外泌體介導的miR-663a通過調控TGF-β1/Smad信號通路影響結腸癌細胞侵襲和遷移

任俊宇 周銳澤 雷梓 許寧 黃鳳昌 李文亮

(昆明醫科大學第一附屬醫院 1腫瘤科,云南 昆明 650032;2病理科)

結腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一,其發生發展受多種因素影響,是一個多基因、多步驟的復雜過程〔1〕。由于結腸癌患者的早期癥狀不明顯,通常在初診時已為晚期,且預后不佳〔2〕。盡管目前在手術、放化療和綜合生物治療等治療策略上取得了較大進步,但晚期結腸癌患者的總生存率依然很低〔3〕。因此,探尋新的治療結腸癌的策略具有重要的意義。外泌體是由細胞分泌的直徑為30～100 nm的小囊泡,其含有豐富的蛋白質、miRNA等細胞特異性分子,可介導細胞間的物質交換和信息交流,在多種生理和病理生理過程中均發揮著至關重要的作用〔4〕。據報道,位于染色體20q11.1上的miR-663a在肝癌組織和細胞中表達下調,過表達miR-663a可抑制細胞的增殖、侵襲〔5〕;而轉化生長因子(TGF)-β1/Smad信號通路是細胞內重要的信號傳導途徑,可介導結腸癌細胞的增殖、遷移等生物學過程,抑制該信號通路的活化可以降低結腸癌細胞增殖、并誘導其凋亡〔6〕。但外泌體介導的miR-663a對結腸癌細胞的侵襲和遷移及TGF-β1/Smad信號通路的影響尚未見報道。本研究旨在探索外泌體介導的miR-663a對結腸癌細胞的侵襲和遷移的影響及可能的分子機制,以期為研發新的治療結腸癌手段提供新方向。

1 材料與方法

1.1結腸癌細胞 人骨髓間充質干細胞(BMSC)、人結腸癌細胞株HT-29、Caco-2、SW480、HCT-116及人正常結腸上皮細胞株NCM460均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑與儀器 miR-663a模擬物(miR-663a mimics)及其陰性對照(miR-NC)、TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒均購自美國ThermoFisher公司;胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒均購自美國Bio-Rad公司;TransStart?Green qPCR SuperMix均購自TaKaRa公司;Trizol試劑、電化學發光(ECL)試劑盒均購自美國Sigma公司;CD63、CD81、TGF-β1、Smad2、Smad3、GAPDH兔多克隆抗體(anti-CD63、anti-CD81、anti-TGF-β1、anti-Smad2、anti-Smad3、anti-GAPDH)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司;ABI7300實時熒光定量PCR系統購自美國ABI公司;CO2培養箱購自上海知楚儀器有限公司。

1.3細胞培養 BMSC細胞、人結腸癌細胞株HT-29、Caco-2、SW480、HCT-116和人正常結腸上皮細胞株NCM460均在含有10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中培養。培養條件為37 ℃,5%CO2。

1.4外泌體的收集 BMSC細胞在無FBS的培養基中處理2 d后,收集BMSC細胞培養上清液2 000 r/min離心10 min去除死細胞。丟棄沉淀后,將上清液轉移到新的收集管中,采用微孔濾膜過濾后加入外泌體提取試劑至細胞上清液中,輕輕混勻后,4 ℃條件下過夜,次日以889 000 r/min超速離心70 min沉淀外泌體。棄去上清液后,將外泌體顆粒重新懸浮在磷酸鹽緩沖液(PBS)中,即可獲得外泌體。

1.5透射電子顯微鏡觀察外泌體 取濃度為0.5 mg/ml的外泌體10 μl滴加至碳覆膜銅網上,吸附1 min后,用濾紙吸去多余液體并晾干,銅網上滴加10 μl醋酸鈾染色液避光染色1 min,用濾紙吸去多余液體并晾干,上機,80 kV成像。

1.6外泌體轉染 參照文獻〔7〕,將1.4中所得的外泌體利用PBS重懸后,利用BCA法檢測外泌體濃度,將miR-663a mimics或miR-NC與外泌體在無菌PBS中混合后,加入終濃度為0.1 mol/L的CaCl2,將混合物置于冰上,最后在4 ℃條件下,以30 000 r/min超速離心70 min分離外泌體,并分別命名為EXO組(未轉染的外泌體)、EXO-miR-NC組(miR-NC轉染外泌體)、EXO-miR-663a組(miR-663a mimics轉染外泌體)。

1.7細胞分組 將獲得的EXO組、EXO-miR-NC組、EXO-miR-663a組外泌體分別與SW480細胞共培養24 h,分別命名為SW480+EXO組、SW480+EXO-miR-NC組、SW480+EXO-miR-663a組,在SW480+EXO-miR-663a組中加入TGF-β1/Smad信號通路激活劑SRI-011381,命名為SW480+EXO-miR-663a+SRI組,另取SW480細胞記為SW480組作為對照。

1.8細胞內吞外泌體實驗 采用外泌體紅色熒光標記染料PKH26對BMSC來源的外泌體進行染色并嚴格按照說明書進行操作,將染色的外泌體加入SW480細胞培養液中,孵育24 h后,利用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.9實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測miR-663a的表達 使用Trizol試劑提取細胞與外泌體中的總RNA,使用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。隨后,使用TransStart?Green qPCR SuperMix在ABI7300實時熒光定量PCR系統上進行擴增反應以確定miR-663a的表達水平。以U6為內參,使用2-ΔΔCt方法計算miR-663a的相對表達水平。所用引物為:U6-正向5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGTCCC-3′, 反向5′-ACACTCCAGCTGGGAGGCGGGCGCCGCGG-3′;miR-663a正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。每個樣品設置6個復孔。

1.10Western印跡檢測蛋白表達 使用RIPA裂解緩沖液裂解細胞并提取總蛋白。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離40 μg蛋白質,將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,利用5%脫脂牛奶封閉2 h,然后分別加入一抗anti-CD63(1∶2 000)、anti-CD81(1∶3 000)、anti-TGF-β1(1∶1 000)、anti-Smad2(1∶4 000)、anti-Smad3(1∶5 000)、anti-GAPDH(1∶2 000)于4 ℃下孵育過夜,TBST洗膜3次后,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h,使用ECL系統可視化蛋白質條帶。使用ImageJ軟件量化蛋白質的條帶,并使用GAPDH作為對照,每個樣品設置6個復孔。

1.11Transwell實驗檢測細胞侵襲與遷移 細胞遷移實驗:將細胞用無FBS的DMEM培養基重懸并調整細胞濃度為2×105個/ml。取100 μl的細胞懸液接種到Transwell上腔室中,并將500 μl含有10%FBS的DMEM培養液添加到Transwell下腔室中。在5%CO2、37 ℃條件下孵育24 h后,用棉簽擦拭上腔室中的細胞,并用100%甲醇固定,結晶紫染色20 min。然后,漂洗細胞并干燥。在倒置顯微鏡下隨機選擇6個視圖觀察,并統計細胞遷移數目。

細胞侵襲實驗:將基質膠預先涂在Transwell上腔室中,待其自然干燥后,將各組細胞用無FBS的DMEM培養基重懸,調整細胞濃度為2×105個/ml。取200 μl的細胞懸液接種到預先涂有基質膠的上腔室中,其余步驟同細胞遷移實驗。

1.12統計分析 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1外泌體的鑒定 與人正常結腸上皮細胞株NCM460(1.05±0.11)比較,miR-663a在結腸癌細胞系HT-29、Caco-2、SW480、HCT-116中的表達水平(0.62±0.05、0.41±0.03、0.21±0.01、0.36±0.02)顯著降低(P<0.05,n=6),且在上述結腸癌細胞系中,miR-663a在SW480中的表達水平最低。透射電子顯微鏡結果顯示,BMSC細胞的外泌體均呈現出直徑為30～100 nm的囊泡狀結構,見圖1。Western印跡結果顯示,CD63(1.05±0.11 vs 0.09±0.01)和CD81蛋白(1.01±0.09 vs 0.07±0.01)在BMSC細胞的外泌體中的表達水平顯著高于細胞裂解液(t=21.290、25.427,P均<0.001,n=6),見圖2。

圖2 Western印跡檢測BMSC細胞外泌體和細胞裂解液中CD63和CD81蛋白的表達

2.2BMSC細胞內及BMSC細胞來源外泌體中miR-663a的表達 與BMSC組(1.05±0.13)比較,EXO組miR-663a表達(2.13±0.18)顯著升高(t=11.915,P<0.05,n=6);與EXO組和EXO-miR-NC組(2.21±0.19)比較,EXO-miR-663a組表達(3.42±0.26)顯著升高(t=9.204,P<0.05,n=6)。

2.3腫瘤細胞內吞外源性外泌體 激光共聚焦顯微鏡結果顯示,PKH26標記的紅色熒光的外泌體主要位于SW480細胞胞質內,并分布在核周圍,大部分SW480細胞可見到紅色熒光信號,見圖3。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察SW480細胞對BMSC細胞來源外泌體的攝取(×400)

2.4各組細胞侵襲數目比較 與SW480組比較,SW480+EXO組細胞侵襲數目顯著降低(P<0.05);與SW480+EXO組和SW480+EXO-miR-NC組比較,SW480+EXO-miR-663a組細胞侵襲數目顯著降低(P<0.05);SW480+EXO-miR-663a+SRI組細胞侵襲數目顯著高于SW480+EXO-miR-663a組(P<0.05),見圖4、表1。

表1 各組細胞侵襲、遷移數目及細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達比較

圖4 Transwell 實驗檢測各組細胞侵襲(結晶紫染色,×200)

2.5各組細胞遷移數目比較 SW480+EXO組細胞遷移數目顯著低于SW480組(P<0.05);SW480+EXO-miR-663a組細胞遷移數目顯著低于SW480+EXO組和SW480+EXO-miR-NC組(P<0.05);SW480+EXO-miR-663a+SRI組細胞遷移數目顯著高于SW480+EXO-miR-663a組(P<0.05),見圖5、表1。

圖5 Transwell 實驗檢測各組細胞遷移(結晶紫染色,×200)

2.6各組細胞中TGF-β1/Smad信號通路相關蛋白表達比較 SW480+EXO組細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平顯著低于SW480組;與SW480+EXO組和SW480+EXO-miR-NC組比較,SW480+EXO-miR-663a組細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與SW480+EXO-miR-663a組比較,SW480+EXO-miR-663a+SRI組細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見表1、圖6。

1～5:SW480組、SW480+EXO組、SW480+EXO-miR-NC組、SW480+EXO-miR-663a組、SW480+EXO-miR-663a+SRI組

3 討 論

外泌體是納米級的細胞外囊泡,由于其能夠穩定地傳遞藥物、治療性miRNA及蛋白質等,所以外泌體可以作為潛在的腫瘤靶向藥物載體來治療腫瘤〔8〕。此外,外泌體的藥物遞送系統具有將功能分子遞送到細胞中及在血液中具有穩定性、先天生物相容性和免疫耐受性,因此與傳統的藥物遞送系統相比具有許多優勢〔9〕。本研究結果證明,成功獲得BMSC來源的外泌體。

結腸癌是世界上第三大最常見的癌癥,癌細胞的侵襲和轉移是結腸癌相關死亡的主要原因之一〔10〕。研究表明,外泌體介導的miRNA在結腸癌腫瘤微環境中發揮著重要的調節作用〔11〕。李曉輝等〔12〕報道骨髓間充質干細胞來源攜帶高水平miR-196b-5p的外泌體可抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲,并誘導細胞凋亡;Xu等〔13〕發現骨髓間充質干細胞來源含有miR-16-5p的外泌體可抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。miR-663a作為miRNAs中的一員,對生物的生長、發育、細胞增殖及分化起到重要的調控作用〔14〕。已有研究顯示,miR-663a在非小細胞肺癌中下調并通過靶向JunD抑制增殖和侵襲〔15〕,但外泌體介導的miR-663a對結腸癌細胞的侵襲和遷移的影響尚不明確。本研究結果提示,外泌體中miR-663a的表達顯著高于BMSC細胞,且外泌體轉染成功;BMSC外泌體介導的miR-663a可抑制SW480細胞的侵襲、遷移。

TGF-β1/Smad信號通路在結腸癌的發生發展中起關鍵作用。據相關文獻介紹,TGF-β1能夠與其受體結合,進而刺激觸發下游Smad2、Smad3信號的轉導〔16〕。相關研究表明,TGF-β1信號傳導促進了癌細胞的生長、侵襲和轉移,抑制TGF-β1可防止轉移性癌癥進展〔17〕;脂多糖刺激巨噬細胞來源外泌體參與上皮細胞間質轉化,該機制與激活TGF-β1/Smad2/3信號轉導通路有關〔18〕;丹皮酚通過抑制TGF-β1/Smad信號傳導和上皮間充質轉化來抑制胰腺癌細胞遷移和侵襲〔19〕;間充質干細胞來源的外泌體通過抑制TGF-β1/Smad通路逆轉上皮間質轉化并促進受損子宮內膜的修復〔20〕。本研究結果顯示,外泌體介導的miR-663a通過抑制TGF-β1/Smad信號通路來抑制結腸癌細胞的侵襲和遷移。

綜上所述,外泌體介導的miR-663a通過抑制TGF-β1/Smad信號通路來抑制結腸癌細胞的侵襲和遷移。但是,影響結直腸癌侵襲和遷移的通路較多,miR-663a是否還通過其他通路作用于結腸癌細胞,尚需后續研究。