超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定抗(抑)菌類消毒產品中苯海拉明和利多卡因的含量

林守二 ,邱文倩 ,陳佳麗 ,林 堅 ,華永有 ,楊 艷?

(1.福建省疾病預防控制中心 福建省人獸共患病研究重點實驗室,福州 350001;2.福建醫科大學 公共衛生學院,福州 350004)

隨著經濟的發展和人們生活水平的不斷提高,消毒產品品種和需求量日益增加。常見的消毒產品主要包括消毒劑、消毒器械、衛生用品和抗(抑)菌類產品等[1],其中抗(抑)菌產品在實際生活中應用越來越廣泛。市售抗(抑)菌類消毒產品主要為含不同提取原料的霜膏等[2],用于治療或緩解各類感染引起的不適。為了增強療效與追求更高利益,不法商家可能非法添加抗生素、抗病毒藥物、激素等[3-4],嚴重危害人類健康。我國現行消毒產品評審注冊機制為安全評價備案,產品質量主要依靠市場監管保證。但是,目前尚缺乏抗(抑)菌類產品中各類違禁添加藥物的全套檢測方法的相關標準。為出臺對應標準,方便監管部門監督抽檢,維護消費者健康和權益,有必要建立抗(抑)菌類產品中各類違禁添加藥物的檢測方法。

苯海拉明與利多卡因是抗(抑)菌類產品中常見的違禁添加藥物。苯海拉明是毒蕈堿乙酰膽堿受體的有效競爭性拮抗劑,是使用最廣泛且使用時間最長的抗組胺藥之一[5],具有抗過敏、鎮靜、消炎、止癢、消腫等作用[6],濫用易導致心臟毒性、中樞神經抑制、頭暈、散瞳、過敏性休克等癥狀[7-8]。利多卡因是一種酰胺類麻醉藥,在臨床上被廣泛用于局部麻醉和心律失常治療,同時其還具有抗炎、抗菌、鎮痛、抗腫瘤等作用[9]。藥理研究結果表明,利多卡因可通過調節細胞內外離子濃度水平而改變跨膜電位和參與細胞信號轉導過程[10]。過量使用利多卡因易引發高鐵血紅蛋白癥、紅斑、蕁麻疹、皮炎,甚至紫癜等嚴重不良反應[11-12]。我國衛生部發布的?消毒產品生產企業衛生規范?明確指出,消毒產品禁止使用抗生素藥物、抗真菌藥物、激素等[13],但目前關于消毒產品中苯海拉明和利多卡因的測定方法尚未見報道。

消毒產品基質復雜,測定干擾大,建立一種高效、靈敏的檢測方法至關重要。測定消毒產品中藥物含量的常見方法有毛細管電泳法[14]、氣相色譜法[15]、液相色譜法[16]和液相色譜-質譜聯用法[17]等,其中超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLCMS/MS)具有靈敏度高、抗干擾能力強、快速、準確等優點,已用于復雜基質的人體樣本中苯海拉明和利多卡因含量的測定[18-19]。本工作以市售84份抗(抑)菌類消毒產品為待測樣品,通過優化前處理條件和儀器工作條件,采用UHPLC-MS/MS 同時測定抗(抑)菌類消毒產品中苯海拉明和利多卡因的含量,以期為消毒產品中違禁添加藥物苯海拉明和利多卡因檢測標準的制定提供方法參考,為規范消毒產品市場提供數據基礎。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀,包括Waters Iclass型超高壓液相色譜系統和XEVO TQXS型質譜系統;Heidolph Multi Reax型自動旋渦混合器;Beckman Coulter Allegra X-30型離心機;SECURA125-1CN 型電子天平;Milli-Q 型超純水機。

單標準儲備溶液:100 mg?L－1,分別取適量苯海拉明、苯海拉明-d3、利多卡因和利多卡因-d10標準品,用甲醇溶解、稀釋,搖勻備用。

單標準中間液:10.0 mg?L－1,取單標準儲備溶液各1.00 mL,用甲醇稀釋至10.0 mL,搖勻備用。

混合標準使用液:1.00 mg?L－1,取苯海拉明和利多卡因標準中間液各1.00 mL,用甲醇稀釋至10.0 mL,于4 ℃冰箱中保存。使用時用甲醇稀釋至所需的質量濃度。

混合內標使用液:1.00 mg?L－1,取苯海拉明-d3和利多卡因-d10標準中間液各1.00 mL,用甲醇稀釋至10.0 mL,于4 ℃冰箱中保存。

混合標準溶液系列:取適量苯海拉明和利多卡因的混合標準使用液,用甲醇逐級稀釋,各加入混合內標使用液10.0μL,配制成含10.0μg?L－1內標的0.50,1.00,2.00,5.00,10.0,20.0,40.0μg?L－1混合標準溶液系列。

苯海拉明、苯海拉明-d3、利多卡因和利多卡因-d10標準品的純度均不小于98%;甲酸、甲醇、乙腈和正己烷為色譜純;甲酸銨為優級純;氯化鈉為分析純;試驗用水為超純水。

抗(抑)菌類消毒產品購于福州市各大藥店,主要包括不同品牌的抑菌膏、抗菌膏、濕疹膏等,共84份,標記為樣品1～84。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫30 ℃;流量0.25 mL?min－1;進樣量2μL;流動相A 為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～5.0 min 時,B 由10%上升至95%,保持1.5 min;6.5～7.0 min時,B由95%下降至10%,保持1.0 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)模式;離子源溫度150 ℃;毛細管電壓2.5 kV;脫溶劑氣溫度500 ℃,流量1 000 L?h－1;多反應監測(MRM)模式;苯海拉明、苯海拉明-d3、利多卡因和利多卡因-d10的定性離子對、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量等質譜參數見表1,其中“?”為定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS Parameters

1.3 試驗方法

取抗(抑)菌類消毒產品樣品0.200 g(精確至1 mg)于15 mL 離心管中,加入混合內標使用液100μL,渦旋混勻后靜置30 min,用70%(體積分數,下同)乙腈溶液定容至5.00 mL。渦旋混合2 min,加入乙腈飽和的正己烷溶液1.0 mL 和氯化鈉飽和溶液1.0 mL,超聲提取20 min,渦旋15 min,于－20 ℃冰箱放置1 h。棄去上層正己烷相,取中間層相,加入等體積水稀釋,以轉速12 000 r?min－1離心5 min。取上清液過0.22μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 提取劑的優化

分別在水性和油性基質空白樣品中加入混合標準使用液,使加標量達到10.0μg?L－1,按照試驗方法測定,考察了提取劑分別為乙腈、50%(體積分數,下同)乙腈溶液、70%乙腈溶液時對目標組分響應信號的影響,結果如圖1所示。

圖1 提取劑對不同基質樣品中目標組分響應信號的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on the response signal of target components in samples with different matrices

由圖1可知:采用70%乙腈溶液提取時,不同基質樣品中的目標組分的響應信號均最高;采用50%乙腈溶液提取時,濾膜過濾阻力較大。因此,試驗選擇70%乙腈溶液作為提取劑,并加入乙腈飽和的正己烷溶液助溶。

2.2 凈化條件的優化

分別在水性和油性基質空白樣品中加入混合標準使用液,使加標量達到10.0μg?L－1,按照試驗方法測定,考察了不加凈化劑以及分別采用氯化鈉飽和溶液、2 mmol?L－1硫酸鋅溶液和C18凈化(標記為凈化條件1?！?＃)時對目標組分回收率的影響,結果如圖2所示。

圖2 凈化條件對不同基質樣品中目標組分回收率的影響Fig.2 Effect of purification condition on the recovery of target components in samples with different matrices

由圖2可知:對于水性基質樣品,不同凈化條件對利多卡因回收率的影響不大,以氯化鈉飽和溶液凈化時苯海拉明的回收率較大,推測氯化鈉能夠更好地促使水相中的目標組分進入有機相,但回收率較低(小于60.0%),需要采用內標法校正;對于油性基質樣品,不凈化或采用鹽溶液凈化所得目標組分的回收率均大于85.0%,采用C18凈化時目標組分的回收率急劇下降,苯海拉明的回收率甚至降至10.0%以下,可能是C18在油性基質中更容易吸附目標組分。因此,試驗選擇采用氯化鈉飽和溶液凈化提取液。

2.3 流動相的優化

目標組分苯海拉明和利多卡因的最優電離模式均為ESI＋,在水相中加入0.1%甲酸有助于提高其離子化效率,增大其響應信號。試驗還發現,相較于乙腈,以甲醇作為流動相時,目標組分的峰形更佳,因此試驗選擇的流動相為0.1%甲酸溶液-甲醇體系。

在最優儀器工作條件下,混合標準溶液、陰性樣品溶液和陽性樣品(59＃、20＃)溶液中目標組分及其內標的MRM 色譜圖見圖3。

圖3 苯海拉明、利多卡因及其內標的MRM 色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of diphenhydramine,lidocaine and their internals

由圖3可知:在混合標準溶液的色譜圖中,兩種目標組分達到完全分離,且峰形對稱、響應較好,目標組分與各自內標的保留時間一致;陰性樣品溶液的色譜圖中未見明顯色譜峰,且目標組分出峰位置附近無明顯干擾;陽性樣品溶液色譜中各目標組分的保留時間與混合標準溶液中的一一對應,說明分析過程較為穩定。

2.4 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以兩種目標組分的質量濃度為橫坐標,目標組分和內標定量離子峰面積的比值為縱坐標進行線性回歸。結果顯示:苯海拉明和利多卡因的質量濃度均在0.50～40.0μg?L－1內與對應的目標組分和內標峰面積比值呈線性關系,線性回歸方程分別為y＝1.806×10－1x－9.295×10－3和y＝2.379×10－1x－9.736×10－3,相關系數分別為0.999 5 和0.999 2。

以3,10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果顯示,苯海拉明和利多卡因的檢出限分別為8.12,3.27μg?kg－1,測定下限分別為24.4,9.81μg?kg－1。

2.5 精密度和回收試驗

按照試驗方法處理加標陰性樣品(加標量10.0μg?L－1),分別于同一天和連續3 天進樣6次,計算峰面積比值的相對標準偏差(RSD)。結果顯示,兩種目標組分峰面積比值的RSD 分別小于3.2%(日內)和小于5.3%(日間),說明該方法的日內和日間精密度良好。

分別選取水性、油性基質的陰性樣品作為待測對象,按照試驗方法進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的RSD,結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2 可知:苯海拉明的回收率為96.2%～105%,利多卡因的回收率為88.5%～102%,苯海拉明的回收效果相對較好;水性、油性基質樣品中兩種目標組分的回收率分別為88.5%～99.5%和93.0%～105%,說明內標法顯著提高了苯海拉明的回收效果,基質對于目標組分測定的影響較大,水性基質樣品中兩種目標組分的回收率低于油性基質樣品中的;測定的RSD 為0.60%～3.5%,說明方法的精密度良好。

2.6 穩定性試驗

制備加標水性和油性基質陰性樣品溶液(加標量10.0μg?L－1),分別放置0,2,4,6,8,10,12,24,48 h后按照儀器工作條件測定,結果顯示,放置不同時間后,不同基質樣品中兩種目標組分測定值的RSD 均小于6.2%,表明樣品溶液在48 h內穩定性良好。

2.7 樣品分析

按照試驗方法分析84份市售抗(抑)菌類消毒產品樣品,結果顯示:各組分的保留時間與標準品的偏差的絕對值在2.5%以內,離子豐度比偏差的絕對值不超過歐盟2002/657/EC規定的允差范圍,說明檢測結果不是假陽性;在3份樣品中檢出了苯海拉明,測定值為9.10×103～2.86×106μg?kg－1,在1份樣品中檢出了利多卡因,測定值為117μg?kg－1,總檢出率為4.76%,具體檢出情況見熱圖(圖4)。其中,綠色代表未檢出,紅色代表檢出;紅色深淺代表測定值大小,越淺代表測定值越小,越深代表測定值越大。

圖4 樣品檢出情況熱圖Fig.4 Heat map of sample detection

由圖4可知:苯海拉明和利多卡因是在4個不同樣品中檢出的,其中一份樣品中苯海拉明測定值較高,達到106μg?kg－1級別,說明需要對市售消毒產品進行有效監督監測。

本工作以70%乙腈溶液作為提取劑,氯化鈉飽和溶液進行凈化,UHPLC-MS/MS 同時測定抗(抑)菌類消毒產品中苯海拉明和利多卡因的含量,具有一定的應用推廣價值。