毛細管電泳聯用電噴霧電離質譜法測定5種植物激素的含量

黃端華 ,李 鑫 ,張 蘭?

(1.福建船政交通職業學院,安全與環境學院,福州 350007;2.福州大學 化學學院,福州 350116)

植物激素可對植物的生長發育起到促進或抑制作用[1]。植物激素包括生長素類、脫落酸、細胞分裂素類、赤霉素類、乙烯等5 大類。吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丙酸(IPA)、萘乙酸(NAA)、6-芐基氨基嘌呤(BA)和脫落酸(ABA)等5種植物激素是5大類中常被使用的生長調節劑。其中,IAA、IPA和NAA 等屬于植物激素中的生長素,應用于農業生產中可調控植株生長、改良性狀、提高產量[2-3]。BA 屬于細胞分裂素,是一種能夠促進胞質分裂的物質,與生長素協同促進植物組織生長,BA 在園藝、農業等領域中的應用最為廣泛。ABA 能夠促進種子休眠和脫落來維系植物體的生長[4]。通過對植物生長、分裂、脫落等全過程的激素含量分析和動態監測,有助于指導農民合理使用植物激素,同時也能為農作物栽培研究提供數據支撐。

目前,植物激素含量的測定方法主要有液相色譜法及液相色譜-質譜聯用法[5-9]、氣相色譜法及氣相色譜-質譜聯用法[10]、毛細管電泳法[11]等。其中,毛細管電泳法由于其用量少、分離快速等優點,在開展植物激素的分析研究中取得了一定的進展[12-14]。有報道采用毛細管電泳-串聯質譜法對椰子中的玉米素(Z)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、赤霉素(GA)等進行富集分離[15]。目前,對生長、分裂和脫落等類別植物激素的同時分離和檢測的方法未見報道。本工作選取5種含生長、分裂和脫落等類別植物激素IAA、IPA、NAA、BA 和ABA 為研究對象,采用毛細管電泳聯用電噴霧電離(ESI)質譜法(CE-ESIMS)測定上述5種植物激素的含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

毛細管電泳聯用電噴霧電離質譜儀,配1100系列單重四極桿質譜、G1607A 電噴霧接口和1100系列恒流泵;未涂層石英毛細管(90 cm×50μm,375μm);Milli-Q 型超純水器。

單標準儲備溶液:1.000 g?L－1,準確稱取IAA、IPA、NAA 和ABA 標準品,分別用乙腈溶解并定容,配制成1.000 g?L－1單標準儲備溶液;準確稱取BA 標準品,用0.1 mol?L－1氫氧化鈉溶液溶解并定容,配制成1.000 g?L－1單標準儲備溶液,并儲存于4 ℃冰箱。

IAA、IPA、NAA、BA 和ABA 標準品的純度均大于98%;乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 電泳條件

未涂層石英毛細管柱,進樣壓力5 kPa,進樣時間2 s,毛細管卡盒內溫度為25 ℃;運行緩沖液為pH 6.0 的乙酸-乙酸銨緩沖液,濃度為15 mmol?L－1;有機改進劑為2%(體積分數)乙腈溶液;分離電壓為22 kV。

1.2.2 質譜條件

ESI源,負離子(ESI－)模式;霧化氣(氮氣)壓力69 kPa,干燥氣流量6.0 L?min－1,溫度150 ℃;鞘流液為含0.11%(體積分數,下同)乙酸的50%(體積分數,下同)異丙醇溶液,流量設為3.0μL?min－1,由恒流泵傳送;全掃描(SCAN)數據采集模式,掃描范圍 質荷比(m/z)200～400;選擇離子監測(SIM)數據采集模式,IAA、IPA、NAA、BA、ABA的定量離子分別為m/z176,190,187,226,265。

1.3 試驗方法

準確稱取8.0 mg生根粉樣品,用水溶解并定容至250 mL容量瓶中。分析前用水稀釋30倍,并用0.22μm 濾膜過濾后進樣。

2 結果與討論

2.1 電泳條件的選擇

電泳運行時,分離電壓會影響分離組分整體的分離時間,電壓越大分離越快,但過高電壓也會導致較高的焦耳熱。綜合考慮分離時間、靈敏度等因素,選擇22 kV 為分離電壓。

由于ESI-MS的離子源容易受不揮發性緩沖鹽的污染,也可能因為緩沖鹽的干擾影響樣品離子的生成,因此在ESI-MS系統中常選擇乙酸、甲酸、乙酸銨、氨水等揮發性的組合體系來控制酸度。結合研究對象IAA、IPA、NAA、BA 和ABA 的pKa值(分別為4.75,6.15,4.23,6.15,4.80),采用酸性的緩沖體系即乙酸-乙酸銨緩沖液作為運行緩沖液,分別考察了運行緩沖液的酸度、濃度及其有機改進劑對測定結果的影響。

2.1.1 運行緩沖液的酸度

試驗考察了運行緩沖液乙酸-乙酸銨緩沖液的酸度(pH 分別為4.0,5.0,6.0)對5種植物激素分離的影響,結果見圖1。

圖1 乙酸-乙酸銨緩沖液的酸度對5種植物激素分離的影響Fig.1 Effect of acidity of acetic acid-ammonium acetate buffer solution on separation of five plant hormones

由圖1 可知:當乙酸-乙酸銨緩沖液的pH 為4.0時,待測組分中的ABA 和IPA 不能實現分離;當乙酸-乙酸銨緩沖液的pH 為5.0時,IAA 分離時間較長;當乙酸-乙酸銨緩沖液的pH 為6.0時,所有組分均能實現分離且分離時間較短。因此,試驗選擇pH 6.0的乙酸-乙酸銨緩沖液。

2.1.2 運行緩沖液的濃度

試驗考察了pH 6.0的乙酸-乙酸銨緩沖液的濃度(10,15,20,25 mmol?L－1)對5種植物激素峰面積的影響,結果見圖2。

圖2 乙酸-乙酸銨緩沖液的濃度對5種植物激素峰面積的影響Fig.2 Effect of concentration of acetic acidammonium acetate buffer solution on peak area of five plant hormones

結果表明,當pH 6.0的乙酸-乙酸銨緩沖液的濃度為15 mmol?L－1時,BA 和IPA 的峰面積顯著大于其他濃度的,同時5種待測組分能夠實現基線分離。因此,試驗選擇pH 6.0的乙酸-乙酸銨緩沖液的濃度為15 mmol?L－1。

2.1.3 有機改性劑

在電泳分析中等極性和弱極性的有機組分時,使用有機改性劑能夠通過改變待測組分的溶解性或改變毛細管內壁的表面性質來改善靈敏度和分離性能。試驗選擇乙腈溶液作為有機改性劑,考察其體積分數分別為0,2%,4%,6%時對5種植物激素峰面積的影響,結果見圖3。

圖3 有機改性劑對5種植物激素峰面積的影響Fig.3 Effect of organic modifier on peak area of five plant hormones

結果表明,乙腈的添加改善了各待測組分的響應值,其中對BA 影響較為顯著,當乙腈的體積分數為2%時獲得最佳的結果。因此,試驗選擇添加乙腈的體積分數為2%。

2.2 鞘流液組成及流量的選擇

試驗考察了鞘流液中異丙醇的體積分數(30%,40%,50%,60%,70%)對質譜響應的影響,結果發現,當異丙醇的體積分數為50%時能夠獲得較好的峰形和較強的質譜響應。在50%異丙醇溶液中嘗試添加乙酸,并考察了乙酸的體積分數(0.038%,0.075%,0.11%,0.15%)對質譜響應的影響,結果顯示乙酸的體積分數為0.11%時,質譜響應強。因此,試驗選擇含0.11%乙酸的50%異丙醇溶液為鞘流液。

進一步考察了鞘流液的流量在2.0～5.0μL?min－1內對質譜響應的影響。結果表明,鞘流液的流量為3.0μL?min－1時,質譜峰形和響應優于其他流量的,因此試驗選擇3.0μL?min－1為鞘流液流量。

2.3 毛細管電泳譜圖

在儀器工作條件下,5種植物激素的總離子流圖和選擇離子流圖見圖4。

圖4 5種植物激素的總離子流圖和選擇離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram and selected ion chromatograms of five plant hormones

2.4 標準曲線和檢出限

取適量的單標準儲備溶液,用運行緩沖液逐級稀釋,配制成NAA 質量濃度為0.05,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,10.00 mg?L－1,BA、ABA、IPA、IAA 的質量濃度均為0.10,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,10.00 mg?L－1的混合標準溶液系列。按照儀器工作條件進行測定,以5種植物激素的質量濃度為橫坐標,質譜響應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。所得線性范圍、線性回歸方程、相關系數見表1。

表1 線性參數和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

按照3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),結果見表1。

2.5 精密度試驗

取混合標準溶液,在儀器工作條件下連續分析5次,計算5 種植物激素峰面積的相對標準偏差(RSD)。結果顯示,NAA、BA、ABA、IPA 和IAA峰面積的RSD 依次為4.3%,3.9%,3.0%,3.9%,3.3%,均小于5.0%,說明進樣重現性良好。

2.6 樣品分析和回收試驗

按照試驗方法處理實際生根粉樣品,進樣分析3次。結果顯示,樣品中檢出NAA,質量濃度為0.078 mg?L－1,經計算得到生根粉樣品中NAA 的質量分數為73.1 mg?g－1。在上述處理好的生根粉樣品中,分別添加0.500 mg?L－1和5.00 mg?L－1兩個濃度水平的混合標準溶液,進行加標回收試驗。每個濃度水平平行配制3份,在儀器工作條件下分析,計算回收率,結果見表2。

表2 回收試驗結果Tab.2 Results of test for recovery

由表2 可知,5 種植物激素的回收率為92.4%～114%,說明方法準確度良好。

本工作采用CE-ESI-MS測定多種多類植物激素的含量,優化了電泳分離條件和質譜檢測條件,并成功地將方法用于生根粉中植物激素的檢測。該方法結合了毛細管電泳的分析時間短、分離效率高和質譜的靈敏度高和結構解析能力強的優點,實現了樣品中組分的快速定性和準確定量分析,有望在農作物栽培育種和生長調節劑使用領域得到推廣應用。