自動固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定暫養水中45種抗生素藥物的含量

劉奕雄,張凱旋,朱雨田,李 意,馮玉楨,袁定帥,趙博揚,杜業剛

(深圳市計量質量檢測研究院,深圳 518109)

氯霉素、孔雀石綠等藥物都是人工合成抗生素[1-2],常被用作治理水產養殖中真菌、細菌及寄生蟲感染的首選藥物。硝基呋喃類、氯霉素類等抗生素早在2002年就均被我國農業部門列入?食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單?,但是每年水產品抽檢中還是能發現違規使用禁用藥物問題[3],長期食用不合格水產品會危害人體健康[4-5]。為了降低水產品發病率、提高存活率,不法商販可能會向暫養水中違規投放抗生素藥物,這也是導致水產品中檢出違禁品和抗生素藥物殘留超標的原因之一。

目前檢測抗生素的方法主要是酶聯免疫法[6-8]、毛細管電泳法[9-11]、液相色譜法[12]、液相色譜-串聯質譜法[13-18]等。不同抗生素藥物化學結構和性質差異較大,存在同時處理檢測復雜且耗時長的問題,導致一次檢測藥物種類少,回收率不理想。本工作針對目前水產品檢出率較高的喹諾酮類、孔雀石綠、四環素類、磺胺類、呋喃類、氯霉素類等6類抗生素展開方法學研究,提出了自動固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法(SPE-UHPLC-MS/MS)測定水產品暫養水中45種抗生素藥物含量的方法,具有分析效率高、重復性高、檢測時間短的特點,實現了水產品暫養水的高通量抗生素檢測。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC?I-Class型超高效液相色譜儀;AB SCIEX Triple QuadTM5500型質譜儀;Fotector Plus型全自動高通量固相萃取儀;HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL);Auto EVA-60 型控溫氮吹濃縮儀;QUINTIX224-1CN 型電子天平;Milli-Q Direct 8型超純水系統。

單標準儲備溶液:100 mg?L－1,稱取適量的各標準物質(相當于活性成分10 mg),用甲醇溶解,并定容至100 mL,配制成質量濃度為100 mg?L－1的單標準儲備溶液。

混合內標溶液:取適量的內標的單標準儲備溶液,用20%(體積分數,下同)甲醇溶液稀釋,配制成氘代喹諾酮類、氘代磺胺類的質量濃度為1.00 mg?L－1,氘代孔雀石綠、氘代隱色孔雀石綠、氘代氯霉素類的質量濃度為100μg?L－1的混合內標溶液。

乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)-Mcllvaine緩沖溶液:將1 L 的0.1 mol?L－1檸檬酸溶液與625 mL的0.2 mol?L－1磷酸氫二鈉溶液混合,調節pH 為(4.0±0.5);稱取60.5 g Na2EDTA 放入上述1 625 mL 緩沖溶液中,使其溶解混勻,配制成0.1 mol?L－1Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。

4種四環素類、3種氯霉素類、15種喹諾酮類、17種磺胺類、4種呋喃類、孔雀石綠及代謝物隱色孔雀石綠、8種氘代化合物的標準物質的純度均大于98%;甲醇、甲酸為色譜純;Na2EDTA 為分析純;試驗用水為一級水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18RRHD 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫35 ℃;進樣量4μL;流量0.3 mL?min－1;流動相A 為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～3.5 min時,A 由95%降至70%;3.5～7.0 min時,A 由70%降至5%,保持1.0 min;8.0～9.0 min時,A 由5%升至95%,保持1.0 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)、負離子(ESI－)分段時間掃描監測;多反應監測(MRM)模式;離子源電壓5 500 V/－4 500 V;離子源溫度500 ℃;氣簾氣壓力275.8 kPa;霧化氣壓力344.75 kPa;輔助加熱氣壓力344.75 kPa。53種化合物的保留時間、碰撞能量、去簇電壓等參數見表1,其中“?”代表定量離子對。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集

水產品養殖水取自餐飲環節和流通環節,抽取暫養池水500 mL,置于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 樣品前處理

準確移取40.0 mL經0.45μm 尼龍濾膜過濾后的暫養水,與10 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液混勻,加入0.05 mL 混合內標溶液,用0.1 mol?L－1鹽酸溶液調節溶液酸度至pH 4,然后以1滴?s－1的速率過HLB固相萃取柱(預先用3 mL甲醇、3 mL水活化),待樣品完全流出后,以2 mL 水淋洗,減壓抽干,用6 mL 甲醇洗脫。收集洗脫液,于40 ℃氮吹濃縮至近干,用1.00 mL 20%甲醇溶液溶解殘渣,經0.22μm 濾膜過濾,按照儀器工作條件測定。

1.3.3 數據處理

氯霉素類、喹諾酮類、磺胺類、孔雀石綠及代謝物用內標法定量,四環素類和呋喃類藥物用外標法定量。用AB SCIEX 數據處理軟件對質量濃度、線性回歸方程、回收率進行分析,用Excel軟件進行凈化方式對比、相對標準偏差(RSD)分析。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 水樣酸度

暫養水樣酸度會影響藥物存在形式,影響最終富集凈化效果,因此調節溶液酸度顯得尤為重要。四環素類藥物屬于兩性化合物,在堿性和高溫環境下不穩定,在中性條件下其羥基以及羰基等官能團與游離的重金屬離子形成絡合物[19]。國家標準方法[20-21]和文獻[22-24]選擇Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4)提取,在酸性環境中四環素類藥物較為穩定,水中的金屬鈣鎂離子優先與緩沖液中的EDTA 發生螯合反應,從而提高藥物富集效果。喹諾酮類藥物大部分屬于兩性化合物,結構形態受酸度影響顯著[25]。在強酸性條件下,氟喹諾酮以強陽離子形態存在;當pH 為3～4時,氟喹諾酮主要以兩性離子形態存在;當pH 進一步升高時,氟喹諾酮以弱陰離子形態存在。將水樣酸度調至pH 為2,4,6,8進行加標回收試驗,結果發現當pH 為4時四環素類、喹諾酮類、磺胺類藥物的回收率較好,其他藥物回收率亦滿足要求。因此,試驗選擇水樣酸度pH 為4。

2.1.2 固相萃取柱

暫養水中藥物含量比較低,需要富集凈化才能進行檢測[26]。液液萃取操作繁瑣,并且四環素類藥物的回收率低。樣品先經0.45μm 尼龍濾膜過濾,能除掉水中懸浮大顆粒雜質,防止堵塞固相萃取柱。試驗采用MCX 固相萃取柱凈化時,四環素類、氯霉素類和大多數硝基呋喃類藥物回收率為0,而采用HLB固相萃取柱凈化時,45種藥物的回收率滿足60.0%～120%的要求,如圖1 所示。HLB 固相萃取柱的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔有機聚合物。二乙烯苯含有親脂性的官能團,具有反相吸附劑的特性,而N-乙烯基吡咯烷酮含有親水性的官能團,具備保留極性化合物的能力。通過調節水相條件改變親水-親脂平衡,HLB 固相萃取柱適用非極性、中等極性、極性化合物的凈化,能對四環素類、氯霉素類、硝基呋喃類藥物等進行較好的吸附凈化。因此,試驗選擇HLB 固相萃取柱進行凈化。

圖1 采用HLB固相萃取柱與MCX 固相萃取柱時45種藥物回收率的對比Fig.1 Comparison of recoveries of 45 drugs using HLB and MCX solid phase extraction columns

2.1.3 洗脫劑

試驗對比了甲醇、體積比1∶1的甲醇-乙酸乙酯混合液、體積比1∶1的甲醇-丙酮混合液等3種試劑對45種藥物的洗脫效果,結果見圖2。

由圖2可知:采用體積比1∶1的甲醇-乙酸乙酯混合液洗脫時,磺胺嘧啶和呋喃唑酮的回收率大于120%,金霉素的回收率小于60.0%;采用體積比1∶1的甲醇-丙酮混合液洗脫時,土霉素、強力霉素、培氟沙星的回收率大于120%;而采用甲醇洗脫時,45種藥物的回收率均在60.0%～120%內。因此,試驗選擇甲醇為洗脫劑。

2.2 色譜條件的優化

本工作研究涉及了45種抗生素藥物,它們之間化學結構和性質有差異,以Agilent Eclipse Plus C18RRHD 色譜柱分離,采用梯度洗脫才能獲得分離度較好的色譜峰。試驗比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-5 mmol?L－1乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液等流動相體系的分離效果,結果發現采用0.1%甲酸溶液作為流動相的水相,可形成尖而窄的色譜峰,提高ESI＋模式下的化合物質譜信號,同時也不影響ESI－模式下的化合物質譜信號,因此試驗最終選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相體系。45種藥物的MRM 色譜圖見圖3,其中氯霉素和孔雀石綠的質量濃度為2.00μg?L－1,其他藥物的質量濃度為10.0μg?L－1。

圖3 45種藥物MRM 色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of 45 drugs

2.3 質譜條件的優化

分別將0.1 mg?L－1標準溶液在ESI＋、ESI－模式下進行母離子全掃描。選擇合適電離方式進行質譜分析得到特征碎片離子,進一步優化質譜參數,使特征碎片離子強度達到最大。其中氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素、呋喃西林、呋喃妥因在ESI＋模式下質譜信號非常弱,反而在ESI－模式下有較強質譜信號,而其他藥物正好相反。具體的質譜條件見1.2.2節。

2.4 工作曲線和測定下限

用空白基質提取液逐級稀釋,并加入適量混合內標溶液,配制基質匹配的混合標準溶液系列,其中內標氘代喹諾酮類、氘代磺胺類的質量濃度為50.0μg?L－1,氘代孔雀石綠、氘代隱色孔雀石綠、氘代氯霉素的質量濃度為5.00μg?L－1。按照儀器工作條件測定上述溶液,其中四環素類和呋喃類藥物以質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標;其他藥物以質量濃度為橫坐標,以其對應的峰面積與內標峰面積比值為縱坐標,繪制工作曲線。結果顯示,氯霉素類和孔雀石綠工作曲線的線性范圍為0.200～20.0μg?L－1,其他藥物工作曲線的線性范圍為1.00～100μg?L－1,相關系數為0.995 1～0.999 9。

參考GB 5009.295－2023?食品安全國家標準化學分析方法驗證通則?,向空白樣品基質中添加目標分析物,以信噪比為10時的添加濃度水平作為測定下限。結果顯示,氯霉素類和孔雀石綠的測定下限為5.0 ng?L－1,其他藥物的測定下限為25 ng?L－1。

2.5 精密度和回收試驗

取空白水樣40.0 mL,置于50 mL 聚丙烯離心管 中,進行低濃度水平0.050 0 μg?L－1或0.250μg?L－1、中濃度水平0.150 μg?L－1或0.750μg?L－1、高濃度水平0.250 μg?L－1或1.25μg?L－1的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6 次,計算回收率和測定值的RSD。結果顯示:四環素類藥物的回收率為68.4%～92.7%,測定值的RSD 為2.5%～4.7%;喹諾酮類藥物的回收率為61.6%～106%,測定值的RSD 為1.4%～8.9%;磺胺類藥物的回收率為75.7%～112%,測定值的RSD 為1.2%～6.3%;孔雀石綠藥物的回收率為85.4%～110%,測定值的RSD 為1.7%～6.0%;呋喃類藥物的回收率為80.6%～115%,測定值的RSD 為1.3%～8.4%;氯霉素類藥物的回收率為86.8%～115%,測定值的RSD 為1.9%～6.4%。說明方法的精密度和準確度滿足分析要求。

2.6 方法比對

本方法與其他文獻方法比較結果見表2。結果表明,本方法的測定下限和回收率等能夠滿足檢測水樣中多種藥物的定量分析要求。相對于傳統的手動或者半自動固相萃取裝置,自動固相萃取方法進行富集,富集水樣體積較少,采用UHPLC 分析時間短,可有效縮短樣品測試周期,覆蓋藥物種類和數量較多,能滿足監管部門要求。

2.7 樣品分析

覆蓋人們日常消費的鱸魚、基圍蝦、福壽魚等31種水產品類別,采集共82批暫養水,采用試驗方法對45種藥物進行分析,其中21批暫養水中檢出藥物殘留,總檢出率為25.6%,詳細結果見表3(“?”代表同批次中同時檢測出恩諾沙星和環丙沙星)。其中氯霉素檢出量為0.043 0～26.0μg?L－1;恩諾沙星檢出量為0.330～200μg?L－1;環丙沙星檢出量為0.260～6.40μg?L－1;氟甲砜霉素檢出量為2.80μg?L－1;磺胺二甲嘧啶檢出量為0.340μg?L－1。從檢測結果來看,水產品暫養水中氯霉素、恩諾沙星、環丙沙星檢出率較高。流通環節暫養水樣品抗生素藥物殘留檢出率為27.5%,占比最高,說明此環節水產品暫養水質量可能存在一定風險。水產品在此環節暫養時間較長,有商家在暫養池水中使用抗生素甚至是違禁藥物來抑制相關致病菌繁殖,預防水產品相互摩擦碰撞導致傷口感染病菌,達到保護水產品品質的目的。

表3 暫養水樣分析結果Tab.3 Analytical results of temporary aquaculture water samples

本工作采用SPE-UHPLC-MS/MS測定水產品暫養水中45種抗生素藥物的含量,具備富集水樣體積少、分析簡單快速、精密度好等特點,可為相關安全監管部門監測養殖水質量風險提供技術支持。受抽檢樣品數量所限,今后可適當增加暫養水類別和暫養水批次進行監測分析,以進一步發現暫養水中藥物殘留水平。