液相色譜-串聯質譜法測定水產品中甲氨基阿維菌素的殘留量

藍 草,歐陽少倫,鄒 游,邵琳智

(廣州海關技術中心,廣州 510623)

甲氨基阿維菌素是以阿維菌素主要活性成分阿維菌素B1a和阿維菌素B1b為原料,通過衍生合成、優化改進而得到的一種新型高效半合成生物源殺蟲劑,其作用機理為阻斷γ-氨基丁酸(GABA)受體和谷氨酸氯離子通道,干擾神經傳遞,導致昆蟲癱瘓、死亡[1-3]。

甲氨基阿維菌素因高效、廣譜、長效等優點,成為劇毒農藥的替代品,廣泛應用于果蔬和農作物病蟲害的防治,但不合理使用會對其他非目標生物和環境造成嚴重危害。研究表明甲氨基阿維菌素對蜜蜂、鵪鶉、斑馬魚毒性均為高毒級,對家蠶為特高毒級[4]。此外,甲氨基阿維菌素還是一種抗寄生蟲藥Slice?的有效成分,該藥是美國唯一批準使用的化學治療藥物,被大量用于大西洋鮭魚的養殖。甲氨基阿維菌素通過未食用的飼料以及魚類排泄物進入到海洋環境后,極易積累在環境中,并且降解十分緩慢,其對海洋生物及環境具有較嚴重的危害。研究顯示,甲氨基阿維菌素對與目標物種海虱在生物學上相似的水生動物(如螃蟹和龍蝦)具有較強的毒性作用[5-7]。因此,歐盟、加拿大、日本等均對水產品中的甲氨基阿維菌素制定了殘留限量要求,其中國際食品法典委員會(CAC)規定鮭魚、鱒魚肌肉和魚片(自然比例的肌肉＋皮)中甲氨基阿維菌素的最大殘留限量為100μg?kg－1[8];日本規定甲氨基阿維菌素在鮭科魚類(如鮭魚和鱒魚)中最大殘留限量為100μg?kg－1,其他水產品中最大殘留限量為0.5μg?kg－1[9]。雖然至今我國還未制定有關水產品中甲氨基阿維菌素最大殘留限量的標準,但是對水果蔬菜、谷物等植物源性食品均制定了嚴格的限量規定,因此有必要對水產品中的甲氨基阿維菌素殘留量進行風險監測和管理,以滿足進出口貿易的要求。

目前對于甲氨基阿維菌素殘留檢測的文獻報道主要適用于水果蔬菜[4,10-11]、谷物[12-13]、煙葉[1]、植物油[14]等植物源性食品,檢測方法包括液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法,對于水產品中的甲氨基阿維菌素的文獻報道較少。本工作提出了適用于魚、蝦、蟹、鱉和貝類等各類水產品中甲氨基阿維菌素殘留檢測的液相色譜-串聯質譜法,以期為水產品的質量監控提供有效且簡便的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP5500型四極桿串聯質譜儀,配LC-20AD 型液相色譜儀(二元高壓梯度輸液泵、自動進樣器、柱溫箱);CPA225D 型電子天平(感量0.000 01 g)和JJ 1000 型電子天平(感量0.01 g);Zymark Turbo Vap?LV 型吹氮濃縮儀;SiGMA 3-18K 型低溫高速離心機。

甲氨基阿維菌素標準儲備溶液:100 mg?L－1,準確稱取甲氨基阿維菌素標準物質11.75 mg(稱取標準物質的質量為按純度折算過的質量),用乙腈溶解并定容至100 mL,混勻后于－18 ℃以下保存。

甲氨基阿維菌素標準中間溶液:1.0 mg?L－1,準確移取0.5 mL 甲氨基阿維菌素標準儲備溶液于50 mL容量瓶中,用乙腈稀釋并定容,于－18 ℃以下保存。

甲氨基阿維菌素標準溶液:10μg?L－1,準確移取0.5 mL甲氨基阿維菌素標準中間溶液于50 mL容量瓶中,用乙腈稀釋并定容,現配現用。

甲氨基阿維菌素標準溶液系列:取適量甲氨基阿維菌素標準溶液,用80%(體積分數,下同)乙腈溶液逐級稀釋,配制成質量濃度分別為0,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0μg?L－1的甲氨基阿維菌素標準溶液系列。

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽標準物質的純度為96.87%;乙腈、甲醇、乙酸乙酯均為色譜純;甲酸、正己烷為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Atlantis T3 色譜柱(100 mm×4.6 mm,3μm);柱溫40 ℃;流量0.6 mL?min－1;流動相A為5 mmol?L－1甲酸溶液,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～2.0 min 時,B 由50%升 至100%,保 持1.0 min;3.0～3.1 min時,B 由100%跳轉至50%,保持3.9 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧電離(ESI)源,正離子(ESI＋)掃描模式;多反應監測(MRM)模式;噴霧電壓5 500 V;鞘氣壓力414 kPa,輔助氣壓力414 kPa;離子傳輸管溫度600 ℃,霧化室加熱溫度150 ℃;碰撞氣壓力7.98 Pa;母離子、子離子和碰撞能量見表1。其中,“?”代表定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取樣品5.00 g,置于50 mL 離心管中,加入12.5 mL 乙酸乙酯,渦旋1 min,超聲10 min,振蕩15 min,以轉速4 500 r?min－1離心5 min,收集上清液于25 mL 具塞刻度試管中。殘渣中加入12.5 mL乙酸乙酯,重復提取一次,合并上清液,并用乙酸乙酯定容至25 mL。取0.5 mL 上述溶液于8 mL 吹氮濃縮管中,于45 ℃氮吹至干。殘渣用80%乙腈溶液1 mL溶解,渦旋1 min,超聲5 min,再加入2 mL乙腈飽和正己烷溶液,渦旋30 s,靜置分層。吸取下層溶液于1.5 mL 高速離心管中,以轉速12 000 r?min－1離心5 min。吸取下層清液,過0.22μm 疏水性聚四氟乙烯(PTFE)濾膜,按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

甲氨基阿維菌素的相對分子質量較大且極性較弱,采用反相C18進行分離。以甲醇和乙腈為流動相有機相,水、5 mmol?L－1甲酸溶液和0.1%(體積分數)甲酸溶液為流動相水相進行條件優化,考察了流動相對分離度、峰形及響應值的影響。結果表明,以乙腈和甲酸溶液作為流動相時,甲氨基阿維菌素峰形尖銳,響應高,見圖1。因為甲氨基阿維菌素帶有甲氨基,呈弱堿性仲銨鹽化合物的特性,酸的加入能提高其離子化效率,從而提高靈敏度,同時酸的加入也能夠改善峰形、消除拖尾,但是當甲酸添加量增加到0.1%時,可能離子含量過高與待測物產生競爭關系導致離子化效率降低,且離子化不穩定。因此,試驗選擇不同體積比的5 mmol?L－1甲酸溶液-乙腈的混合液為流動相。

圖1 甲氨基阿維菌素的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of emamectin

2.2 質譜條件的優化

由于甲氨基阿維菌素帶有甲氨基,易失去電子,形成正離子,試驗采用ESI＋模式進行測定。采用蠕動泵以流動注射方式將100μg?L－1的甲氨基阿維菌素標準溶液注入質譜中,在ESI＋模式下,進行一級和二級質譜掃描,并對噴霧電壓、霧化室加熱溫度等質譜參數進行優化。在最優條件下,準分子離子(m/z886.6)碰撞裂解成子離子m/z302.4,126.2,158.2,82.1,58.0,選擇豐度最大的二級碎片離子(m/z158.2)作為定量離子,次強碎片離子(m/z82.1)作為定性離子,甲氨基阿維菌素的二級質譜圖見圖2。

圖2 甲氨基阿維菌素的二級質譜圖Fig.2 Secondary mass spectrum of emamectin

2.3 樣品前處理條件的優化

2.3.1 濾膜

在前處理條件優化過程中發現將標準溶液通過0.22μm 疏水性尼龍66濾膜,待測物有近30%的損失。為了降低濾膜的吸附率,試驗分別考察了濾膜材料和過濾介質對吸附率的影響。結果表明:尼龍66濾膜對甲氨基阿維菌素有較強的吸附作用,無論如何改變過濾介質均有20%以上的吸附率;親水性PTFE濾膜在最優條件下也約有7%的吸附率;而疏水性PTFE濾膜在80%乙腈溶液為過濾介質時,吸附率小于2%,滿足檢測要求。因此,試驗采用80%乙腈溶液作為定容液,并選擇0.22μm 疏水性PTFE濾膜進行過濾。

2.3.2 提取條件

甲氨基阿維菌素屬于弱極性化合物,極易溶于有機溶劑,因此試驗分別選用甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑,考察了不同提取溶劑對鮭魚加標樣品中甲氨基阿維菌素的提取效果。結果表明:乙酸乙酯能夠有效地將待測物從基質中提取出來,提取效率最高,因此選擇乙酸乙酯作為樣品的提取溶劑。試驗發現超聲步驟的加入有利于待測物甲氨基阿維菌素的提取,但是超聲5 min以上時,回收率無明顯的提高,為了保證充分提取,選擇先超聲10 min,再振蕩15 min的提取方式。

2.3.3 凈化方式

由于水產品中脂肪含量較高且甲氨基阿維菌素脂溶性較強,脂肪對其影響較大,因此脫脂凈化步驟至關重要。

試驗考察了中性氧化鋁柱、Captiva EMR-Lipid脫脂柱和混合陽離子交換MCX 柱對樣品的凈化效果,結果發現,采用中性氧化鋁柱和Captiva EMRLipid脫脂柱脫脂時,甲氨基阿維菌素回收率較低。

因此,試驗進一步對比了乙腈飽和正己烷溶液液液萃取法和MCX 固相萃取柱凈化法對不同基質的凈化效果。結果發現:采用乙腈飽和正己烷溶液液液萃取法時,0.5μg?kg－1濃度水平下待測物的回收率為85.0%～100%,選擇離子色譜圖中無雜峰,且乙腈飽和正己烷溶液的使用量對結果無顯著影響,本著節約溶劑的原則,試驗采用2 mL乙腈飽和正己烷溶液;通過優化過柱條件,采用混合陽離子交換MCX 柱時,0.5μg?kg－1濃度水平下待測物的回收率為83.0%～95.0%,選擇離子色譜圖中同樣無雜峰。雖然兩種凈化方式均能達到較好的凈化效果,但是乙腈飽和正己烷溶液液液萃取法操作更簡便,溶劑消耗量少,因此試驗選擇乙腈飽和正己烷溶液液液萃取法進行凈化。

2.4 基質效應

試驗根據UCLéS S等報道的標準曲線法[15]評估方法基質效應(ME),按照ME＝(1－空白基質工作曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率)×100%來計算。當|ME|在20%內時表明基本無基質效應;當|ME|為20%～50%時表明具有弱基質效應,當|ME|大于50%時表明具有強基質效應[16-17]。

結果顯示,提取液不經乙酸乙酯稀釋,僅通過優化流動相和凈化方式無法消除待測物甲氨基阿維菌素的基質效應。因此,在保證靈敏度的情況下,通過樣品稀釋來降低基質效應,5 g樣品不經稀釋直接上機時和稀釋50倍后(相當于0.1 g樣品)上機時的基質效應對比見表2。

表2 5 g樣品與0.1 g樣品的基質效應對比Tab.2 Comparison of matrix effects between 5 g and 0.1 g of samples

結果表明,對于6種不同的基質,稀釋50倍之后基質效應均明顯降低,說明采用樣品稀釋法能有效地消除對甲氨基阿維菌素的基質效應。

2.5 標準曲線和測定下限

按照儀器工作條件測定甲氨基阿維菌素標準溶液系列,以甲氨基阿維菌素的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明,甲氨基阿維菌素的質量濃度在0.01～2.0μg?L－1內與對應的峰面積呈線性關系,線性回歸方程為y＝6.659×104x＋5.085×102,相關系數為0.999 9。

按照10倍信噪比計算測定下限(10S/N),結果為0.5μg?kg－1,參照CAC對甲氨基阿維菌素在自然比例的帶皮魚肌肉中的最大殘留限量100μg?kg－1,本方法的測定下限滿足檢測要求。

2.6 精密度與回收試驗

分別以鮭魚、羅非魚、蝦、蟹、鱉和貝類為研究對象進行加標回收試驗,每個濃度水平做6個平行試驗,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表3可知:在不同基質和不同濃度水平下,甲氨基阿維菌素的回收率為84.3%～99.9%,測定值的RSD 為2.3%～6.6%,均滿足藥物殘留檢測要求,說明方法適用性強,準確度高,重現性好。

2.7 樣品分析

按照試驗方法對進口鮭魚、進口羅非魚及市售的蟹、貝類、鱉、蝦等6類共50個樣品進行測定,結果發現1個進口鮭魚中檢出甲氨基阿維菌素,檢出量為20.7μg?kg－1(見圖3),其余水產品中均未檢出甲氨基阿維菌素。

圖3 鮭魚樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of the salmon sample

本工作提出了液相色譜-串聯質譜法測定水產品中甲氨基阿維菌素殘留量的方法,采用乙腈飽和正己烷溶液液液萃取法處理樣品,樣品稀釋法消除方法基質效應。方法經濟、簡便、高效且準確,能較好滿足水產品中甲氨基阿維菌素的測定要求。