及2 w組神經元簇狀放電頻率無統計學差異(P>0.05)。見表2、圖5B。

3 討 論

LID的發病機制目前尚未完全清楚。有研究顯示mTOR信號通路在LID的發病過程中扮演重要角色〔10〕,使用mTORC1抑制劑雷帕霉素可以緩解6-OHDA誘導的PD大鼠長期攝入L-DOPA所發生的LID癥狀,這與D1R過度激活有關〔11,12〕。本研究同樣證實了雷帕霉素可以顯著改善LID大鼠的行為學癥狀,電生理研究顯示LID狀態下的大鼠紋狀體神經元自發放電頻率明顯升高。多通道微電極陣列技術可以記錄和檢測到多個神經元胞外動作電位,即鋒電位〔7〕。

這種技術能長時間對清醒動物中樞系統神經元放電活動進行監測和記錄,研究發現〔13～15〕中樞系統神經元的電生理活動可隨著動物的某些特定行為改變發生相應變化。多通道電極主要檢測的指標包括神經元的放電頻率、Burst發放頻率、局部場電位、時頻分析和功率譜分析。局部場電位時頻分析及功率分析表明,在10 Hz以下的低頻段(0～10 Hz)及中頻段(20～30 Hz),紋狀體神經元電活動減弱,予雷帕霉素干預1 w后,提示神經元電活動被有效抑制,雷帕霉素干預1 w和2 w其神經元電活動未見明顯改變。而在高頻段(15～40 Hz),LID組神經元電活動似乎略低于雷帕霉素干預組的神經元電活動,提示有可能在高頻段區域,雷帕霉素干預后的神經元放電方式已發生改變。

綜上,mTOR通路信號的異常激活是LID發生的重要環節,抑制mTOR通路的激活可作為治療LID的靶點,為此類藥物的開發提供一定依據。