遠程缺血預處理對兔脊髓缺血再灌注損傷的保護作用及腦源性神經營養因子表達的影響

秦洋 倪錦萍 康利 仲志棟 王立仁 尹述洲

(上海交通大學醫學院附屬蘇州九龍醫院麻醉科,江蘇 蘇州 215021)

遠程缺血預處理(RIPC)是指對缺血耐受能力強的組織或臟器進行短暫的缺血再灌注,以減輕遠端組織或臟器隨后更嚴重的缺血損傷〔1〕。研究表明,使用此預處理的方式可以有效減輕缺血再灌注給大腦、心臟、肝臟及腎臟造成的損傷〔2〕。Przyklenk 等〔3〕發現,當發生冠狀動脈缺血再灌注時對肢體進行短暫、輕微的缺血再灌注處理后,心肌梗死面積顯著減小。RIPC主要通過改善和維持能量代謝、改善微循環、減少自由基產生、抑制炎性因子的激活、抑制細胞凋亡、增強自噬、誘導內源性保護物質的釋放等途徑對遠隔器官起到保護作用〔4～7〕。

臨床上胸腹主動脈瘤手術可導致暫時性或永久性的脊髓缺血再灌注(SCIRI) 損傷,其發生率為3%～20%〔8〕。SCIRI損傷的一個主要病理改變是血-脊髓屏障的破壞,該屏障系統的破壞導致了神經功能的進一步損傷。腦源性神經營養因子(BDNF) 是神經營養因子家族成員中的一種,主要在中樞神經系統表達,可以起到加強突觸可塑性、促進神經發生、在中樞神經系統發育過程中對神經元的生長、分化和維持其正常生理功能起關鍵作用〔9〕。目前,RIPC 用于防治 SCIRI 的研究鮮有報道,本實驗觀察 RIPC 對兔SCIRI損傷的保護作用及BDNF表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 日本大耳白兔36只由鼠來寶實驗動物有限公司提供,動物批號:SYK2801212,動物合格證號:320730200100014125,雄性,3～4月齡,普通級,體質量2.2～2.5 kg,普通環境飼養,健康狀況良好,常規喂養在上海交通大學醫學院實驗中心,本實驗所有環節均符合3R原則,給予動物人道關懷,經醫院倫理委員會批準后進行〔SYXK(蘇)-2017-0043,IACUC-20170706-05〕。

1.2主要試劑 戊巴比妥鈉、青霉素注射試劑(美國Sigma公司);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)-Px及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物公司);BDNF、酶切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-9和Cleaved-caspase-3抗體(美國Abcam公司);BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3 mRNA引物(生工生物工程有限公司)。

1.3儀器 BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司);小動物專用呼吸機(DH40B,成都泰盟科技有限公司);常用手術器械:如手術剪、精細眼科剪、止血鉗、中號及小號鑷子、持針器、手術結扎線、1 ml注射器、眼科開瞼器、擴胸器等(上海醫療器械有限公司)。

1.4動物造模及分組 采取隨機雙盲法將大耳白兔分為假手術(S)組、SCIRI組及SCIRI+RIPC組各12只。具體方法:①麻醉方法:靜脈推注3%戊巴比妥鈉(1.0 ml/kg)及肌肉松弛劑維庫溴銨1.0 mg/kg,通過氣管插管接動物呼吸機,調節呼吸頻率 30 次/min,吸氣呼氣比為1∶2。維持麻醉采用間斷注射3%戊巴比妥鈉(0.5 ml/kg)和維庫溴銨(0.5 ml/kg)。其間注意監測血壓和心電圖,注意保暖保持直腸溫度38 ℃。手術完畢待動物清醒后拔除氣管導管,肌內注射40萬U青霉素,放回原籠飼養;②S組僅手術分離腹主動脈;③SCIRI模型建立:沿左豎肌旁縱行切開皮膚,分離腹主動脈。在左腎動脈下2 cm處用彈性硅膠管阻斷腹主動脈血流30 min,使其近心端平均動脈壓(MAP)稍有升高,遠心端MAP降為0 mmHg,然后松開進行再灌注。④RIPC組處理方法:用壓迫止血器阻斷右側股動脈近心端5 min;然后松開止血器恢復血流5 min。重復以上操作4次(共40 min);SCIRI+RIPC組則需要在夾閉主動脈前1 h實施RIPC。再灌注第5天后,將各組動物處死。

1.5后肢神經功能評分 實驗第5天后采用雙盲法由另一名不知道分組情況的人員利用 Tarlov 脊髓損傷改良評分標準〔10〕,對實驗動物進行后肢神經功能評分。分數越高,后肢神經功能越好,0～1分:無自主性活動,僅限于非反射性的膝、髖關節運動;2分:膝、髖和踝關節肢體運動;3分:行走時可主動支持體質量,不協調步態或偶見協調步態,4分:行走時前后肢協調步態,偶見趾關節的肢體運動;5分:正常步態。

1.6脊髓組織病理學觀察 Tarlov 脊髓損傷改良評分后處死動物,取部分脊髓組織(L4～L5 段),制作蘇木素-伊紅(HE)染色切片72 張(每個脊髓組織2張),采用雙盲法按Naslund分級病理損傷程度評估脊髓組織的損傷〔11〕。Ⅰ級:正常脊髓或神經元偶見少量胞質內顆粒變性或空泡;Ⅱ級:中等程度核染神經元與正常神經細胞之間或缺血性神經元可見胞質尼氏體丟失、膠質細胞核濃縮并增多;Ⅲ級:大量神經元細胞皺縮,核溶解,髓鞘消腫壞死,膠質細胞增多。

1.7脊髓組織中SOD和GSH-Px活性及MDA含量 硫代巴比妥酸比色法檢測脊髓組織中MDA水平,黃嘌呤氧化法檢測SOD活性,比色法檢測GSH-Px活性。取L3～L4 段脊髓組織約100 mg 進行勻漿,離心后取上清,采用相應試劑盒檢測氧化應激指標的活性。

1.8脊髓組織BDNF、Caspase-9和Caspase-3 mRNA 表達水平測定 取L3～L4 段脊髓組織利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)測定BDNF、 Caspase-9和Caspase-3 mRNA 與 GAPDH的相對表達量。利用Trizol法提取細胞總RNA后再利用紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度,參照cDNA合成試劑盒法逆轉錄合成cDNA再依次檢測BDNF、Caspase-9和Caspase-3 mRNA表達水平,內參基因為GAPDH。程序:94 ℃、15 s (變性);58 ℃,15 s(退火);72 ℃,15 s(延伸);40個循環。采用相對定量2-ΔΔCt法計算各組mRNA表達量?；蛞镄蛄?5′-3′):Caspase-3正向:TAAGCCACGGTGATGA AG,反向:CGGCAAGCCTGAATAATG;Caspase-9正向:GAACTTCAGCAGCACCTC,反向:CATTTCCTTGGCGGTCAG;BDNF正向:GATGAGGACCAGAAGGTTCG,反向:GATTGGGTAGTTCGGCATTG;GAPDH正向:CTCCTGCGACTTCAACAGTG,反向:TGAGGG CTCTTACTCCTTGG。

1.9脊髓組織中BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3蛋白檢測 取部分脊髓組織(L3～L5段)制作組織勻漿,按照總蛋白提取試劑盒說明書提取各組總蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)定量,通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、再濕轉法轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3(稀釋比例:1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,次日加入二抗稀釋液稀釋后的二抗(稀釋比例:1∶5 000),并在室溫孵育搖床1 h,按照高敏感度化學發光檢測試劑盒說明書滴加發光工作液顯色后,以GAPDH為內參,采用ImageJ軟件進行數據分析。

1.10統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗、秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組動物后肢神經功能評分 實驗于第5天結束時,SCIRI組后肢神經功能評分(0分2只、1分6只、2分4只)與S組(4分12只)相比明顯降低(Z=1.508、P=0.021);SCIRI+RIPC組的后肢神經功能評分(3分2只、4分10只)與SCIRI組相比增加,但差異無統計學意義(Z=1.916、P=0.055);SCIRI+RIPC組與S組差異無統計學意義(Z=0.360、P=0.999)。

2.2各組脊髓組織病理學變化 S組脊髓組織表現正常,神經元為多角形結構,胞核結構清晰,胞質中尼氏體存在,分布均勻;與S組相比,SCIRI 組脊髓損傷嚴重,表現為胞核固縮或溶解,胞質呈嗜伊紅染色,胞質中尼氏體消失,有的細胞固縮紅染明顯,可見紅色神經元;與SCIRI 組比較,SCIRI+RIPC組脊髓組織病理學改變明顯改善。見圖1。與S組(Ⅰ級12只)比較,SCIRI+RIPC組第5天病理切片Naslund分級結果(Ⅰ級11只、Ⅱ級1只)均無明顯變化(Z=1.063、P=0.208),而SCIRI組(Ⅱ級2只、Ⅲ級10只)有統計學差異(Z=2.047、P<0.001);與SCIRI組比較,SCIRI+RIPC組顯著改善(Z=1.921、P=0.001)。

圖1 各組脊髓組織病理學變化(HE染色,×200)

2.3各組脊髓組織中MDA水平及SOD和GSH-Px活性 與S組比較,SCIRI組MDA水平明顯升高,SOD和GSH-Px活性明顯降低(P<0.05);與SCIRI組比較,SCIRI+RIPC組MDA水平明顯降低,SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 3組脊髓組織中SOD、MDA 和 GSH-Px活性比較

2.4各組脊髓組織中BDNF、Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平 與SCIRI組相比,SCIRI+RIPC組脊髓中Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平顯著下降,而BDNF mRNA水平顯著增加(P<0.05);與S組比,SCIRI組脊髓組織中Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平顯著升高,而BDNF mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組脊髓組織中BDNF、 Caspase-9和 Caspase-3 mRNA 水平比較

2.5各組脊髓組織中BDNF、Cleaved-caspase-9,Cleaved-caspase-3蛋白水平 與S 組相比,SCIRI組脊髓組織中Cleaved-caspase-9 和 Cleaved-caspase-3 蛋白表達明顯升高(P<0.05),BDNF蛋白水平顯著降低(P<0.05);與SCIRI組相比,SCIRI+RIPC組Cleaved-caspase 9 和 Cleaved-caspase-3 蛋白表達明顯降低,BDNF蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 3組脊髓組織中BDNF、Cleaved-caspase-9,Cleaved-caspase-3蛋白表達

圖2 各組脊髓組織中BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3蛋白表達

3 討 論

在臨床工作中,如實施主動脈縮窄、胸腹主動脈瘤、脊柱和骨盆腫瘤等外科手術,為了獲得有利的手術視野及控制術中出血,常需阻斷主動脈血流。然而阻斷主動脈血流超過一定范圍會出現SCIRI等并發癥〔12〕。既往國內外大量醫務及科研人員針對如何有效減少圍術期SCIRI的發生開展了許多研究〔13〕,而SCIRI發病率仍較高〔14〕。因此,研究出新的有效的SCIRI防治手段具有十分重要臨床意義。本研究結果表明,SCIRI+RIPC組實驗動物后肢神經功能評分有改善,而脊髓損傷的病理學表型明顯減輕;說明在日本大耳白兔中,RIPC法對SCIRI的防治具有明顯作用,提示RIPC的臨床轉化應用具有重要前景。

此外,本實驗還發現,在SCIRI期間,受損的脊髓組織有明顯的脂質過氧化反應,產生了過量的活性氧(ROS),從而導致ROS自由基的大量出現。正常機體內需要適量的ROS,然而過量的ROS可以引發一系列的氧化應激反應與脂質過氧化反應,破壞正常DNA結構,導致受損區域出現凋亡或壞死〔15〕。SOD和GSH可以催化組織中ROS,將ROS轉變為無毒的氧化物或氧氣。彭金亮等〔16〕在探究大鼠腦缺血再灌注時發生,模型組大鼠SOD和GSH水平顯著降低,MDA含量顯著升高,從而對大腦造成氧化應激損傷。劉溪等〔17〕對缺血性腦卒中大鼠腦組織研究發現,腦卒中大鼠腦內一氧化氮合酶(NOS)和SOD活性顯著降低。因此,增強中樞神經系統中SOD和GSH的活性,減少MDA產生可達到防治神經元受損,起到保護神經元的作用。本研究說明,RIPC可以減輕腦組織內氧化應激反應的發生,從而發揮對大腦的保護作用。

BDNF是一類廣泛分布于中樞神經系統,對脊髓運動神經元的生長與功能調節發揮著巨大的作用〔18〕。在腦缺血模型中,BDNF可通過穩定細胞內Ca2+濃度、提高蛋白激酶活性、減輕自由基損傷等作用延緩神經元壞死和凋亡,從而發揮保護作用〔19〕。Ziemlińska等〔20〕在脊髓橫斷的大鼠模型中發現,BDNF可通過增加谷氨酸能和氨基丁酸能的神經傳遞促進早期運動功能的恢復。本實驗說明,RIPC可減輕SCIRI所導致的神經功能障礙,有利于運動功能恢復。相關研究顯示,細胞凋亡在許多神經系統疾病中起著重要作用,如阿爾茨海默病和帕金森病、腦缺血再灌注等細胞凋亡主要受Caspase家族蛋白調節。Caspase-3和Caspase-9均為促凋亡基因,正常情況下,無活性的Caspase-3、Caspase-9受到凋亡信號激活,導致DNA裂解,誘發細胞凋亡〔21〕。李曉楠等〔22〕探究血管性癡呆大鼠發病機制中發現,BDNF水平的降低導致Caspase-3、Caspase-9激活,從而導致腦組織發生凋亡,提示BDNF可介導Caspase家族蛋白。李雪蓮〔23〕對小鼠黑紋狀體系統損傷實驗中也有相似的發現,即BDNF可介導Caspase家族蛋白。本研究表明,SCIRI兔脊髓內存在損傷,凋亡細胞增加,但RIPC后,兔SCIRI脊髓組織中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9表達顯著降低,提示RIPC可以減輕脊髓損傷,起到相應的保護作用。

本研究說明,RIPC對SCIRI起到一定的保護作用,其可能原因是通過激活內源性BDNF表達水平的增加,降低凋亡因子的產生從而抑制神經元凋亡發揮相關保護作用。本研究主要在動物模型上對BDNF的表達量進行研究,但BDNF在基因及mRNA水平的表達量變化有待進一步研究。另外,本實驗可能為SCIRI的治療提供一種新的治療思路,而BDNF在其中如何發揮作用,其具體作用的靶點及通路尚需進一步深入研究。