近紅外光譜模型快速無損測定肉中糖的含量

李春燕 ,葉利明 ,薛金濤2,?

(1.新鄉醫學院三全學院 生物與基礎醫學實驗教學中心,新鄉 453003;2.新鄉醫學院 藥學院,新鄉 453002;3.四川大學 華西藥學院,成都 610041)

糖含量的高低是影響肉類和肉制品營養品質和口感風味的重要指標,高效快速的測定糖含量可為肉和肉制品的質量控制提供良好的技術支撐和參考依據。傳統的糖含量分析方法一般采用試劑盒或按照國家標準GB/T 9695.31－2008?肉制品:總糖含量測定?中紫外分光光度法或滴定法測定,但傳統方法需要對肉類和肉制品進行破壞性檢測,整個分析操作過程費時費力,亟需開發一種快速、無損和簡便的分析方法測定肉類組織中糖的含量。

近紅外光譜是William Herschel在19世紀發現的,近紅外光譜技術作為一種分析手段是從20世紀50年代開始的,并在20世紀80年代以后逐漸成為當今發展較快、較引人注目的光譜分析技術,在石油、化工、農業、食品工業、紡織工業、制藥工業和臨床醫學等領域得到廣泛的研究和應用。按照美國材料與試驗協會(ASTM)的定義,近紅外光譜區是指波數 在4 000～12 000 cm－1(即波長780～2 526 nm)的光譜范圍。近紅外光譜中主要的吸收峰是分子內部含氫基團的倍頻與合頻的綜合吸收信息,其幾乎包括化合物中所有含氫基團(如C－H、O－H、N－H 和S－H 等)的信息。近紅外光譜中每個基團的吸光度與對應待測物含量之間的定量關系符合比爾-朗伯(Beer-Lambert)定律,但由于近紅外吸收峰高度疊加,且這些含氫基團的消光系數弱,另外樣品中通常為含有多種成分的復雜樣品,這就使近紅外光譜中譜峰吸收弱和重疊嚴重,故近紅外光譜無法通過吸收峰歸屬進行定性分析和簡單通過單個或幾個波長進行常規的含量測定。采用化學計量學方法,從近紅外光譜中提取有用的弱信息和多元信息并建立數學模型,解決了近紅外光譜區重疊和吸收峰弱的問題,極大地擴展了近紅外光譜技術的應用范圍[1-6]。此外,由于近紅外光具有很好的穿透性,故近紅外光譜法無需樣品前處理,即可直接對液體、固體、顆粒狀、糊狀等不同形態的樣品進行分析,具有無損測定、分析快速、可同時分析多組分測定值和不消耗化學試劑(綠色環保)等特點;另外光纖技術的應用使近紅外光譜技術可以更方便的應用于在線快速分析,尤其是實現了一臺儀器可以對不同位置的多個質量控制點進行監測,以及對復雜和危險環境中的樣品實時快速分析。在藥品定性監測和定量分析,及藥品生產和質量控制過程中各個環節的監控中近紅外光譜具有廣泛的應用[1-10]。

近年來國內外學者采用近紅外光譜法對山藥[5]、金銀花[6-7]、芝麻[8]和黃芩[9]等進行了快速無損分析。在生物組織樣品中近紅外具有良好的穿透性[10-11],當前已有研究采用近紅外光譜法對花生中糖含量[12]、牡蠣凍干組織中糖原含量[13]和血糖濃度[14]等進行快速分析測定。由于制備不同糖含量的肉組織(牛、羊或豬等)和動物模型成本較高,且試驗難度大,因此本工作采用經典的糖尿病模型大鼠的肉組織進行研究,旨在建立一種快速無損的近紅外光譜分析模型用于肉類中糖含量的分析測定,可為肉類品質的鑒定和質量控制提供方法依據和技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

MATRIX-F 型傅里葉變換近紅外光譜儀,配PbS檢測器、光纖傳輸檢測探頭、OPUS 7.0光譜采集和處理軟件;BS-124S型電子天平(感量0.1 mg);BT-25S型電子天平(感量0.01 mg);7020型全自動生化分析儀。

0.1mol?L－1枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 4.2～4.5):精密稱取枸櫞酸約2.1 g,加入100 mL水,為A 液;另精密稱取枸櫞酸鈉約2.9 g,加入100 mL水,為B 液;將A 液和B 液按體積比1∶1混合均勻,用A 液或B液調節酸度為pH 4.2～4.5,于4 ℃放置備用。

1%(質量分數,下同)鏈脲佐菌素溶液:取適量的鏈脲佐菌素,以0.1 mol?L－1枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 4.2～4.5)為介質進行配制。另外,由于鏈脲佐菌素在溶液中不穩定,建議現配現用,配制好的溶液在給藥前經針式濾器濾菌,并在30 min 內用完。

健康雄性SD(Sprague Dawley,斯潑累格?多雷)大鼠,SPF(Specific Pathogen Free,無特定病原體動物)級,由四川大學試驗動物中心提供(許可證號:SCXK(川)-09-2006);大鼠飼料由四川大學試驗動物中心提供;鏈脲佐菌素,批號B64927;葡萄糖測定試劑盒,己糖激酶(Hexokinase Method,HK)法;其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 造模與分組

由于食用的肉組織來自牛、羊和豬等,但這些動物模型不易制備,試驗成本較高,因此試驗采用大鼠模型進行研究。所有大鼠適應性飼養一周,飼養期間,專人分籠喂養,自由飲水和進食,自然晝夜光線照明,室內安靜、通風良好,飲用水為自來水。適應性飼養一周后,大鼠隨機分為正常組(n＝12)、低糖組(n＝12)和高糖組(n＝36)。高糖組造模前將大鼠禁食過夜,自由飲水,按40 mg?kg－1腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液[15-21],建模后自由攝食;正常組給予足夠的飼料和飲水;低糖組飼料減半,之后每周適當再減量,自由飲水。4周后采集肉類組織,組織樣品用生理鹽水洗凈,濾紙吸干,采集近紅外光譜后精密稱定,按比例加入生理鹽水,手動勻漿。組織勻漿液以轉速3 000 r?min－1離心10 min,取上清液測定糖含量。

1.2.2 近紅外光譜采集與建模

近紅外光譜圖的采集采用OPUS 7.0軟件。在光譜掃描前,儀器自動基線校正,光譜采集參數:光譜范圍12 000～4 000 cm－1,掃描次數32次,分辨率8 cm－1,每份樣品采集2個近紅外光譜圖。將樣品按糖含量排序,首先將最低糖和最高糖濃度水平的各兩組樣品光譜納入建模集,剩余的再按照4∶1的比例分為建模集和驗證集。在近紅外光譜模型中,建模集用于建模參數(光譜預處理方法、光譜區間和建模維數)的篩選和優化,驗證集用于驗證和評價所建模型的優劣。

近紅外光譜模型建立過程中采用留一交叉驗證法進行模型驗算。首先在建模集中選取1個光譜,然后用建模集中其他光譜進行模型驗算,驗算完成后用選取的光譜對初步建立的近紅外光譜模型進行評價;之后選取下一個光譜,再次進行模型驗算和評價,直至建模集中所有光譜完成模型驗算和評價。近紅外光譜的建模采用OPUS 7.0軟件,基于偏最小二乘算法,分別對各建模參數進行篩選和優化,最后驗證和評價,建立最優近紅外光譜模型。

1.2.3 模型驗證中參考值的確定

樣品中糖含量按照HK 法,采用葡萄糖測定試劑盒在全自動化分析儀上測定,其測定值作為近紅外光譜模型驗證的參考值。

2 結果與討論

2.1 光譜分組

由于大鼠自然死亡4 只(低糖組1 只,高糖組3只),共獲得56只大鼠肉組織的112個近紅外光譜(見圖1)。

圖1 肉樣品的近紅外光譜圖Fig.1 Near infrared spectra of meat samples

為保證近紅外光譜模型的穩健性和適用性,將最低糖濃度水平和最高糖濃度水平的樣品光譜納入建模集,其余樣品按照糖含量大小排序分組,最后建模集中有91個近紅外光譜,樣品中糖的質量分數為(2.712±0.414)mg?g－1;驗證集有21個近紅外光譜,樣品中糖的質量分數為(2.743±0.272)mg?g－1。

2.2 光譜預處理方法的篩選

如圖1所示,近紅外光譜吸收峰重疊嚴重,且樣品中含有的多種成分相互干擾。為提取有效建模信息,排除背景干擾,需對初始光譜進行預處理。試驗篩選了10種常見的光譜預處理方法:矢量歸一化(VN)、多元散射校正(MSC)、最小最大歸一化、減去一條直線(SLS)、消除常數偏移量(COE)、一階導數(1stD)、一階導數＋減去一條直線(1stD＋SLS)、一階導數＋矢量歸一化(1stD＋VN)、一階導數＋多元散射校正(1stD＋MSC)和二階導數。

光譜預處理方法、光譜區間和建模維數的評價指標有建模集和驗證集的相關系數(r)、殘留預測偏差(RPD)、交叉驗證均方差(RMSECV)和預測驗證均方差(RMSEP),其中最優化的近紅外光譜模型應具有較大的r和RPD、較小的RMSECV 和RMSEP。如表1所示,通過比較各模型評價指標,最佳近紅外光譜預處理方法為VN。如圖2所示,VN 處理后光譜更平滑,降低了背景干擾,能夠更有效地提取建模信息。

表1 光譜預處理方法的建模結果Tab.1 Model results of spectral pre-treatment methods

圖2 未預處理和VN 預處理的近紅外光譜Fig.2 Near infrared spectra by no pre-treatment and VN pre-treatment

2.3 建模光譜區間的篩選

為選擇最佳建模近紅外光譜區間,結合圖1和圖2將近紅外光譜按照吸收峰波數分為5個光譜區間:光譜區A 9 403～11 995 cm－1、光譜區B 7 502～9 403 cm－1、光譜區C 6 098～7 502 cm－1、光譜區D 4 597～6 098 cm－1和光譜區E 4 246～4 597 cm－1。各近紅外光譜區間及不同光譜組合區間的建模結果見表2。

表2 近紅外光譜區間的建模結果Tab.2 Model results of the near infrared spectral range

由表2可知,綜合各項模型評價指標(r、RPD、RMSECV 和RMSEP),對各光譜區間的建模結果進行評價,其中光譜區間D 建模效果最佳,B 和C次之,A 和E 較差;接下來依次比較了上述光譜區間的不同光譜組合區間,逐步篩選比較,最終確定最佳建模光譜區間為4 246～9 403 cm－1。

2.4 建模維數的篩選

構建最優化的近紅外光譜模型需要選擇合適的建模維數(潛變量)。以建模集的r和RMSECV 為參考指標,對比了不同建模維數的建模表現,見圖3。

圖3 建模維數對RMSECV 和r 的影響Fig.3 Effect of latent variable on RMSECV and r

由圖3可知:在建模維數逐漸增大到17的過程中,逐步積累建模光譜信息,模型擬合性變好(RMSECV逐漸變小,r逐漸變大);當建模維數超過17后,RMSECV 和r都趨于穩定,此時如選擇過大的建模維數,容易將無效建模光譜信息和噪聲引入模型中,引起近紅外光譜模型的過擬合,影響模型的預測能力和穩健性?；诖?試驗中近紅外光譜模型的最佳建模維數選擇17。

2.5 模型驗證與評價

通過對光譜預處理方法、光譜區間和建模維數進行比較篩選,建立了最優化的近紅外光譜模型,其建模集和驗證集的r和RPD 分別依次為0.990 3和0.975 6、7.23和4.54,RMSECV 為0.057 0,RMSEP為0.061 4。將模型驗證集光譜帶入近紅外光譜模型中,并以參考值為橫坐標,近紅外光譜模型預測值為縱坐標,進行回歸運算,得到標準曲線的線性回歸方程為y＝0.933 0x＋0.202 9,R2＝0.951 7,如圖4所示。

圖4 近紅外光譜模型的驗證結果Fig.4 Validation results for the near infrared spectra model

由圖4可知,近紅外光譜模型的分析預測結果與參考值的線性關系良好,因此近紅外光譜模型的分析預測結果的準確度良好,可以快速無損地實現肉類組織中糖含量的測定,具有較好的應用價值。

本工作建立了一種快速無損的近紅外光譜分析模型,用于肉中糖含量的測定。通過對光譜預處理方法、光譜區間和建模維數進行篩選優化,建立了肉組織糖含量的近紅外光譜模型,并進行驗證分析。本工作建立的近紅外光譜模型可以快速無損地實現肉類組織中糖含量的測定,為肉類品質的鑒定和質量控制提供了高效的方法,具有重要的應用價值和參考意義。