高效液相色譜-串聯質譜法測定進口新冠特效藥中有效成分的含量

麥曉霞,譚智毅,張海峰,張子豪,徐金梅,顏焯文,肖 前,劉瑩峰,鄭建國

(廣州海關技術中心,廣州 510623)

新冠特效組合藥帕羅韋德獲得美國食品藥品監督管理局批準緊急使用授權申請[1],作為治療COVID-19的口服新型特效藥。其后,輝瑞與“藥品專利池”(MPP)達成協議,向95個國家和地區的合格仿制藥企發放仿制授權。2022年2月,國家藥品監督管理局附條件批準帕羅韋德進口注冊,用于成人伴有進展為重癥高風險因素的輕至中度COVID-19患者[1]。根據2019 版?中華人民共和國藥品管理法?規定,國外已上市、國內未獲批的藥品不再被簡單地認為是假藥,雖然仿制藥不能在中國銷售,但較大的需求量仍會促使仿制藥通過各種渠道流入市場。隨著人們對藥品的需求量增大,用藥的安全性和有效性日益受到重視。

帕羅韋德是由兩種藥片組成的復方抗病毒組合藥。其中一片是奈瑪特韋(150 mg),其是一種新冠病毒的3CL主蛋白酶抑制劑,3CL 主蛋白酶是冠狀病毒復制過程中的關鍵蛋白酶,奈瑪特韋通過抑制這種蛋白酶阻止冠狀病毒的復制;另一片是利托那韋(100 mg),為HIV-1 蛋白酶抑制劑和CYP3A4(細胞色素P4503A4酶)抑制劑[2],雖然利托那韋對新冠病毒主蛋白酶無活性,但可以抑制CYP3A4介導的奈瑪特韋代謝,以幫助其在生物體內保持長時間的高濃度水平和活性[3-4]。因此,復方抗病毒藥中奈瑪特韋是主要的活性成分,其實際含量直接關系到患者的生命安全。建立進口新冠特效藥中奈瑪特韋和利托那韋的定量檢測方法對于確保進口新冠藥物質量和保障消費者安全具有重要意義。

目前國內外關于奈瑪特韋和利托那韋的檢測技術報道較少,主要是針對HIV 蛋白酶抑制劑利托那韋的測定,奈瑪特韋的測定報道較少。相關文獻報道了家禽肉類、頭發、血漿等基質中利托那韋的檢測,其主要采用高效液相色譜-串聯質譜法[5-11]、液相色譜法[12-14],但對于市場需求依然較高的新冠特效藥有效成分奈瑪特韋和代謝抑制劑利托那韋的高效液相色譜-質譜法還未見相關報道。本工作提出了高效液相色譜-串聯質譜法測定進口新冠特效藥中奈瑪特韋和利托那韋含量的方法,方法靈敏度高、快速、準確,可用于進口新冠特效藥中奈瑪特韋和利托那韋的批量分析。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 型高效液相色譜儀,Agilent 6410型三重四極桿串聯質譜儀,配電噴霧離子(ESI)源和 Mass Hunter 軟件數據處理系統;AS20500A 型超聲波發生器;Milli-Q 型超純水機。

奈瑪特韋標準儲備溶液:1 000 mg?L－1,準確稱取適量的奈瑪特韋標準物質,用甲醇溶解并定容,配制成質量濃度為1 000 mg?L－1的奈瑪特韋標準儲備溶液。同法制備利托那韋標準儲備溶液。

混合標準溶液:1.0 mg?L－1,分別移取奈瑪特韋標準儲備溶液和利托那韋標準儲備溶液各100μL置于同一100 mL 容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成質量濃度為1.0 mg?L－1的混合標準溶液。

混合標準溶液系列:移取適量的混合標準溶液,用水逐級稀釋,配制成質量濃度分別為2,5,10,20,50,100,200μg?L－1的混合標準溶液系列。

奈瑪特韋標準物質的純度為96.6%,利托那韋標準物質的純度為99.5%;甲醇為色譜純;三氯乙酸為分析純;試驗用水為超純水。

樣品來自入境口岸旅客私藏藥物,規格:3×10粒裝雙組分口服復合制劑。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫35 ℃;進樣體積5μL;流量0.2 mL?min－1;流動相A 為0.1%(體積分數,下同)三氯乙酸溶液,B 為甲醇;梯度洗脫程序:0～1 min時,B為40%;1～2 min 時,B 由40%升至90%,保 持5 min;7～8 min 時,B 由90%降 至40%,保持6 min。

1.2.2 質譜條件

ESI源,正離子(ESI＋)模式;多反應監測(MRM)模式;干燥氣溫度350 ℃;氮氣流量7 L?min－1;霧化器壓力310 kPa,毛細管電壓3 800 V;駐留時間100 ms。

其他質譜參數見表1,其中“?”代表定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

取一顆藥片樣品,稱量,記錄質量(約0.6 g,精確至0.001 g),研磨粉碎均勻后將樣品置于20 mL螺口旋蓋玻璃瓶中,加入15 mL 50%(體積分數,下同)甲醇溶液,常溫下超聲溶解20 min,并轉移至25 mL容量瓶內,用50%甲醇溶液多次洗滌螺口旋蓋玻璃瓶壁,定容。移取上述溶液10 mL至15 mL塑料離心管中,以轉速6 000 r?min－1離心3 min,取上層澄清溶液100μL,轉移至100 mL容量瓶中,用50%甲醇溶液定容,過有機微孔濾膜,按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

試驗分別采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-含0.1%(體積分數,下同)甲酸的5 mmol?L－1甲酸銨溶液和甲醇-0.1%三氯乙酸溶液作為流動相體系,對20μg?L－1的混合標準溶液進行測定。結果表明:目標物在乙腈-水體系中響應較弱且色譜峰有拖尾現象,在甲醇-水體系中的響應比在乙腈-水體系中的稍強,但峰形仍然有拖尾或前伸,這可能是目標物離子和色譜柱的硅羥基之間存在弱的相互作用導致。在水相中添加緩沖鹽或酸性改性劑可有效地改善峰形,甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol?L－1甲酸銨溶液體系能較好改善峰形,而甲醇-0.1%三氯乙酸溶液體系不僅改善了峰形,且目標物響應較高。因此,試驗選擇甲醇-0.1%三氯乙酸溶液體系作為流動相。

2.2 檢測器與質譜條件的選擇

在相同的色譜條件下,分別采用二極管陣列檢測器和質譜檢測器對1.0 mg?L－1混合標準溶液進行測定。使用二極管陣列檢測器在190～400 nm內對1.0 mg?L－1混合標準溶液進行掃描,兩種目標物奈瑪特韋和利托那韋的紫外吸收光譜均在210 nm 左右有最大吸收;但標準物質和樣品均在205 nm 和225 nm 存在較大的干擾,使基線增高,色譜峰也較多,影響準確定量;ESI＋模式下質譜干擾相對較少,色譜峰明顯,因此選擇質譜檢測器進行檢測。

用1.0 mg?L－1(相當于10 ng)混合標準溶液進行測試,在ESI＋模式下以不同傳輸電壓進行一級質譜掃描。結果表明:奈瑪特韋和利托那韋最強峰的準分子離子峰為[M＋H]＋,如奈瑪特韋正離子[C23H33F3N5O2]＋對應的m/z為500.4,利托那韋正離子[C37H49N6O5S2]＋對應的m/z為721.4;奈瑪特韋和利托那韋還易于形成[M＋Na]＋和[M＋K]＋的準分子離子峰,如圖1(a)和圖1(c),對應m/z分別為522.4,538.4 和743.4,759.4。分別以0～60 e V 的碰撞能量對[M＋H]＋準分子離子進行子離子模式掃描,得到子離子信息和子離子對應的碰撞能量。奈瑪特韋分子離子可能易于形成通過酰胺鍵C－N 或相鄰C－C鍵斷裂重排形成的系列子離子,如[C15H22F3N2O2]＋、[C19H31N4O2]＋和[C18H27F3N3O3]＋等離子片段,對應的m/z為319.3,347.4和390.3,見圖1(b)。利托那韋也是易于斷裂酰胺鍵C－N 或相鄰C－C 鍵形成重排子離子,如[C13H21N3OS]＋、[C14H21N3O2S]＋和[C23H27N3O3S]＋等離子片段,對應的m/z為268.1,296.1和426.0,見圖1(d)。選取響應最大、干擾較少和確定結構的碎片子離子作為定量、定性離子。為得到較好的靈敏度,分別對子離子、碎裂電壓、碰撞能量等參數進行優化。奈瑪特韋和利托那韋優化后的參數和MRM 色譜圖見表1和圖2。

圖1 奈瑪特韋和利托那韋的準分子離子和子離子分布質譜圖Fig.1 Precursor ion and daughter ion distribution mass spectra of nirmatrelvir and ritonavir

圖2 奈瑪特韋和利托那韋的MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of nirmatrelvir and ritonavir

2.3 工作曲線和測定下限

配制含有藥物填料基質的2,5,10,20,50,100,200μg?L－1的混合標準溶液系列,按照儀器工作條件進行測定。以目標物的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。結果表明,奈瑪特韋和利托那韋的質量濃度在2～200μg?L－1內與對應的峰面積呈線性關系,所得的線性回歸方程和相關系數見表2。

表2 線性參數和測定下限Tab.2 Linearity parameters and lower limits of determination

以10倍信噪比(S/N)計算測定下限(10S/N),結果見表2。

2.4 精密度與回收試驗

取空白藥物樣品,加入50%甲醇溶液使樣品完全浸泡,定量添加混合標準溶液,使加標水平分別為10,50,200μg?L－1,每個加標水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表3可知,奈瑪特韋和利托那韋的回收率為92.5%～115%,測定值的RSD 均小于8.0%。

2.5 樣品分析

按照試驗方法對通過口岸進口的30批新冠特效藥品進行檢測,結果表明,9個樣品中檢出奈瑪特韋和利托那韋有效成分,1個樣品中均未檢出以上兩種成分,值得關注的是其他20個樣品中只檢出利托那韋,未檢出奈瑪特韋。在若干已檢出陽性樣品和未檢出奈瑪特韋的樣品中,通過對樣品溶液全掃描檢出了其他成分,其中出現最多的為奧司他韋,圖3(a)為測定某進口新冠藥物樣品復合制劑A 藥片中奈瑪特韋和利托那韋的MRM 色譜圖,圖3(b)為某進口新冠藥物樣品復合制劑A 藥片的全掃描色譜圖,檢出主要成分為奧司他韋,未檢出奈瑪特韋。

圖3 某新冠特效藥品的MRM 色譜圖、全掃描色譜圖和質譜圖Fig.3 MRM chromatogram,full-scan chromatogram and mass spectra of a novel coronavirus specific drug

圖3(c)和(d)為樣品中奧司他韋的質譜圖和子離子質譜圖,從子離子片段可知樣品的主要色譜峰成分為奧司他韋,其中12個典型藥物樣品的測定結果見表4。

表4 12個典型藥物樣品的測定結果Tab.4 Determination results of 12 typical drug samples

本工作提出了高效液相色譜-串聯質譜法測定進口新冠特效藥中有效成分奈瑪特韋及利托那韋含量的方法。該方法具有操作簡便、靈敏度高、精密度及準確度好的特點,能滿足進口新冠藥物中奈瑪特韋和利托那韋有效成分的批量測定要求。