超高效液相色譜-串聯質譜法測定小鼠紋狀體中多巴胺及其代謝物的含量

梁金良 ,陳曉彤 ,胡坤華

(1.中山大學附屬第三醫院 廣東省肝臟疾病研究重點實驗室,廣州 510630;2.中山大學 中山醫學院 蛋白質組學研究中心,廣州 510080)

帕金森病(PD)作為世界上第二大神經退行性疾病[1],有大量研究表明該疾病與年齡呈正相關[2-5],影響了約1%的60 歲以上成年人[6]。隨著人口平均年齡的增加,該疾病的患病率預計會持續上升。PD 患者常常表現出的癥狀有運動遲緩、靜止性震顫、強直和姿勢不穩等。自20世紀50年代發現多巴胺(DA)作為神經遞質以來[7],PD 研究產生了豐富而復雜的知識體系。大腦黑質紋狀體系統多巴胺能神經元能夠產生大量DA 來調控其他腦區神經元,當多巴胺能神經元異常,DA 釋放量會顯著下降,這是導致PD 的直接原因[8-10]。目前PD 的治療主要為DA 的替代藥物或以深部腦刺激(DBS)或神經消融的形式進行手術[11-12]。然而,這些治療是對癥的,不能阻止PD 進展,并且可能與顯著的副作用有關。因此,有必要對PD 的深層機制及臨床治療手段進行探索。

DA 作為重要的單胺類神經遞質[13],亦是其他神經遞質的前體[14-15],是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺。DA 及其代謝物高原兒茶酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)的含量測定對PD 的研究與診斷具有重要的指導意義。然而,對生物樣品中神經遞質及其代謝物的定量分析仍面臨許多挑戰[16-18],如復雜的基質,化學性質不穩定以及濃度水平低等。目前對于神經遞質常見的檢測手段有高效液相色譜法聯合紫外檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器[19-21]以及液相色譜-質譜聯用法[22-23]等,前幾種方法存在靈敏度低、重復性差、樣品需要衍生化及萃取富集等缺點,液相色譜-質譜聯用法具有操作便捷、靈敏度高、進樣量少等優點。因此,本工作采用超高效液相色譜-串聯質譜法快速、靈敏、同時測定小鼠紋狀體組織中多巴胺及其兩種代謝物的含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Vanquish型超高效液相色譜儀;TSQ Quantis型三重四極桿串聯質譜儀;5427R 型高速冷凍離心機;Vortex-Genie2型旋渦混合器;KZ-III型高通量組織研磨儀;Milli-Q 型純水機;TLE204 型電子天平。

單標準儲備溶液:精密稱取DA、DOPAC 和HVA 10.0 mg,用含0.1%(體積分數,下同)乙酸的甲醇溶液溶解并稀釋至10 mL 容量瓶中,搖勻,配制成質量濃度為1 g?L－1的單標準儲備溶液,置于－20 ℃保存備用。同法制備1 g?L－1的異丙腎上腺素內標(IS)儲備溶液。

混合標準儲備溶液系列:取適量的單標準儲備溶液,置于同一容量瓶中,混勻,用含0.1%乙酸的甲醇溶液定容,配制成DOPAC 質量濃度分別為10,20,100,200,1 000,2 000,10 000,20 000μg?L－1,HVA 質量濃度分別為5,10,50,100,500,1 000,5 000,10 000μg?L－1,DA 質量濃度分別為1,2,10,20,100,200,1 000,2 000μg?L－1的混合標準儲備溶液系列。

IS溶液:取適量的異丙腎上腺素標準儲備溶液,用含0.1%乙酸-甲醇溶液稀釋,配制成質量濃度為40μg?L－1的IS溶液。

鹽酸多巴胺、DOPAC、HVA 的批號分別為BCBR4608V、BCBL7919V、BCCD8758;鹽酸異丙腎上腺素的批號為1116D021。

甲酸、乙酸、甲醇、乙腈均為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Gemini NX-C18色譜柱(150 mm×2 mm,3μm);柱溫35 ℃;進樣量5μL;流量0.3 mL?min－1;流動相A 為0.1%乙酸溶液,B為含0.1%乙酸的甲醇溶液。梯度洗脫程序:0～0.5 min時,B為2%;0.5～3.5 min 時,B 由2%升至98%,保持1.5 min;5.0～5.1 min時,B 由98%跳轉至2%,保持1.9 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)、負離子(ESI－)模式;正離子噴霧電壓3 500 V,負離子噴霧電壓3 000 V;離子傳輸管溫度300 ℃,氣化室溫度300 ℃;鞘氣氮氣,流量4.09 L?min－1;輔助氣氮氣,流量5.08 L?min－1;碰撞氣為氬氣;掃描方式為選擇反應監測(SRM)模式。其他質譜參數見表1。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

精密稱取小鼠紋狀體約10 mg,加入200μL提取液2%(體積分數,下同)甲酸溶液,放入2 顆3 mm 鋼珠,以功率60 Hz 低溫研 磨60 s,研磨2次,以轉速12 000 g?min－1于4 ℃離心15 min。取上清液80μL,分別加入IS溶液10μL和含0.1%乙酸的甲醇溶液10μL,渦旋混勻;再加入100μL甲醇渦旋,以轉速12 000 g?min－1離心15 min,取上清液按照儀器工作條件測定。同步進行空白試驗。

2 結果與討論

2.1 提取液的選擇

DA 及其代謝物是典型的大極性小分子化合物,故試驗在參照文獻[24-25]報道的提取液基礎上進行探索,以1%(體積分數,下同)甲酸溶液、含1%甲酸的甲醇溶液、2%甲酸溶液為提取液,考察了不同提取液對各目標物的提取效果。結果發現:以含1%甲酸的甲醇溶液為提取液時,DOPAC 出現峰寬的現象;以2%甲酸溶液為提取液時,目標物響應高于1%甲酸溶液的。因此,試驗選擇2%甲酸溶液為提取液,甲醇作為蛋白沉淀試劑。

2.2 色譜柱的選擇

試驗考察了 Hypersil GOLD(100 mm ×2.1 mm,1.9 μm)、Accucore PFP(100 mm ×2.1 mm,2.6μm)、Atlantis T3(100 mm×2.1 mm,3.0μm)、X Select CSH C18(100 mm×2.1 mm,2.5μm)和Gemini NX-C18(150 mm ×2 mm,3.0μm)等不同色譜柱對目標物的分離效果。結果表明:目標物為極性較大的小分子,在Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm,1.9μm)、Accucore PFP(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)與Atlantis T3(100 mm×2.1 mm,3.0μm)中表現出低保留,且不能使所有目標物出峰。而X Select CSH C18(100 mm×2.1 mm,2.5 μm)和Gemini NX-C18(150 mm×2 mm,3.0μm)色譜柱可以達到分離效果,X Select CSH C18色譜柱表面帶電雜化顆粒(CSH),可使其表面帶上少量的電荷,其柱效更高、目標物峰形更好,但是在分析樣品時發現,樣品基質的復雜性使目標物測定結果的重復性較差。Gemini NX-C18色譜柱所得目標物測定結果的重復性較好,且目標物響應能達到分析要求。因此,試驗選擇Gemini NX-C18色譜柱對目標物進行分離。

2.3 流動相的選擇

DA 及其代謝物的液相色譜-質譜聯用分析常用有機相為含0.1%乙酸的甲醇溶液和含0.1%乙酸的乙腈溶液[26-28]。試驗發現,乙腈作為有機相時,DOPAC會出現嚴重拖尾,因此選用含0.1%乙酸的甲醇溶液作為有機相。試驗還考察了0.05%(體積分數)甲酸溶液、0.1%(體積分數)甲酸溶液、0.05%(體積分數)乙酸溶液和0.1%乙酸溶液作為水相體系時對目標物的分離效果。結果發現,以0.1%乙酸溶液為水相體系時,所有目標物峰形都較好,其他水相體系會出現目標物寬峰的現象,因此選用0.1%乙酸溶液作為水相體系。

在優化的流動相體系下,標準溶液及小鼠紋狀體組織樣品加IS溶液的色譜圖如圖1所示。ESI＋模式下DA 與IS 的保留時間分別為0.98 min 和1.20 min,ESI－模式下DOPAC 和HVA 的保留時間分別為4.03 min和4.39 min。測定的總運行時間為7.00 min,表明方法快速、高效。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

取離心管數支,分別加入提取液2%甲酸溶液80μL、IS溶液10μL 以及10μL 混合標準儲備溶液系列,渦旋混勻。按照樣品前處理方法進行操作,配制成DOPAC 質量濃度分別為0.5,1,5,10,50,100,500,1 000μg?L－1,HVA 質量濃度分別為0.25,0.5,2.5,5,25,50,250,500μg?L－1,DA 質量濃度分別為0.05,0.1,0.5,1,5,10,50,100μg?L－1的混合標準溶液系列。按照儀器工作條件測定,以目標物的質量濃度為橫坐標(x),以目標物峰面積(As)與IS峰面積(Ai)比值與空白提取液中目標物峰面積(A0)與IS峰面積(A0i)比值的差為縱坐標(y＝As/Ai－A0/A0i),采用最小二乘法建立線性回歸方程,權重系數為1/x。所得的線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。

表2 線性參數、檢出限與測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

以目標物定量離子的3倍信噪比(S/N)計算檢出限,以目標物定量離子的10倍信噪比(S/N)計算測定下限,結果見表2。

2.5 精密度與回收試驗

取小鼠紋狀體組織,分別加入60,30,6μg?L－1的DA,300,150,30μg?L－1的HVA,600,300,60μg?L－1的DOPAC,按照樣品前處理方法制備成高、中、低等3個不同濃度水平的加標樣品。因空白對照組小鼠有限,且紋狀體組織較小,樣本量達不到每個濃度水平制作5個平行樣品,故試驗中每個濃度水平制作3個平行樣品,將加標樣品連續進樣3 d,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),考察方法的日內精密度、日間精密度與準確度,結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果Tab.3 Results of test for precision and recovery

由表3可知,3種目標物的回收率為84.4%～117%,測定值的RSD 均小于15%,說明方法的準確度和精密度符合測定要求。

取高、中、低濃度水平的各一個加標樣品,分別連續進樣6次,計算測定值的RSD,考察儀器的精密度。結果顯示,測定值的RSD 均小于5.0%,說明儀器精密度良好,穩定性良好,滿足實驗室測定要求。

2.6 樣品穩定性

按照樣品前處理方法制備高、中、低等3種濃度水平的質控樣品,測定質控樣品在自動進樣器中放置8 h、4 ℃放置24 h以及－80 ℃放置30 d前后3種目標物的含量,計算放置前后測定值的相對誤差(RE),結果見表4。

表4 多巴胺及其代謝物的穩定性結果Tab.4 Stability results of DA and its metabolites

結果表明:在4 ℃放置24 h前后的樣品中DA測定值的RE 絕對值達到20%,但符合試驗要求;上述條件下其他兩種目標物及其他條件下3種目標物測定值的RE 絕對值均不大于17%。因此,在自動進樣器中保存8 h、4 ℃保存24 h以及－80 ℃保存30 d的樣品穩定性良好。

2.7 樣品分析

采用試驗方法對空白對照組和PD 模型組C57BL/6小鼠紋狀體中的DA 及其代謝物進行測定,結果見表5。其中,“?”代表P＜0.05,“??”代表P＜0.001。

表5 小鼠紋狀體中DA及其代謝物的測定結果(n＝4)Tab.5 Determination results of DA and its metabolites in striatum of mice(n＝4)

由表5可知,PD 模型組C57BL/6小鼠紋狀體中DA、DOPAV 及HVA 的含量顯著降低,表明PD模型組出現神經退行性現象。

本工作采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定小鼠紋狀體中DA 及其代謝物的含量。方法快速、可靠,重復性好,靈敏度高,可檢測和量化小鼠紋狀體中的DA、DOPAC和HVA,為小鼠紋狀體DA 及其代謝物的含量測定提供了直接手段,有助于后續通過小鼠紋狀體中DA 及其代謝物含量分布對PD模型驗證以及治療進行深入研究。