超高效液相色譜-串聯質譜法測定毛發中7種新型苯二氮類策劃藥物的含量

鄭新勇 ,曹廣生 ,王辰雪 ,劉 宸 ,李旭陽 ,宋 昕?

(1.合肥市公安局刑事科學技術研究所,合肥 230001;2.杭州譜育科技發展有限公司,杭州 310000)

在藥物輔助犯罪案件中,受害者基本為單次用藥,并且涉及的藥物具有用量小、藥效強、體內代謝快和含量低等特點,被害人恢復認知時,其血液和尿液可能已無法提供有效檢材[8]。毛發具有檢出時效長、易獲取和易保存的優勢,可以根據發絲的長度檢測幾周、幾個月甚至幾年前的藥物信息[9-10]。液相色譜-串聯質譜法因其具有靈敏度高、準確度好等特點而廣泛應用于生物檢材中痕量毒(藥)物的測定[11-17]。目前國內外關于毛發中新型苯二氮類策劃藥物的測定報道較少,本工作采用濕法冷凍研磨結合超高效液相色譜-串聯質譜法對毛發中瑞馬唑侖、科納唑侖、氟阿普唑侖、氟溴唑侖、?，斶騺?、依替唑侖、溴替唑侖等7種新型苯二氮類策劃藥物進行測定,為新型苯二氮類策劃藥物輔助犯罪案件的偵破提供了相應的借鑒和參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ULC 510 型超高效液相色譜儀;EXPEC 5210型三重四極桿串聯質譜儀;JXCL-6K 型三維離心冷凍研磨儀;CV400 型毒物檢測濃縮儀,配JM50低溫冷肼;Milli-Q Direct型純水/超純水一體化系統。

單標準儲備溶液:0.1 g?L－1,瑞馬唑侖、科納唑侖、氟阿普唑侖、氟溴唑侖、?，斶騺?、依替唑侖、溴替唑侖、阿普唑侖-d5的質量濃度均為0.1 g?L－1。

單標準溶液:10 mg?L－1,分別取適量的單標準儲備溶液,用甲醇稀釋,配制成質量濃度為10 mg?L－1的單標準溶液。

混合標準溶液:100μg?L－1,取適量的各單標準溶液,用甲醇稀釋,配制成質量濃度為100μg?L－1的混合標準溶液,保存于4 ℃冰箱,使用時用甲醇稀釋至所需質量濃度。

含內標提取劑:1μg?L－1,取適量的內標阿普唑侖-d5單標準溶液,用甲醇稀釋至質量濃度為1μg?L－1,現配現用。

瑞馬唑侖、科納唑侖、氟阿普唑侖、氟溴唑侖、?，斶騺?、依替唑侖、溴替唑侖、阿普唑侖-d5的純度均不小于99%;甲醇、乙腈和甲酸為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Acquity UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫40℃;流動相A 為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B為含0.1%甲酸的乙腈溶液;流量0.2 mL?min－1;進樣量5μL。洗脫程序:0～4.0 min 時,B 為40%;4.0～7.0 min 時,B 由40%升至65%;7.0～8.0 min 時,B 由65%升至95%;8.0～9.0 min 時,B 由95%降至40%,保持2.0 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源正離子(ESI＋)模式掃描,多反應監測(MRM)模式檢驗;毛細管高壓4.8 kV;去溶劑氣溫度480 ℃;霧化氣流量1.2 L?min－1,去溶劑氣流量6 L?min－1,反吹氣流量1.2 L?min－1;碰撞氣為高純氮氣,流量0.5 mL?min－1。其他質譜參數見表1,其中“?”為定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

使用水、丙酮將毛發樣品依次洗滌一次,置于潔凈濾紙上晾干,之后將其剪碎至1～2 mm 長度備用。精確稱取20 mg剪碎后的毛發于2 mL具蓋研磨管中,加入1 mL 含內標提取劑,放入－50 ℃三維離心冷凍研磨儀中,預冷5 min后,冷凍研磨兩次,每次90 s,中間間隔60 s,并以5 000 r?min－1轉速離心5 min。待離心完畢后,取上清液,置于毒物檢測濃縮儀中,濃縮至干,用100μL 甲醇復溶,過0.22μm 有機濾膜,濾液按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

圖1 空白毛發樣品中7種新型苯二氮類策劃藥物及內標的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 7 novel benzodiazepines and internal standard in blank hair sample

2.2 色譜柱的選擇

試驗比較了 kinetex Biphenyl 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)、Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)對7種新型苯二氮類策劃藥物的分離效果。結果表明:kinetex Biphenyl色譜柱分離效果較好,但是峰形和響應與Acquity UPLC HSS T3色譜柱相比較差;使用Acquity UPLC BEH C18色譜柱分析時,峰形和響應較好,但是分離效果與Acquity UPLC HSS T3色譜柱相比較差。因此,試驗最終選擇響應更高、峰形更好、分離效果更佳的Acquity UPLC HSS T3色譜柱。

2.3 流動相的選擇

2.4 質譜條件的選擇

配制質量濃度為100μg?L－1的氟阿普唑侖等7種新型苯二氮類策劃藥物及內標阿普唑侖-d5單標準溶液,采用ESI＋模式對每一種化合物的錐孔電壓和碰撞能量進行優化。首先,將化合物在一級質譜全掃描(MS1 Scan)模式下采集,獲得[M ＋H]＋分子離子峰,并優化出最優的錐孔電壓;其次,將標準物質在二級質譜產物離子(Product ion)模式下采集,選取干擾小且響應較高的兩個子離子,其中響應高的作為定量離子,響應低的作為定性離子;最后,將化合物在MRM 模式下采集,優化化合物的碰撞能量;并將響應最弱的化合物在MRM 模式下進行采集,對離子源的毛細管高壓和去溶劑氣溫度等參數進行優化,進而獲得最優的質譜條件。具體質譜條件見1.2.2節。

2.5 專屬性試驗

將20位健康志愿者所提供的毛發均按1.3節試驗方法處理,在1.2節儀器工作條件下進行分析,考察了空白毛發對目標物的干擾。結果表明,在空白毛發基質中,7種化合物及內標的保留時間附近均未出現明顯色譜峰,毛發基質中的內源性雜質不會對目標物及內標形成干擾,說明本方法具有較高的專屬性。

2.6 基質效應

分別取空白毛發,按1.3節試驗方法處理(此時提取劑為甲醇)獲得空白基質提取液,用于配制質量濃度為5,50,250 pg?mg－1基質匹配的標準溶液,其中內標的質量濃度為50 pg?mg－1,測定相對峰面積;用甲醇配制5,50,250 pg?mg－1的標準溶液,其中內標的質量濃度為50 pg?mg－1,測定相對峰面積。通過相對峰面積比值評價基質效應帶來的影響,結果見表2。

表2 基質效應Tab.2 Matrix effect

結果表明,在低、中、高3種濃度水平下,毛發中7 種新型苯二氮類策劃藥物的基質效應為87.7%～104%,說明方法基質效應不明顯。但在公安案件理化檢驗實踐中,為確保檢材分析的準確度,應選擇與檢材具有一致性的空白基質進行同步處理,因此試驗選擇配制基質匹配的混合標準溶液系列來繪制后續的工作曲線。

2.7 工作曲線和檢出限

以空白毛發為基質,分別制備1,2,5,10,20,50,100,200,500 pg?mg－1基質匹配的混合標準溶液系列,其中內標的質量濃度為50 pg?mg－1。按1.3節試驗方法處理,在儀器工作條件下進行分析。以各目標物的質量分數為橫坐標,定量離子色譜峰面積與內標定量離子色譜峰面積之比為縱坐標繪制工作曲線。結果表明,毛發中7種新型苯二氮類策劃藥物的質量分數在1～500 pg?mg－1內與定量離子色譜峰面積和內標定量離子色譜峰面積之比呈線性關系。具體的線性參數見表3。

表3 線性參數和檢出限Tab.3 Linearity parameters and detection limits

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),結果見表3。

2.8 精密度和回收試驗

分別對空白毛發在5,50,250 pg?mg－1低、中、高3個濃度水平上進行加標回收試驗。每個加標濃度水平制備6份樣品,按1.3節試驗方法進行處理,在1.2節儀器工作條件下進行分析,結果見表4。在一天的早、中、晚三個時間段按回收率考察相同操作檢驗分析,計算相對峰面積的相對標準偏差(RSD),獲得日內精密度。連續檢驗3 d,計算相對峰面積的RSD,獲得日間精密度,結果見表4。

2.9 樣品分析

2022年6月15日,某市張某某(女)被犯罪嫌疑人麻醉強奸,案發一周后在其家人陪同下報案,因距離案發時間太長,受害人血液和尿液已無法作為有效檢材。一個月后,采集受害人從頭皮至發梢2 cm 長度毛發,通過本方法檢驗后檢出氟阿普唑侖,說明本工作建立的方法可用于實際工作中。

本工作以目前國內外增長較為迅速且對社會公共安全威脅較大的新型苯二氮類策劃藥物為對象,針對案件中常用易獲得且具有監測長程用藥信息的毛發檢材,提出了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定毛發中7 種新型苯二氮類策劃藥物含量的方法。本方法專屬性好、靈敏度高、準確度高,為公安機關在實際工作中打擊新型苯二氮類策劃藥物濫用和藥物輔助犯罪案件提供重要參考方法與技術支持。