QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定蜂產品中克百威和3-羥基克百威的殘留量

黎天勇,李 菊,吳舒悅,席 靜,王 嵐

(廣州海關技術中心,廣州 510623)

農藥對動物源食品的污染主要來源于飼料中農藥的殘留,飼料中的農藥污染主要源自飼料加工原料(大豆、玉米等)生長過程的農藥施用[1-2]。據有關研究顯示,氨基甲酸酯類農藥如克百威及其代謝物為代表的農藥作為有機氯農藥的替代品在種植業上已經得到廣泛應用[3-4]?？税偻置秽?是一種具有殺蟲和殺螨作用的農藥?？税偻捌浯x物對病蟲膽堿酯酶具有不可逆地抑制作用[5],對多種病蟲害防治作用顯著。目前,克百威及其代謝物在防治農作物病蟲害,控制人畜傳染病,提高農畜禽產品產量與質量方面起到舉足輕重的作用。但是,由于克百威及其代謝物不可逆地抑制膽堿酯酶,在玉米、小麥等飼料作物中的克百威及其代謝物的殘留物可通過食物鏈進入禽畜及人體內富集累積,從而對禽畜及人體健康、生態環境造成危害[6-8]。近年來,氨基甲酯類農藥克百威的過量使用造成中毒的現象時有發生[9-10],因此各國都制定了相關的限量標準。我國GB 2763－2021?食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量標準?規定,克百威主要用途為殺蟲劑,克百威殘留量按“克百威及3-羥基克百威之和,以克百威表示”的規定,而農業部235號公告附錄4則將克百威列為禁止在動物中使用的藥物種類;歐盟(EU)2015/399 規定,蜂及蜂產品中克百威限量為0.05 mg?kg－1,為臨時限量。

當前,氨基甲酸酯類殺蟲劑的檢測方法涉及比較多的基質,以植物源性基質[11-20]研究為主,如果蔬、中藥等,還有土壤[21]、水[22-24]、飲料[25]等基質,動物源性基質的相關研究相對較少[26-27]?，F行檢測動物性食品中克百威的方法主要有 GB 31658.10－2021?食品安全國家標準 動物性食品中氨基甲酸酯類殺蟲劑殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法?、GB/T 5009.163－2003?動物性食品中氨基甲酸酯類農藥多組分殘留高效液相色譜測定?、SN/T 2560－2010?進出口食品中氨基甲酸酯類農藥殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法?,這3 個標準所適用范圍均未涉及蜂產品。蜂產品中氨基甲酸酯類殺蟲劑克百威的相關分析研究較少[28-29],且這些方法均不涉及克百威的代謝產物3-羥基克百威,因此適用范圍并不廣泛。國家標準GB 23200.99－2016?蜂王漿中多種氨基甲酸酯類農藥殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法?也只測定克百威原藥,沒有測定代謝物3-羥基克百威。另外,前處理方法多是采用固相萃取法,在凈化過程中提取液經過固相萃取柱凈化,耗費溶劑量相對較大,耗時相對較長[26-29]。本工作采用液相色譜-串聯質譜法,結合QuECh ERS 前處理技術測定蜂產品中克百威和3-羥基克百威的殘留量,可為蜂產品中克百威和3-羥基克百威殘留量的檢測提供方法參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ QUANTIVA 型液相色譜-質譜/質譜儀;BT223S型電子天平(精確到0.01 g);CPA225D 型電子天平(精確到0.01 mg);ST16R 型臺式冷凍離心機;ET3301 型全自動氮吹濃縮儀;Promax 2020型水平往復式振蕩器,Multi reax型渦旋振蕩器;JYS-M01型磨粉機;Milli-Q 型純水系統。

克百威標準儲備溶液:1 000 mg?L－1,準確稱取10 mg的克百威標準物質,用乙腈溶解并定容至10 mL,配制成質量濃度為1 000 mg?L－1的克百威標準儲備溶液。

3-羥基克百威標準儲備溶液:1 000 mg?L－1,準確稱取10 mg的3-羥基克百威標準物質,用乙腈溶解并定容至10 mL,配制成質量濃度為1 000 mg?L－1的3-羥基克百威標準儲備溶液。

克百威、3-羥基克百威標準物質的純度不小于98%;乙腈為色譜純;無水硫酸鎂、氯化鈉、氫氧化鈣均為分析純;乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)粒徑為40～60μm;十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)粒徑為50μm;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Accucore aQ C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,2.6μm);柱溫45 ℃;流量0.3 mL?min－1;進樣量2μL;流動相A 為含5 mmol?L－1甲酸銨的0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液;B為甲醇。梯度洗脫程序:0～5.0 min 時,B 由20% 升至90%,保持3.0 min;8.0～9.0 min時,B由90%降至20%,保持1.0 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧電離(ESI)源,正離子(ESI＋)掃描;鞘氣壓力241.32 kPa,輔助氣壓力68.95 kPa,吹掃氣壓力6.89 kPa;離子傳輸管溫度350 ℃,蒸發溫度300 ℃;多反應監測(MRM)方式。其他質譜參數見表1,其中,“?”代表定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 提取

稱取蜂蜜、蜂王漿2 g,分別置于50 mL離心管中,加5 mL水,渦旋混勻1 min,靜置5 min。加入10 mL乙腈,渦旋混勻1 min,搖床振蕩10 min,加入2～3 g 氯化鈉之后,渦旋均勻1 min,以轉速4 000 r?min－1離心5 min,分別取出1 mL 蜂蜜、蜂王漿上清液作為待凈化液。

稱取蜂膠0.2 g 于50 mL 離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋混勻1 min,置超聲儀提取10 min,加入10 mL 0.5%(質量分數)氫氧化鈣溶液,渦旋混勻2 min后再加4～6 g氯化鈉,渦旋混勻2 min,于0 ℃以轉速10 000 r?min－1離心10 min,取4 mL蜂膠上清液作為待凈化液。

1.3.2 凈化

取上述蜂蜜待凈化液、蜂王漿待凈化液,分別轉移至內含150 mg無水硫酸鎂、50 mg C18和50 mg PSA 的高速離心管中,渦旋均勻約1 min,以轉速12 000 r?min－1離心5 min。分別取蜂蜜、蜂王漿的上清液過0.22μm 有機相濾膜后按照儀器工作條件測定。

取蜂膠待凈化液全部轉移至內含除水劑和凈化材料的塑料離心管中(每毫升待凈化液使用150 mg無水硫酸鎂、50 mg C18和50 mg PSA),渦旋均勻后,以轉速12 000 r?min－1離心5 min。定量吸取2 mL上清液至氮吹管,于45 ℃水浴氮吹至干后立即加入1 mL乙腈復溶,渦旋混勻,過0.22μm 有機相濾膜后按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

2.1.1 提取溶劑

在氨基甲酸酯類藥物殘留檢測研究中,乙腈、丙酮、乙酸乙酯是比較常用的提取溶劑。試驗以蜂蜜、蜂王漿和蜂膠樣品為研究對象,蜂蜜、蜂王漿中克百威和3-羥基克百威的加標量均為0.01 mg?kg－1,蜂膠中克百威和3-羥基克百威的加標量均為0.05 mg?kg－1,分別各用10 mL乙腈、含1%(體積分數,下同)乙酸的乙腈溶液、乙酸乙酯、丙酮作為提取溶劑,考察了提取溶劑對蜂蜜、蜂王漿和蜂膠樣品克百威和3-羥基克百威回收率的影響,結果見圖1和圖2。

圖1 提取溶劑對克百威回收率的影響Fig.1 Effect of extraction solvents on recovery of carbofuran

圖2 提取溶劑對3-羥基克百威回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on recovery of 3-hydroxycarbofuran

由圖1、圖2可知:以乙腈和含1%乙酸的乙腈溶液為提取溶劑時,克百威和3-羥基克百威的回收率均能達到90.0%以上;以乙酸乙酯和丙酮為提取溶劑時,克百威和3-羥基克百威的回收率均偏低,而且提取液整體比較渾濁,判斷是提取過程中被溶解出來的雜質偏多,這給后續凈化帶來困難。

以蜂膠為研究對象,在使用酸性乙腈為提取溶劑時,分離度不好,提取液整體渾濁;而使用乙腈提取時,提取液顏色較淺,雜質相對較少,分層效果明顯。因此,試驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 凈化劑

常用的凈化方式包括Qu ECh ERS凈化和固相萃取凈化,考慮到固相萃取柱需要活化和洗脫程序,過程繁瑣,溶劑耗費量大,因此采用更能節約溶劑,操作更為簡便的 Qu ECh ERS 凈化方式。Qu ECh ERS凈化方式中常用的凈化劑有PSA、C18、石墨化碳黑(GCB)等。PSA 和C18在化學分析中被廣泛使用,是去除基質中的脂肪、糖類和有機酸等的良好材料;GCB 由于其特殊結構,使得其對色素和某些平面對稱結構物質有吸附作用。

試驗選用3種凈化方案,方案一(150 mg無水硫酸鎂＋50 mg PSA＋50 mg C18＋25 mg GCB)、方案二(150 mg無水硫酸鎂＋50 mg PSA＋50 mg C18)、方案三(150 mg無水硫酸鎂＋50 mg PSA)?？疾炝松鲜?種凈化方案對蜂蜜中克百威和3-羥基克百威回收率的影響,結果見圖3。

圖3 凈化方案對克百威和3-羥基克百威回收率的影響Fig.3 Effect of purification methods on recovery of carbofuran and 3-hydroxycarbofuran

由圖3 可知,Qu ECh ERS 方案二的回收率較高,達到90.0%以上。因此,試驗選擇的凈化劑為150 mg無水硫酸鎂＋50 mg PSA＋50 mg C18。

2.2 色譜條件的選擇

試驗比較了甲醇-0.1% 甲酸溶液、甲醇-含5 mmol?L－1甲酸銨的0.1%甲酸溶液等流動相體系的分離效果,結果表明,克百威與3-羥基克百威在甲醇-含5 mmol?L－1甲酸銨的0.1%甲酸溶液流動相體系中離子化程度更高、響應值更大,峰形更好。綜合考慮,試驗選擇甲醇-含5 mmol?L－1甲酸銨的0.1%甲酸溶液體系為流動相。

試驗考察了柱溫(30,35,40,45 ℃)對分離效果的影響,結果發現,柱溫對克百威和3-羥基克百威的色譜分離效果影響不大,但柱溫越高,色譜分離的速率越快。因此,為節省分析時間,試驗選擇45 ℃作為柱溫。

在優化的條件下,克百威出峰時間為5.10 min,3-羥基克百威出峰時間為3.81 min。0.01 mg?L－1克百威標準溶液和0.01 mg?L－13-羥基克百威標準溶液的MRM 色譜圖見圖4。

圖4 色譜圖Fig.4 Chromatograms

2.3 質譜條件的選擇

以10μL?min－1的流量將1.0 mg?L－1的克百威和3-羥基克百威標準溶液分別連續注入ESI源中,在ESI＋模式下對克百威和3-羥基克百威進行一級質譜分析(Q1掃描),得到克百威和3-羥基克百威的準分子離子,并優化去簇電壓等參數。對準分子離子進一步采用二級質譜分析(子離子掃描),得到相關子離子信息,通過進一步優化碰撞能量,克百威與3-羥基克百威的二級質譜見圖5。選擇信號最強、無干擾的離子對作為定量離子對,選響應值高,m/z大且基線噪聲相對低的離子對作為定性離子對。此外,對離子源、鞘氣、輔助氣等參數進行優化,采用MRM 模式采集數據,優化的質譜條件詳見1.2.2節。

圖5 二級質譜圖Fig.5 Secondary mass spectra

2.4 基質效應

基質效應(ME)指的是基質對分析過程的干擾及對分析結果的影響,其計算公式為ME＝(A1－A2)/A2×100%,其中A1、A2 分別為各目標化合物在基質與純溶劑中的響應值(即峰面積)。|ME|大于50%通常被認為基質效應明顯;|ME|在20%～50%內則被認為基質效應中等;|ME|小于20%被認為存在弱基質效應。試驗中,按照儀器工作條件分別測定純溶劑乙腈配制的克百威和3-羥基克百威標準溶液、基質(蜂蜜、蜂王漿、蜂膠)匹配的克百威和3-羥基克百威標準溶液,記錄目標物的峰面積,計算ME,結果見表2。

表2 基質效應Tab.2 Matrix effect

由表2可知,3種基質下均存在弱基質效應,對兩種目標物測定影響不大?？紤]到蜂蜜產品基質復雜,采用基質匹配的標準溶液系列建立工作曲線。

2.5 工作曲線和測定下限

分別以空白蜂蜜、蜂王漿、蜂膠為基質,按照試驗方法處理,加入克百威和3-羥基克百威標準儲備溶液,用乙腈逐級稀釋,配制成質量濃度分別為0.002,0.005,0.010,0.020,0.050,0.100 mg?L－1的基質匹配的克百威和3-羥基克百威標準溶液系列。以目標物的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。結果表明,克百威和3-羥基克百威的質量濃度均在0.002～0.100 mg?L－1內與對應的峰面積呈線性關系,所得線性回歸方程和相關系數見表3。

表3 線性參數和測定下限Tab.3 Linearity parameters and lower limits of determination

對于試驗中測定下限的設置,首先考慮的是對應濃度水平信噪比(S/N),回收率和精密度是否符合相關要求;其次考慮的是各個國家最嚴格的限量。最終通過在空白基質中添加目標物組分,以10倍信噪比對應的濃度水平得到測定下限(10S/N),結果見表3。

2.6 精密度和回收試驗

在蜂蜜、蜂王漿和蜂膠空白樣品中定量添加克百威和3-羥基克百威標準溶液,按照試驗方法對每個濃度水平重復測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表4。

表4 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表4可知,克百威的回收率為88.8%～108%,測定值的RSD 為0.50%～3.5%;3-羥基克百威的回收率為84.5%～106%,測定值的RSD 為2.0%～6.8%。說明方法的精密度和準確度良好。

2.7 樣品分析

隨機抽取市售蜂產品共6份,按照試驗方法進行分析,結果顯示,所抽取樣品中,均未檢出克百威和3-羥基克百威。

為解決現行動物源性食品中檢測克百威和其代謝物3-羥基克百威標準中缺少蜂產品的問題,本工作采用液相色譜-串聯質譜法,結合QuEChERS前處理技術測定蜂產品中克百威和3-羥基克百威的殘留量。采用的QuECh ERS方法一定程度上簡化了樣品處理流程,成本更低,耗費溶劑量相對較少,環境友好;同時,本方法的測定下限能滿足我國農業部235號公告及歐盟(EU)2015/399對蜂產品的相關規定要求。