南、北五味子蛋白抗氧化活性和對HepG2細胞氧化應激損傷的修復作用

周泓妍,鄭怡,王海東,曹珺,張涵,張紅印,李光哲*,嚴銘銘,3*

1(長春中醫藥大學 藥學院,吉林 長春,130117)2(長春中醫藥大學 東北亞中醫藥研究院,吉林 長春,130117)3(吉林省中藥保健食品科技創新中心,吉林 長春,130117)

氧化應激是指由于某種原因體內產生了超出機體清除能力的多余活性氧(reactive oxygen species,ROS),破壞了機體正常狀態下的氧化/還原平衡,使體內的生物大分子(蛋白質、脂質和核酸等)受到氧化損傷,甚至導致其功能紊亂,對機體正常代謝過程產生影響的一種異常應激狀態[1]。體內自由基水平過高會將細胞膜、代謝酶系、蛋白質和DNA等物質氧化,還會誘導細胞異常凋亡,對機體的細胞造成損傷。研究表明,自由基過多可能引起衰老、炎癥、癌癥、心血管等疾病,因此,開發具有清除自由基和還原能力的功能性健康食品和藥物日益受到重視。人工合成抗氧化劑具有較多不良反應,對人體的肝臟、脾、肺會產生不良影響。天然抗氧化劑與人工合成抗氧化劑相比,具有毒性低、綠色環保等優點[2]。植物蛋白來源廣泛、容易獲得、安全穩定且易被人體消化吸收。同時,植物蛋白還是一類天然的抗氧化物質[3],且中藥中的植物蛋白具有優良的生物活性,對人體有特殊的保健作用[4-6]。目前已有諸多學者對黃芪[7]、山藥[8]、枸杞[9]等中藥植物蛋白展開研究,結果表明,中藥植物蛋白多具有抗氧化,抗過敏、抗糖尿病、抗癌等多種生物活性。

項目組前期對北五味子蛋白(Schisandrachinensisprotein,SCP)進行了深入研究,結果表明五味子蛋白具有優良的體內抗氧化和抗疲勞活性[10-11]。作為與北五味子處于相同屬但不同種的南五味子,與北五味子具有相似傳統功效和現代的生物活性。研究表明,五味子多糖、木脂素、酚酸均具有良好的抗氧化活性[12],但尚未見對不同品種五味子蛋白抗氧化活性相關的研究,尤其是南五味子蛋白(Schisandrasphenantheraprotein,SSP)的抗氧化活性研究。本研究將SSP和SCP體外清除自由基能力和還原能力對比,之后利用H2O2誘導HepG2細胞氧化應激模型探究2種五味子蛋白的抗氧化能力,旨在從細胞活力、細胞形態、細胞ROS水平、抗氧化物質和抗氧化酶系活性方面綜合評價2種五味子蛋白,從而為其在抗氧化功能性食品和健康產品中的開發提供理論依據,并為后續闡明其抗氧化的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

南、北五味子藥材,長春中醫藥大學附屬醫院,經長春中醫藥大學姜大成教授鑒定分別為木蘭科植物南五味子(SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.)和北五味子[Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.]干燥成熟的果實;鄰啡羅啉(鄰二氮菲)、DPPH、ABTS、維生素C(抗壞血酸),分析純,北京索萊寶生物科技有限公司;人肝癌細胞HepG2、最小必需培養基(minimum essential medium,MEM),武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清、胰酶,美國Gibco有限公司;CCK-8、PBS,北京bioss有限公司;ELISA試劑盒[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、丙二醛 (malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)],上海優選生物科技有限公司;活細胞/死細胞染色試劑盒,上海貝博生物科技有限公司;細胞ROS檢測試劑盒,碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Infinite M200 PRO酶標儀,瑞士TECAN公司;AB135-S十萬分之一分析天平、S220-K-CN標準型pH計,梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-2550紫外可見分光光度計,日本島津儀器有限公司;SCIENTZ-50F真空冷凍干燥機,寧波新芝凍干設備股份有限公司;3131型細胞培養箱,美國Thermo Fisher有限公司;5920R低速離心機,德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SCP和SSP制備

稱取一定量南五味子與北五味子干燥脫脂藥粉,按料液比1∶35(g∶mL)加蒸餾水勻漿,將原液pH值調至9.5,于35 ℃水浴中提取3 h,離心(3 500 r/min、15 min),棄沉淀,收集上清液,并將pH值調至3.4,靜置2 h后離心,棄上清液,適量蒸餾水溶解沉淀,將pH值調至中性后,透析袋中4 ℃透析48 h,間隔2 h替換蒸餾水,將透析袋中液體冷凍干燥,此冷凍干燥物即為SCP、SSP。

1.3.2 自由基清除能力

1.3.2.1 超氧陰離子(·O2-)

取若干支干凈試管,編號,加入0.1 mol/L Tris-HCl 3 mL,再加入0.1 mL質量濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的SCP、SSP溶液,混合均勻,25 ℃保溫20 min,加入7 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL,反應4 min后加入1 mL 10 mol/L鹽酸終止反應;樣品對照組將鄰苯三酚溶液用等體積的蒸餾水代替;空白對照組以0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液。維生素C為陽性對照,用蒸餾水做空白調零,于420 nm波長處測其吸光度,計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0,空白對照組吸光度;A1,樣品組吸光度;A2,樣品對照組吸光度。

1.3.2.2 羥自由基(·OH)

采用鄰二氮菲法測定SCP、SSP對·OH的清除作用。將0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL和0.2 mol/L PBS 2 mL加入試管中,隨后加入1 mL不同質量濃度的SCP、SSP溶液,混勻后加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液,立即混勻,最后加入1 mL 0.025% H2O2溶液,混勻,維生素C為陽性對照組,37 ℃水浴反應1 h后536 nm波長處測其吸光度?？瞻讓φ战M以1 mL蒸餾水代替樣品溶液,樣品對照組以1 mL蒸餾水代替0.025% H2O2溶液,·OH清除率計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A0,空白對照組吸光度;A1,樣品組吸光度;A2,樣品對照組吸光度。

1.3.2.3 DPPH自由基

將2 mL不同質量濃度的SCP、SSP溶液加入到具塞試管中,加入2 mL 0.04 mg/mL的DPPH溶液,渦旋混勻。避光反應30 min,以2 mL甲醇代替DPPH溶液作為樣品對照組,以2 mL蒸餾水代替SCP、SSP溶液作為空白對照組,維生素C為陽性對照組,于517 nm處測定吸光度值。DPPH自由基清除率計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A0,空白對照組吸光度;A1,樣品組吸光度;A2,樣品對照組吸光度。

1.3.2.4 ABTS陽離子自由基

去離子水配制7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液,將2.5 mL ABTS儲備液與44 μL過硫酸鉀混勻作為工作液,4 ℃避光靜置12～16 h,臨用前用0.01 mol/L pH 7.4 PBS將工作液稀釋至734 nm處吸光度值為0.7±0.2,作為空白對照組吸光度。將200 μL工作液與10 μL不同濃度的SCP、SSP溶液混勻,室溫下避光反應8 min,于734 nm處測定吸光度值。ABTS陽離子自由基清除能力計算如公式(4)所示:

(4)

式中:A0,空白對照組吸光度;A1,樣品組吸光度。

1.3.3 還原能力

1.3.3.1 Fe2+螯合能力

取96孔板,向100 μL不同濃度的南、北五味子樣品溶液中加入50 μL 1.3 mmol/L FeCl2·4H2O,室溫反應30 min,然后加入50 μL 0.1 mmol/L菲啰嗪溶液。以100 μL蒸餾水代替樣品溶液作為樣品對照組,以維生素C為陽性對照,測定562 nm處的吸光度值,Fe2+螯合能力計算如公式(5)所示:

(5)

式中:A0,樣品對照組吸光度;A1,實驗組吸光度。

1.3.3.2 Fe3+還原能力

將1 mL不同質量濃度的SCP、SSP溶液加入具塞試管中,分別加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6 PBS和10 g/L鐵氰化鉀溶液,迅速混勻后于50 ℃水浴反應20 min,冷卻,加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸,混勻,3 000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 1 g/L的FeCl3溶液,充分混勻,以蒸餾水做空白調零,于700 nm處測其吸光度值,以2.5 mL蒸餾水代替樣品溶液作為樣品對照組,以維生素C為陽性對照。通過公式(6)計算其還原能力:

A=A1-A2

(6)

式中:A1,樣品組吸光度;A2,樣品對照組吸光度。

1.3.4 HepG2 細胞氧化應激修復作用

1.3.4.1 HepG2 細胞培養與分組

將HepG2細胞置于含有10%(體積分數)胎牛血清、100 U/mL青霉素100 μg/mL鏈霉素的MEM培養基中,于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養,待細胞生長密度達到80%～90%后棄掉原培養液,PBS沖洗2次,加入1 mL胰蛋白酶消化2 min,進行傳代培養,定期更換培養基,至對數生長期用于后續實驗。正常對照組:完全培養基;氧化應激模型組:加入終濃度為500 μmol/L H2O2培養基溶液刺激2 h后加入與正常對照組相同體積的完全培養基培養24 h;實驗組:SCP與SSP低劑量組(SCP-L與SSP-L)、SCP與SSP中劑量組(SCP-M與SSP-M)、SCP與SSP高劑量組(SCP-H與SSP-H),先加入終濃度為500 μmol/L H2O2溶液刺激2 h后,采用終質量濃度分別為100、200、400 μg/mL SCP與SSP干預24 h。

1.3.4.2 SCP與SSP對H2O2誘導HepG2細胞增殖率的影響

96孔細胞培養板內接種處于對數生長期的HepG2細胞,每孔100 μL,接種密度為1×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養箱培養,按照1.3.4.1節分組方法處理細胞。采用CCK-8法檢測細胞存活率,按試劑盒說明書檢測各組吸光度,各組細胞存活率計算如公式(7)所示:

(7)

1.3.4.3 Calcein-AM/PI雙色熒光凋亡染色

Calcein-AM/PI熒光染色鑒別細胞內活力的參數酯酶活性和細胞膜完整性,進而來檢測活細胞與死細胞。選取對數生長期的HepG2細胞接種于24孔板內,每孔體積0.5 mL,接種密度為1.0×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h,按照1.3.4.1節分組方法處理細胞后,用PBS洗滌細胞2～3次,每孔加入500 μL稀釋后的Calcein-AM溶液于37 ℃培養箱中避光孵育20 min,PBS洗滌細胞3次,再加入200 μL稀釋后的PI溶液于37 ℃避光反應5 min,PBS洗滌細胞2～3次,置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4.4 HepG2細胞ROS水平測定

選取對數生長期的HepG2細胞接種于6 孔板內,每孔體積2 mL,接種密度為1.0×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養箱培養,按照1.3.4.1節分組方法處理細胞后,每孔加入終濃度10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針,37 ℃避光反應20 min后吸去探針,用預冷的PBS洗滌細胞3次,熒光倒置顯微鏡下記錄細胞形態,采用酶標儀于488 nm 激發波長、525 nm發射波長測定細胞中ROS含量。

1.3.4.5 HepG2細胞中MDA和GSH水平的測定

選取對數生長期的HepG2細胞接種于6孔板內,每孔體積2 mL,接種密度為1.0×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養箱培養,按照1.3.4.1節分組方法處理細胞后,應用ELISA法,參照試劑盒說明書對MDA和GSH進行定量測定。

1.3.4.6 HepG2細胞中抗氧化物酶系活力的測定

選取對數生長期的HepG2細胞接種于6孔板內,每孔體積2 mL,接種密度為1.0×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養箱培養,按照1.3.4.1節分組方法處理細胞后,ELISA法按照試劑盒說明書檢測SOD、GSH-Px和CAT活力。

1.3.5 數據統計與分析

每組實驗重復3次,實驗數據采用平均值±標準差表示。實驗數據使用SPSS 19.0軟件進行統計分析,用方差分析法進行顯著性檢驗,使用Origin 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 自由基清除能力

2.1.1 ·O2-清除能力

鄰苯三酚在弱堿性條件下會發生自氧化反應,形成一種新型的·O2-及有色中間體,可通過添加抗氧化劑來消除·O2-,從而降低其自身的氧化速度[13]。由圖1可知,在測量的樣品濃度范圍內,SCP、SSP濃度與其清除率呈明顯的正相關關系,但是低于維生素C對·O2-清除率。其中,在0.1～0.5 mg/mL,SCP對·O2-的清除作用強于SSP,然而當樣品質量濃度>1.0 mg/mL時,SSP清除·O2-能力優于SCP,可能由于SCP的作用位點不同,在質量濃度為2.5 mg/mL時清除率達到最高,為58.61%。SCP、SSP的IC50值分別為3.15、1.70 mg/mL,IC50值越小,則說明樣品的抗氧化能力越強。與SCP消除·O2-能力相比,SSP的清除能力較高。

圖1 SCP和SSP的·O2-清除能力Fig.1 Superoxide anion free radical scavenging ability of SCP and SSP

2.1.2 ·OH清除能力

·OH清除能力是衡量抗氧化能力的重要指標[14],·OH是ROS中最活潑的氧自由基,也是毒性最大的自由基,是造成生物體損傷的主要因素。樣品中的H與·OH結合,通過減少·OH的積累量,進一步使其在536 nm處的吸光度下降,從而反映SCP與SSP清除·OH的能力。圖2結果表明,隨著樣品濃度的升高,SCP與SSP對·OH的清除率逐漸增大。在0.1～1.0 mg/mL,SCP對·OH的清除能力高于SSP,但在1.5 mg/mL后,SCP對·OH的清除能力低于SSP,且SCP和SSP在2.0 mg/mL時對·OH的清除能力趨向于平緩。由此表明,SCP、SSP具有一定·OH清除活性,IC50值分別為2.11、1.66 mg/mL,因此SSP清除·OH能力優于SCP。

圖2 SCP和SSP的·OH清除能力Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging ability of SCP and SSP

2.1.3 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種穩定性較強的有機氮基團,在甲醇溶劑中表現出暗紫色,能吸附抗氧化物的電子,從而使樣品的顏色發生變化,這種變化與所接收的電子數量成正比,當抗氧化性物質與DPPH自由基結合或發生替代,降低DPPH自由基數目,導致溶液顏色變淺,表現出在517 nm處的吸光度降低[15-16]。如圖3所示,SSP DPPH自由基清除能力高于SCP,在0.1～1.5 mg/mL,隨著樣品濃度的增大,兩者的清除能力呈現出增強的趨勢。當質量濃度為1.5 mg/mL 時,SCP和SSP的清除能力幾乎達到最大值,分別為72.84%和78.49%。SCP、SSP都具有較好的DPPH自由基清除活性,IC50值分別為0.58、0.40 mg/mL,SSP清除DPPH自由基能力優于SCP。

圖3 SCP和SSP的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging ability of SCP and SSP

2.1.4 ABTS陽離子自由基清除能力

在氧化劑作用下,ABTS被氧化成穩定的藍綠色ABTS陽離子自由基[17-18]。當具有抗氧化活性的物質與ABTS陽離子自由基反應后,在734 nm處的吸光度降低,則說明該化合物具有ABTS陽離子自由基清除活性,吸光值越低則其清除率越高。由圖4可知,在0.1～1.5 mg/mL,ABTS陽離子自由基被SSP清除能力隨著樣品濃度的增大而增強,且明顯高于SCP,在1.5 mg/mL時趨向于平緩,此時清除能力接近陽性對照組維生素C的清除能力,當質量濃度為2.5 mg/mL 時達到最大值為 89.56%。SCP、SSP的IC50值分別為1.59、0.54 mg/mL,與SCP相比,SSP具有相對優良的自由基清除能力,可作為一種潛在的抗氧化劑。

圖4 SCP和SSP的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.4 ABTS cation free radical scavenging ability of SCP and SSP

2.2 還原能力

2.2.1 Fe2+螯合能力

Fe2+作為一種過渡態金屬離子中最為強大的助氧化劑,通過Fenton反應或Haber-Weiss反應產生·OH。因此,具有Fe2+螯合能力的物質就能間接抑制·OH的產生,進而發揮抗氧化活性[19]。如圖5所示,在0.1～2.0 mg/mL,SCP與SSP的Fe2+螯合能力隨著樣品濃度的增大而增強,且SSP的Fe2+螯合能力始終高于SCP,當質量濃度為2.5 mg/mL時,SSP的Fe2+螯合率達到最高為37.48%,SCP的Fe2+螯合率為31.61%。由此表明,SCP和SSP具有一定的Fe2+螯合能力,且SSP的Fe2+螯合能力優于SCP。蛋白質的金屬離子螯合能力可以通過與帶電荷的氨基酸殘基之間發生靜電作用來實現,也可能在空間結構上通過俘獲過渡態金屬離子的作用來完成,SSP這種作用優于SCP。因此SSP更適合作為一種相對優良的還原劑,通過螯合金屬離子,間接阻止自由基的形成,從而達到抗氧化的目的。

圖5 SCP和SSP的Fe2+螯合能力Fig.5 Fe2+ chelating ability of SCP and SSP

2.2.2 Fe3+還原能力

抗氧化物質通過自身的還原作用給出電子從而達到清除自由基的目的。因此測定還原能力可以評估抗氧化劑提供電子或氫原子的潛力。還原能力測定是以普魯士藍生成量為指標,樣品將鐵氰化鉀的三價鐵還原成亞鐵氰化鉀的二價鐵,Fe3+與亞鐵氰化鉀可以發生反應,產生普魯士藍[20]。因此樣品的還原能力可以通過測定 700 nm 處的吸光值間接來體現。吸光值越大,表明樣品還原能力越強。由圖6可知,SSP的Fe3+還原能力優于SCP,可能由于原料不同導致其堿液提取暴露出來的抗氧化肽含量存在差異。在0.1～1.5 mg/mL,SCP與SSP的Fe3+還原能力隨著樣品濃度的增大而增強,在2.0 mg/mL時還原能力幾乎達到最高,分別為0.44和0.79,因此SSP表現出更強的還原能力。

圖6 SCP和SSP的Fe3+還原能力Fig.6 Fe3+ reduction ability of SCP and SSP

2.3 HepG2細胞氧化應激修復作用

2.3.1 SCP與SSP對 HepG2細胞存活率的影響

如圖7所示,當樣品質量濃度在400 μg/mL時,SSP處理細胞活力最高,對于SCP,當樣品質量濃度>300 μg/mL時,細胞活力開始下降,說明HepG2細胞在超過該濃度下受損,但存活率幾乎都在90%以上,為該條件下細胞的正常存活率?？紤]到SCP和SSP對細胞氧化應激模型的調節作用可能與劑量有關,同時為了研究不同濃度的SCP和SSP對細胞抗氧化能力的影響,選擇3種質量濃度(100、200、400 μg/mL)的SCP和SSP進行進一步研究。

圖7 SCP和SSP對HepG2細胞存活率的影響Fig.7 Effect of SCP and SSP on the survival rate of HepG2 cells

2.3.2 H2O2對HepG2細胞損傷、細胞活力測定

H2O2是引起細胞發生氧化應激的主要因素,是細胞內最常用的氧自由基生成劑,它可以通過細胞膜滲透到細胞內部,產生其他自由基,主要是·O2-和·OH。由此產生的過量ROS將攻擊生物分子,導致細胞或組織損傷,因此常作為體外氧化應激損傷的造模劑[21]。如圖8所示,在低濃度時H2O2對HepG2細胞損傷較輕,而濃度過大又會對細胞造成不可逆轉的損傷,所以一般應選擇細胞存活率為50%～70%時的H2O2濃度,此時細胞既氧化損傷,又具有一定的恢復能力,因此選用500 μmol/L的H2O2干預2 h作為其造模條件用于后續研究。

圖8 不同濃度 H2O2對 HepG2細胞存活率的影響Fig.8 Effect of different concentration of H2O2on the survival rate of HepG2 cells

2.3.3 SCP與SSP對 H2O2誘導HepG2細胞氧化應激損傷修復作用

細胞存活率是體現外界因素對細胞損傷程度的最直觀指標。細胞遭受氧化應激后會使胞內ROS水平升高,對HepG2細胞造成氧化損傷進而誘導細胞凋亡甚至壞死。細胞存活率越高,說明HepG2細胞受到的氧化損傷越輕[22]。如圖9所示,與空白組相比,模型組細胞存活率顯著降低,只有56.71%,這表明H2O2誘導HepG2細胞構建的氧化應激模型成功。與模型組相比,經過100、200、400 μg/mL SCP與SSP處理HepG2細胞24 h后,細胞的存活率隨著濃度增加顯著升高(P<0.05)。其中,在測定的濃度范圍內,SSP處理后的細胞存活率始終高于SCP,400 μg/mL時接近陽性對照組修復效果。實驗結果表明,SCP與SSP在一定程度上可以對H2O2所造成的細胞損傷產生修復作用,且SSP對H2O2誘導HepG2細胞氧化應激損傷修復作用效果優于SCP。

圖9 不同濃度SCP與SSP對 H2O2誘導HepG2細胞氧化應激損傷修復作用Fig.9 Effects of different concentrations of SCP and SSP on H2O2-induced oxidative stress injury and repair in HepG2 cells注:#和*表示與模型組相比,差異性顯著,L、M、H分別為100、200、400 μg/mL(下同)。

2.3.4 Calcein-AM/PI雙色熒光凋亡染色

Calcein-AM僅對活細胞染色,使細胞質呈現綠色熒光,作為核染色染料的PI不會染色質膜完整的活細胞,僅對死細胞的細胞核染色[23-24]。如圖10所示,與正常組相比,模型組細胞皺縮且細胞密度較低,綠色熒光較弱,紅色細胞核相對明顯,說明H2O2誘導HepG2細胞氧化應激后,促進細胞發生凋亡。然而,與模型損傷組相比,加入不同濃度的SCP與SSP后,綠熒光強度均有所提高,死細胞的細胞核紅色熒光強度降低,且加入的SCP與SSP濃度越高,顯示的綠色熒光強度越高,紅色熒光強度越低,并顯示出濃度依賴性效應。因此,SCP和SSP可以修復HepG2細胞受H2O2引起的形態學變化,并且SSP修復效果優于SCP。

圖10 Calcein-AM/PI雙色熒光染色結果Fig.10 Calcein-AM/PI double color fluorescence staining results

2.3.5 SCP與SSP對H2O2誘導HepG2細胞內ROS水平的影響

正常細胞內ROS生成和清除處于動態平衡。在外界刺激時胞內ROS升高,過量ROS會對細胞的核酸、蛋白質、生物膜造成氧化損傷,導致細胞內氧化還原穩態的改變,發生氧化應激現象,進而誘導細胞損傷和凋亡[25]。DCFH-DA熒光探針穿過質膜到達細胞質時,被胞內酯酶水解成成無熒光的DCFH,DCFH被細胞內的ROS氧化成DCF,可以產生綠色熒光。因此,細胞中的ROS水平可以通過熒光強度來顯示。如圖11、圖12所示,與正常組相比,模型組的DCF熒光強度和ROS含量顯著提高(P<0.05),ROS生成量是正常組的5.99倍,說明細胞遭受嚴重的氧化應激。加入了不同濃度的SCP與SSP后的DCF熒光強度和ROS含量與模型組相比均顯著降低(P<0.05),且加入的SCP與SSP濃度越高,顯示的熒光強度和ROS含量越低。其中在測定濃度范圍內,SCP的DCF熒光強度和ROS含量始終高于SSP。實驗結果表明,SCP與SSP能夠以降低H2O2誘導HepG2細胞內ROS含量,從而發揮其抗氧化應激的功能,對細胞的氧化應激損傷起到一定的修復作用,且SSP對氧化應激損傷細胞內過量ROS的清除作用優于SCP。

圖11 不同濃度SCP與SSP對H2O2誘導HepG2細胞胞內ROS水平熒光染色Fig.11 Fluorescence staining of ROS levels in HepG2 cells induced by H2O2 with different concentrations of SCP and SSP

圖12 不同濃度 SCP與SSP對H2O2誘導HepG2細胞內ROS水平的影響Fig.12 Effects of different concentrations of SCP and SSP on intracellular ROS level of HepG2 cells induced by H2O2

2.3.6 SCP與SSP對H2O2誘導HepG2細胞GSH、MDA水平的影響

GSH是生物體內絕大多數細胞中巰基的主要來源,其中在肝細胞中可達95%以上,是一種內源性抗氧化劑,可有效清除體內脂質過氧化物,是機體抗自由基的主要成分,在維持機體氧化還原平衡和免疫功能中發揮重要的作用[26-28];ROS水平過高可引起脂質過氧化,直接增加MDA水平。MDA是由過氧化物多不飽和脂肪酸(主要是花生四烯酸)裂解形成的三碳化合物,被認為是脂質過氧化的主要產物之一。此外,過量的MDA對腫瘤形成、細胞代謝紊亂和細胞膜功能障礙有負面影響。因此,MDA的多少直接反映了體內過氧化的程度,間接反映了細胞損傷的程度。MDA含量越高,氧化應激損傷越嚴重[29]。

如圖13所示,與空白組相比,H2O2誘導2 h后,HepG2細胞GSH顯著降低,MDA的含量顯著升高(P<0.05),模型組MDA水平顯著升高表明細胞受到過量的ROS刺激后,細胞膜發生嚴重損傷。與模型組相比,經過不同質量濃度(100、200、400 μg/mL)SCP與SSP處理氧化損傷的HepG2細胞24 h后,細胞內GSH含量顯著升高,MDA含量顯著降低(P<0.05),并且在400 μg/mL時,MDA含量接近陽性對照組維生素C,分別為4.83、5.2 nmol/mL,結果與清除ROS的能力一致,而SSP處理后的GSH含量高于維生素C組,這說明經H2O2誘導后,SSP對HepG2的細胞膜損傷產生更好的修復作用。SCP和SSP能顯著對細胞膜脂質氧化損傷起到改善作用,自由基對機體的氧化應激損傷得到較好的修復作用。

a-GSH;b-MDA圖13 不同濃度 SCP與SSP對H2O2誘導HepG2細胞GSH、MDA水平的影響Fig.13 Effects of different concentrations of SCP and SSP on GSH and MDA in HepG2 cells induced by H2O2

結果表明,SSP對HepG2細胞遭受氧化應激后降低MDA和提升GSH含量能力優于SCP,在高濃度下,SSP和標準抗氧化劑維生素C的抗氧化活性接近?；谏鲜鼋Y果,從南、北五味子中提取的蛋白質通過減少ROS的產生來阻止H2O2誘導的MDA積累,并且有效提升GSH含量。其中,SSP表現出更強的修復作用,可能是SSP側鏈上存在著更多的電子/質子供體基團,具有更強的自由基清除能力,從而對HepG2細胞氧化損傷起到更好的修復作用,與馬萍等[30]研究的紫花蕓豆肽對H2O2誘導HepG2細胞氧化應激損傷修復作用的結果一致。

2.3.7 SCP與SSP對H2O2誘導HepG2細胞抗氧化物酶系活力的影響

SOD、CAT和GSH-Px均為細胞抗氧化物酶系中的重要組成部分,在氧化應激狀態下,這些抗氧化酶會作為內源性抗氧化劑在細胞內清除自由基來抑制過氧化反應。SOD催化·O2-分解為H2O2和O2,進而清除自由基[31];CAT通過清除體內產生的過量自由基,催化H2O2分解為H2O,維持機體氧化還原平衡[32-33];GSH-Px能催化GSH變為氧化型谷胱甘肽,將過氧化物還原成羥基化合物,與CAT促進H2O2分解,以保護細胞膜結構與功能[34]。體內抗氧化物酶系活力是生物氧化應激條件下細胞動態平衡的重要指標。

如圖14所示與正常組相比,H2O2作用HepG2細胞2 h后,SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著降低(P<0.05),抑制率分別為44.80%、54.25%和48.23%,說明H2O2干擾了機體內的抗氧化劑調節機制,降低細胞內抗氧化酶系的活力,不足以應付外界刺激,細胞受到嚴重的氧化應激損傷;與模型組相比,經維生素C和SCP與SSP低、中和高劑量處理組的SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著升高(P<0.05),特別是高劑量的SSP作用24 h后,SOD、CAT和GSH-Px活力分別提升了53.33、125.34、182.35 U/mL,表明SSP表現出更好的抗氧化能力。SCP和SSP可以通過酶促抗氧化系統對H2O2誘導的HepG2細胞氧化應激產生修復作用,SSP比SCP表現出更加優良的提升抗氧化酶系的能力,這可能由于SSP側鏈存在更多的氨基酸殘基,發揮出更好的提供氫或質子的作用,這與郭增旺等[35]的研究結果相似。

a-SOD含量;b-CAT含量;c-GSH-Px含量圖14 不同濃度 SCP與SSP對H2O2誘導HepG2細胞抗氧化物酶系活力的影響Fig.14 Effects of different concentrations of SCP and SSP on antioxidant enzyme activity of HepG2 cells induced by H2O2

3 結論

本研究以SSP、SCP為研究對象,基于前期對SCP的研究基礎,首次應用經典化學法結合細胞驗證,比較了同屬不同種的五味子蛋白體外清除自由基能力和還原能力,以H2O2誘導HepG2細胞構建氧化應激損傷模型,研究了SSP、SCP對細胞存活率、細胞形態、ROS水平、GSH含量、MDA水平和抗氧化酶系活力的影響。體外抗氧化實驗表明SSP具有更強的自由基清除能力和還原能力。對于H2O2所引起的HepG2細胞氧化應激,SCP和SSP顯著提升細胞存活率,在一定程度上可以改善細胞氧化應激后的形態,減少細胞凋亡。SCP和SSP可以有效抑制細胞中ROS和MDA水平,維持細胞膜系統穩定性,增加GSH含量和恢復抗氧化酶系活力,尤其SSP作用效果更好。綜上所述,本研究可為SCP和SSP在抗氧化功能性保健食品和健康產品中的開發提供科學依據,并為后續闡明其修復氧化應激損傷的調控機制奠定理論基礎。