非釀酒酵母在酒類釀造過程中的微生物相互作用及功能特性研究進展

李海峰,李砷,牟志勇,陸思予,艾連中,夏永軍,王應洋,趙志偉,王雨馨,楊昳津

(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海, 200093)

非釀酒酵母(non-Saccharomycesyeasts),指的是除釀酒酵母屬(Saccharomyces)之外的酵母。在我國的釀酒和發酵工業中,“釀酒酵母”往往會被特指為Saccharomycescerevisiae,然而在國外酒類相關發酵的研究中,“釀酒酵母”泛指屬于Saccharomyces屬的酵母。因此,非釀酒酵母不僅涵蓋了Saccharomyces屬之內除Saccharomycescerevisiae外的其他酵母菌種,也包括了所有Saccharomyces屬之外的酵母,如有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora),畢赤酵母屬(Pichia),德巴利酵母屬(Debaryomyces)等[1-3]。它們普遍發酵能力弱,酒精耐受度低,還可能產生H2S、乙醛等影響酒產品風味的物質,在發現之初被科學家列為不良菌株[4]。近年來,有研究發現,部分非釀酒酵母不僅沒有損害酒的品質,還能通過在釀造過程中產生生物酶,利用發酵原料合成酯類、高級醇類等香氣化合物,增加風味復雜性,從而改善產品的最終風味[5]。葡萄酒是由非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵的典型酒種之一,其最終產品的風味品質受到非釀酒酵母的重要影響。季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniasporaguilliermondii)是葡萄酒發酵中最為豐富的非釀酒酵母,能顯著提高酒中乙酸酯及乙酯類物質的含量[6-7];異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)是酒中產生乙酸乙酯的主要非釀酒酵母菌株,能產生大量具有水果風味的酯和醇[8];德爾布有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)在釀造過程中能大幅度降低酒中的乙醇含量,同時增加酯類物質的含量[9];耐熱拉錢斯氏酵母(Lachanceathermotolerans)具有較好的產酸能力,可產生超過16 g/L的乳酸,從而顯著改變酒的pH值[10];美極梅奇酵母屬(Metschnikowiaspp.)能促進葡萄酒中高級醇和酯類物質的形成,還會降低揮發酚的含量,顯著影響酒的最終感官風味品質[11]。

除與釀酒酵母混合發酵改善釀造酒風味之外,部分非釀酒酵母還表現出單菌種發酵的潛力,但其發酵產品的效率、風味復雜性和釀造可控性都明顯低于同釀酒酵母的混合發酵[12]。非釀酒酵母-釀酒酵母混合發酵在保障發酵效率的同時,還能促進形成積極的風味,如花香、果香和堅果香[13-14],幫助調節釀造酒中生物胺(biogenic amines,BAs)、高級醇等成分的含量[11],提高最終產品的微生物穩定性[15]。因此,目前非釀酒酵母主要是與釀酒酵母以混合發酵的形式應用于酒類釀造。在葡萄酒、白酒、黃酒等釀造酒的傳統發酵過程中,往往存在著復雜的微生物區系。非釀酒酵母與其他微生物間的不同相互作用,如形成有利于雙方共同生長的協同作用,或是兩者相互抑制的營養競爭、或是產生嗜殺因子影響其他微生物生長等,都會對產品的最終風味造成巨大影響。因此,了解釀酒酵母與其他微生物間的相互作用,才能更好的將非釀酒酵母應用于酒類的混合發酵生產中,釀造出高品質的發酵酒。

非釀酒酵母在酒類釀造中的應用提高了產品風味多樣性的可能,利用非釀酒酵母進行混合發酵可為酒類新產品的研發提供支持,還能有效避免酒類市場產品風味的同質化現象。傳統釀造酒的發酵環境較復雜,微生物間的相互作用形式多樣,因此,本文從釀造酒的生產出發,綜述非釀酒酵母與發酵環境中其他微生物間的相互作用及其在釀造過程中的功能特性,并指出后續研究中可能存在的問題,為研究非釀酒酵母提高酒類感官風味的作用機制及開發多元化釀造酒的非釀酒酵母新菌株提供可參考的方向。

1 非釀酒酵母在酒類釀造過程中的微生物相互作用

在酒的釀造過程中,除釀酒酵母外,還有非釀酒酵母、乳酸菌、真菌等微生物的參與,它們之間都存在相互作用。目前,對釀酒酵母和乳酸菌間的相互作用已有了較多的研究,而非釀酒酵母與釀造酒中其他微生物的相互作用報道相對有限。乳酸菌作為影響釀造酒最終品質最重要的細菌,其與非釀酒酵母間的相互作用也逐漸被重視。但目前非釀酒酵母與釀酒酵母間的相互作用被認為是影響發酵酒品質最主要的因素,盡管二者間的相互作用機制尚不清晰,目前研究認為,影響非釀酒酵母-釀酒酵母間相互作用的主要因素有以下幾種:1)營養物質利用競爭;2)胞間接觸作用;3)代謝物的影響;4)合作及協同共生作用;5)群體感應等(圖1)。

圖1 釀酒酵母與非釀酒酵母相互作用的主要因素Fig.1 The main factors of interaction between Saccharomyces cerevisiae and non-Saccharomyces yeast

1.1 非釀酒酵母與釀酒酵母間的相互作用

非釀酒酵母發酵能力弱,酒精耐受度低,接種順序和方式的差異顯著影響著非釀酒酵母與釀酒酵母的相互作用強度及最終酒產品的品質。目前,人們廣泛采用的接種方式有同時接種與順序接種兩種策略[16]。同時接種是指非釀酒酵母和釀酒酵母混合后接種并進行發酵,順序接種則是指非釀酒酵母接種一段時間后,再接種釀酒酵母。

由于順序接種的發酵初期沒有釀酒酵母的競爭作用,非釀酒酵母有較長的時間發揮作用,使得最終酒產品普遍具有更佳的品質[17]。李甜等[16]利用非釀酒酵母進行同時接種發酵時發現,非釀酒酵母主要在發酵初期發揮作用,發酵的第 6～7天開始出現死亡現象。WANG等[11]發現在季也蒙有孢漢遜酵母與釀酒酵母的同時接種發酵中,釀酒酵母的全基因組轉錄水平響應始終受到抑制,處于低發酵活性。這可能是導致同時接種發酵效果普遍弱于順序接種發酵的主要原因。CHEN等[18]使用異常威克漢姆酵母同釀酒酵母分別進行同時接種和順序接種發酵米酒,從發酵產品的分析結果來看,同時接種發酵的產品具有較低的揮發性酸度、較多的風味物質種類和發酵香氣含量。但是,順序接種發酵比同時接種發酵更有利于改善米酒的風味和品質,順序接種發酵減少了硫醇,增加了高級醇、酯類、苯乙醇和萜烯類等發酵化合物。且順序接種發酵對醇和谷物風味成分的氣味活性調節效果更好,對米酒整體風味的協調性更好。因此,在現有研究中,人們往往優先選擇順序接種方式研究非釀酒酵母與釀酒酵母的相互作用。

1.1.1 營養物質競爭對非釀酒酵母-釀酒酵母相互作用的影響

營養物質的可利用性,尤其是氮源和維生素,決定了酒釀造過程中微生物種群動態、發酵動態以及副產物的形成[19]。同時,酵母菌的生長過程對營養物質有較高需求,碳源、氮源、水、無機鹽等缺一不可,其含量也會影響酵母菌的生長狀態,嚴重缺乏時會導致其死亡[20]。在非釀酒酵母和釀酒酵母的混合發酵中,營養物質的競爭是最早發生的相互作用。在順序接種發酵中,優先接種的非釀酒酵母會消耗一定的營養物質,影響后續接種的釀酒酵母對營養物質的獲取和利用,從而導致整個發酵過程變得緩慢[12]。酒精發酵的全過程中,非釀酒酵母同釀酒酵母的競爭中往往處于弱勢地位,這可能與釀酒酵母更適應發酵的環境有關,如不同的滲透壓、酒精濃度、氮源限制等,所以釀酒酵母的祖先能戰勝其他酵母而被人們發現并應用于發酵。

在非釀酒酵母[德爾布有孢圓酵母或葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)]與釀酒酵母的混合發酵中,釀酒酵母的應激反應、細胞復制相關基因[21]和糖途徑相關基因[22]有一定的過表達,說明非釀酒酵母與釀酒酵母對底物(碳源)的利用存在一定程度的競爭。相較于釀酒酵母,非釀酒酵母可以利用等量的碳源產生更少的乙醇、更多的甘油和琥珀酸,這種能力并不會因為共培養的物種數量增加而受到抑制[23],因此大部分非釀酒酵母具備降低酒產品乙醇水平的潛力。盡管酵母菌所需營養種類較多,但大多營養物質的吸收都受到氮源吸收效率的影響。非釀酒酵母(如耐熱拉錢斯氏酵母和德爾布有孢圓酵母)在生長、發酵曲線和氮同化偏好方面與釀酒酵母具有高度相似性,使得非釀酒酵母和釀酒酵母在混合發酵過程中極易發生氮源競爭[24]。因此,氮源成為非釀酒酵母和釀酒酵母相互作用體系中競爭的主要營養物質之一。CONTRERAS-RUIZ等[25]將不同來源的60株釀酒酵母分別與庫德里阿茲威酵母(Saccharomyceskudriavzevii)菌株同時接種進行微發酵,分析其對碳源和氮源的吸收情況。結果表明,競爭最激烈的釀酒酵母-庫德里阿茲威酵母組合中,釀酒酵母對氮源的吸收顯著加快,糖發酵速率減慢,與之前所研究的競爭中釀酒酵母糖途徑相關基因的過表達[22]有一定差異。這可能是因為,面對多種營養物質的競爭時,釀酒酵母會優先攝取與生長和繁殖相關的成分——氮源,所以從快速擴張轉向高效但較慢的擴張模式。

除碳源和氮源外,其他物質的吸收也或多或少地影響非釀酒酵母和釀酒酵母的共培養。O2的可用性強烈影響著非釀酒酵母的生存能力。不飽和脂肪酸和甾醇參與酵母菌的細胞膜合成,而它們的合成都需要O2的參與。耐熱拉錢斯氏酵母對溶解氧的消耗量非常迅速,當它與釀酒酵母進行順序接種發酵時,易造成發酵環境的較低溶解氧含量,會直接導致后續釀酒酵母的低生物量現象[26]。若將此類高耗氧菌株應用于預發酵階段,則可以有效預防氧化,充當生物保護劑。WINDHOLTZ等[27]篩選了一株具備高耗氧能力的美極梅奇酵母,其在預發酵階段成功抑制了醋酸菌(與葡萄酒腐敗有關)的種群水平,且該抑制作用不低于常使用的SO2保護劑。維生素和礦物質的充足性對釀酒酵母-非釀酒酵母的相互作用也會產生一定影響。硫胺素(維生素B1)參與了酵母菌生長中的多個代謝過程,通過補充外源硫胺素,才能確保最高的發酵效率。葡萄汁有孢漢遜酵母和檸檬形克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)可搶奪葡萄漿中的硫胺素,造成釀酒酵母的營養流失[28]。鋅元素也是影響酵母菌發酵性能的重要物質[29]。德爾布有孢圓酵母同釀酒酵母順序接種培養時,由于明顯的營養競爭作用往往會出現發酵過程中止或者減緩現象,ROCA-MESA等[30]通過聯合添加硫胺素、鋅和氨基酸,允許釀酒酵母在不接觸的情況下連續接種完成發酵。目前的研究表明,僅限制硫胺素不會造成釀酒酵母的發酵緩慢[28],其是否與氮源素的吸收有關還需進一步研究。

氮源作為酵母菌生長最重要的物質之一,影響著非釀酒酵母與釀酒酵母的共同培養結果。因此,篩選和培育能夠促進釀酒酵母氮源吸收,或氮源需求量低的非釀酒酵母,能有效降低二者間的負相互作用,甚至促進釀酒酵母的氮同化與種群擴張。

1.1.2 非釀酒酵母與釀酒酵母的合作與協同對釀造的影響

混合發酵中,兩種或多種酵母菌在同一體系中生長平衡,且未出現相互抑制的現象,稱為協同共生作用,這也是混合發酵工藝中的理想狀態。在保證自身正常生長的情況下,非釀酒酵母可將部分物質轉化為釀酒酵母能直接代謝的小分子,從而促進釀酒酵母的吸收與生長;非釀酒酵母還可降低發酵環境酸度,分解BAs,為釀酒酵母創造更有利的生存空間。

在德爾布有孢圓酵母和釀酒酵母同時接種發酵的長相思葡萄酒中,兩者能夠達到相同的種群數量,約為1×108CFU/mL,與各自單獨培養時數量相同,說明兩者間不存在相互抑制作用,并且混合發酵所得酒產品中的C6化合物,萜烯醇和2-苯乙醇的含量顯著提高,改善了酒的風味特征[17]。4-甲基-4-硫基戊烷-2-酮(4-methyl-4-sulfanylpentan-2-one,4MSP)和3-硫基己烷-1-醇(3-sulfanylhexan-1-ol,3SH)及其乙酸鹽3-硫基己基乙酸酯(3-sulfanylhexyl acetate,3SHA)是長相思葡萄酒中最重要的芳香化合物。在酒精發酵過程中,德爾布有孢圓酵母同化了谷硫?；绑w(Glut-3SH)和釋放半胱氨酸化偶聯物前體(Cys-3SH),兩種前體形式均可被釀酒酵母代謝轉化為3SH。相比于釀酒酵母/德爾布有孢圓酵母純發酵,協同發酵所得葡萄酒中的3SH和3SHA的總體水平顯著升高,說明兩者間具有良好的協同相互作用[31]。此外,李華敏等[32]也證明了德爾布有孢圓酵母和釀酒酵母在混合發酵過程中不存在相互抑制的關系,且德爾布有孢圓酵母能夠快速適應酒體環境,迅速增殖。使用該混合發酵組合發酵生產櫻桃酒,增強了產品的花香、果香和發酵香氣,進一步提高了香氣強度。耐熱拉錢斯氏酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)組合發酵生產葡萄酒時,蘋果酸可被耐熱拉錢斯氏酵母完全消耗,在不增加乙酸含量的情況下產生了較高含量的甘油和丙酮酸。這替代了傳統發酵中的蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation,MLF),增強了微生物穩定性,且產生了更低水平的BAs[33]。LUO等[34]基于代謝物和轉錄組學特征進一步揭示了釀酒酵母和粟酒裂殖酵母的相互作用。在兩者的混合發酵中,參與糖酵解途徑的相關基因下調,調節乙醇生產和編碼脂肪酸合成酶的基因上調,使得發酵速度減緩,乙酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、1-庚醇和苯乙醇等芳香化合物含量上升,豐富了產品的風味物質。

混合發酵是提高酒產品品質的有效途徑,但在現有研究中,大多數非釀酒酵母與釀酒酵母存在較大的環境(溫度、乙醇、酸堿度)耐受性差距,很難實現共存。非釀酒酵母-釀酒酵母的協同共生作用研究有待更加深入,開發可以共生發酵的非釀酒酵母-釀酒酵母組合,擴大共生數量,才能夠獲得風味更加多樣化,品質更高的產品。因此,未來還需進一步探索菌株共生的作用機制,以便設計更加合理的發酵環境。

1.1.3 代謝物質對非釀酒酵母-釀酒酵母相互作用的影響

酒精發酵過程中,酵母菌除將葡萄糖等底物轉化為乙醇外,還會代謝產生醛、酯、酚等芳香化合物及BAs、抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)等不利于其他微生物生長的成分。非釀酒酵母-釀酒酵母相互作用過程中各自產生的代謝底物都有可能影響另一方的生長和代謝。

乙醇是酒精發酵過程中的主產物,能抑制酵母菌的生長與活力,抑制強度也會隨著乙醇濃度的升高而增強。大多數非釀酒酵母對SO2和乙醇的抗性較低,在葡萄酒釀造工業中往往受到釀酒酵母接種的抑制[35]。釀酒酵母發酵產生乙醇,當濃度積累到一定程度時,易使非釀酒酵母細胞組織和通透性改變,細胞質膜流動性下降,營養吸收進程減緩或延遲,導致其生長發育受到抑制[19]。釀酒酵母在酒精發酵過程中還會分泌AMPs,它們對多種酵母[如布魯塞爾酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)]和細菌[如酒酒球菌(Oenococcusoeni)]具有活性。葡萄酒發酵過程中,釀酒酵母將AMPs排入培養基中,在指數生長期(24～48 h)結束時誘導非釀酒酵母死亡。而對部分免疫AMPs的非釀酒酵母來說,AMPs也能為其創造更好的生存空間。

非釀酒酵母能產生某些物質為釀酒酵母創造更適宜的發酵環境。美極梅奇酵母能產生鐵螯合劑普切明酸——一種具有抗真菌活性的不溶性紅色素,能與微生物競爭鐵元素,從而抑制相關微生物的生長[36]。普切明酸對熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、白假絲酵母(Candidaalbicans)、酒香酵母屬(Brettanomyces)、德克酵母屬(Dekkera)、有孢漢遜酵母屬、畢赤酵母屬(Pichia)和部分真菌[灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、青霉屬(Penicillium)、鏈格孢屬(Alternaria)、叢梗孢屬(Monilia)]都表現出有效的抑制活性,但是釀酒酵母不受其影響[37-38]。

BAs是一類低分子質量的含氮化合物,人過量攝入會導致頭痛、呼吸窘迫、高血壓、嘔吐和各種過敏癥狀[39]。在葡萄酒的酒精發酵、MLF和陳釀過程中,都會形成一定量的BAs[8]。通過非釀酒酵母直接或間接降低BAs的含量是目前的研究熱點。漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii) H525雖然對乙醇的耐受性較低,無法直接應用于與釀酒酵母的混合發酵,但是其具有較好的胺氧化酶活性,對生長和休眠細胞的BAs代謝具有廣泛的影響,值得進一步研究[40]。使用粟酒裂殖酵母與耐熱拉錢斯氏酵母可以有效替代傳統釀造中的MLF過程(粟酒裂殖酵母代謝蘋果酸,耐熱拉錢斯氏酵母產生乳酸)[15],從而有效降低酒產品中的BAs含量。

由于技術和經濟等原因,大多數酵母菌參與的酒精發酵都無法在無菌環境下進行,存在較大的污染風險。AMPs的研究可以在創造良好發酵環境中發揮重要作用。BAs作為一類含氮化合物,抑制其形成過程是最直接有效的方式,但目前沒有研究報道相關技術被應用于工業生產中,可能存在降解效率低等問題?？梢試L試在酒產品的陳釀過程中,利用微生物進行降解以達到控制其含量的效果。

1.1.4 胞間接觸對非釀酒酵母-釀酒酵母相互作用的影響

在固定的空間中,不同的微生物間會不可避免地發生物理接觸,隨著種群密度的增加,這種接觸可能會帶來一定的負面作用。在釀酒酵母與非釀酒酵母的同時接種發酵中,非釀酒酵母在早期呈現指數型死亡的現象,主導地位逐漸由釀酒酵母替代,主要原因是非釀酒酵母較低的乙醇耐受性[41]。但NISSEN等[42]證明,耐熱拉錢斯氏酵母、德爾布有孢圓酵母在混合發酵早期的死亡,主要是由于其與釀酒酵母在高細胞密度下的細胞接觸作用導致的。LUYT等[43]將耐熱拉錢斯氏酵母與釀酒酵母進行混合發酵(物理接觸)同膜分離(無細胞接觸)的混合發酵對比,發現物理接觸大大降低了耐熱拉錢斯氏酵母的活力,并提前了細胞的死亡時間,說明細胞接觸對非釀酒酵母與釀酒酵母的相互作用產生了負面影響。轉錄分析結果顯示,在混合發酵中,釀酒酵母通過上調PAU基因(能提供對殺傷性毒素的保護)來加強競爭力,耐熱拉錢斯氏酵母則顯著上調了葡萄糖和幾丁質生物發生、組裝和維持的基因以增強和穩定細胞壁,降低外界刺激[44]。

細胞間的直接接觸會對非釀酒酵母產生直接的抑制作用,同時,釀酒酵母也可能產生有毒化合物影響非釀酒酵母的生長。因此,在將來的研究過程中,嘗試使用膜生物反應器、透析管等工具可有效避免細胞間的直接接觸及有毒化合物的影響,以穩定二者間的相互作用,提升釀造酒的發酵品質。

1.1.5 群體感應對非釀酒酵母-釀酒酵母相互作用的影響

群體感應是廣泛存在于微生物間的交流方式,不同于人類所使用的“語言”,微生物通過分泌群體感應分子(quorum sensing molecules,QSM)來進行交流和協調群體行為。交流過程至少包括4個要素:傳遞信號的酵母、信號、接受信號的酵母及其作出的生理反應[45]?，F有研究中,已發現的真菌QSM有色醇、苯乙醇、法尼醇、酪醇和法尼酸5種物質[46]。王琮杰[47]使用產2-苯乙醇的非釀酒酵母與釀酒酵母進行順序發酵,在確保兩者存在群體感應的前提下,發現2-苯乙醇的合成具有細胞依賴性,合成速率變化曲線呈鐘形。非釀酒酵母可以誘導釀酒酵母2-苯乙醇相關基因的表達上調,且終產物中甘油含量上升,乙醇含量顯著下調。除了“交流”調節產物產量外,還有研究發現“交流”能夠提升非釀酒酵母的環境耐受性。在酪醇的作用下,釀酒酵母、異常威克漢姆酵母、熱帶假絲酵母和光滑念珠菌(Candidaglabrata)都對重金屬有了更強的耐受性,提高了發酵產物的品質[48]。若能增強非釀酒酵母對高濃度乙醇和低溫等發酵條件的耐受性,可以有效延長非釀酒酵母的停留時間以提高貢獻。

非釀酒酵母領域中關于QSM的研究還很有限,考慮到釀酒酵母與非釀酒酵母在生長、發酵曲線和氮同化偏好等方面具有的高度相似性,可以參考現有關于釀酒酵母QSM的研究?，F有研究已經證明可以通過添加外源QSM(2-苯乙醇、色醇和酪醇)提高酒中乙醇含量,實現了操控天然生物控制系統來控制釀酒酵母的產物及產量[49]。若能通過添加外源QSM來加強非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵時的“交流”,可以增強發酵過程的穩定性和可控性,提高醇酯水平。

1.2 非釀酒酵母與乳酸菌間的相互作用

葡萄酒發酵中,乳酸菌引發的MLF過程是葡萄酒釀造的次級發酵,對于釀造優質紅葡萄酒來說尤其重要。MLF過程不僅可以降低葡萄酒的酸澀感和粗糙感,使之柔和、圓潤,還能提高葡萄酒的感官質量和生物穩定性。但是,乳酸菌能將L-蘋果酸酶解羧化為L-乳酸和CO2[50],使得發酵環境pH值增加,乙醇濃度上升,不利于大部分微生物的生長[51],包括非釀酒酵母。同時,酵母菌能影響SO2、乙醇、酚類化合物和低營養物質含量的變化并產生一定濃度的BAs,對乳酸菌的生長和MLF過程產生負面影響,最終影響葡萄酒的品質。

德爾布有孢圓酵母和美極梅奇酵母等非釀酒酵母在葡萄酒中釋放甘露糖蛋白,可以被一些乳酸菌利用水解,提高培養基的營養成分,對酒酒球菌和MLF過程產生積極影響[52]。德爾布有孢圓酵母和美極梅奇酵母的參與還能降低酒精發酵末端SO2和中碳鏈脂肪酸濃度,提供了比釀酒酵母純發酵更有利的MLF條件[53]。DU PLESSIS等[54]使用葡萄汁有孢漢遜酵母、釀酒酵母和酒酒球菌同時發酵葡萄酒,促進了酒酒球菌的生長并縮短了葡萄酒的MLF周期,葡萄汁有孢漢遜酵母和酒酒球菌采用順序接種還可增加葡萄酒的香氣豐度。焦媛媛[55]使用庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)發酵出具有優良口感和風味的低醇梨酒,并發現兩者具有潛在的共生關系。相比于酵母菌,乳酸菌通常具有更復雜的營養需求。乳酸菌與非釀酒酵母的混合接種易刺激非釀酒酵母的營養物質吸收和代謝,這可能導致乳酸菌的營養缺乏[56]。

目前關于非釀酒酵母-乳酸菌相互作用的研究大多基于葡萄酒的發酵過程,無法排除釀酒酵母對兩者的共同影響。但總體來看,使用篩選過的非釀酒酵母能夠有效改善乳酸菌的生長環境及其引導的MLF過程。

2 非釀酒酵母在酒類釀造過程中的功能特性

用于酒精發酵的酵母菌一般來源于發酵底物的自然環境,如葡萄酒發酵的微生物主要來源于葡萄果皮表面及果園。自然發酵除釀酒酵母外,還有多種非釀酒酵母的參與,相較于純種發酵的葡萄酒具有更復雜的風味和營養物質。非釀酒酵母具有某些釀酒酵母所不具備的酶學特征,可以促進大分子物質的分解及轉化,還有望改善葡萄酒的工藝過程及發酵品質,如提升發酵速率,降低乙醇含量,提高醛、酯、酚等風味成分的水平。

2.1 降低產品的乙醇含量

由于地理環境差異,部分產區的葡萄成熟度較高,易造成發酵過程中乙醇含量快速積累并維持在較高水平,不利于酵母菌的生存與后續發酵[57]。近年來,市場對低乙醇含量產品的需求量持續上升,研發低酒度新產品十分必要。延遲成熟,降低漿果產量,減少花青素、可溶性固體和揮發性化合物含量等措施都能降低乙醇含量,但也會對葡萄酒有不同程度的負面影響[58-59]。使用微生物措施,則可以將負面影響降至最小,還能利用其來提高產品的香氣復雜性[60]。非釀酒酵母的低乙醇生成能力,使得其在開發低酒度產品中具有十分顯著的優勢。

耐熱拉錢斯氏酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母在與釀酒酵母的混合發酵中,各菌株的糖消耗量均低于釀酒酵母純發酵的平均消耗量,能產生較低的最終乙醇水平,體積分數約為0.2%～0.5%[15,61]。使用德爾布有孢圓酵母與釀酒酵母順序接種發酵,終產物的乙醇體積分數減少了0.48%～0.77%,并伴隨著乳酸和乙酸濃度的上升。當德爾布有孢圓酵母接種量為釀酒酵母的10倍(107個/mL)時,乙醇含量降幅最大[62]。澤普林假絲酵母(Candidazemplinina)和克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)可以利用麥汁發酵生產低乙醇啤酒,發酵成品都具有較好的感官特性[63-64]。

通常地,乙醇含量的下降往往會伴隨甘油和乙酸含量的增加。非釀酒酵母可以利用底物產生高濃度的不同于乙醇的代謝物,如甘油或丙酮酸,從而減少合成乙醇的原料。葡萄汁有孢漢遜酵母、耐熱拉錢斯氏酵母、美極梅奇酵母、拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)等可以進行純培養實現乙醇含量的下降,但實踐表明,這會出現發酵停滯的問題[62]。因此,非釀酒酵母與釀酒酵母的混合發酵是目前最有效的降低乙醇的方式,能夠確保發酵工藝的正常進行和產品的穩定性。

2.2 產酶能力

相比于釀酒酵母,非釀酒酵母能分泌多種有益于葡萄酒香氣形成的水解酶,如蛋白酶、果膠酶、β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase,BGLs)、β-木糖苷酶[65]、脂肪水解酶和纖維素酶等。因此,添加非釀酒酵母可以提高酒產品的芳香復雜性、甘油含量和顏色穩定性,并降低乙醇含量。

BGLs是一種纖維素水解酶,存在于葡萄等植物材料中,也能由一些微生物產生,它能水解結合于末端的糖苷鍵,與β-木糖苷酶參與萜烯的釋放,從而提高葡萄酒的芳香復雜性[66]。酵母菌和乳酸菌是釀酒過程中BGLs的主要來源[67]?，F代釀酒工藝常采用非釀酒酵母產生的BGLs,它是水解葡萄香氣前體物質增強葡萄酒風味的關鍵成分。HAN等[68]以9個地區44個葡萄園的葡萄為樣本,通過BGLs活性篩選出一株光滑念珠菌D18。結果顯示,該菌株能顯著增加葡萄酒中花香和果香的典型性和復雜性,具備在葡萄酒發酵中應用的潛力。另外,作為酵母細胞的胞外酶,不同菌株BGLs的產量及活性也會存在較大差異性。常見的不同非釀酒酵母產BGLs的酶活力見表1。TESTA等[71]篩選了共計196株季也蒙有孢漢遜酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母,發現季也蒙有孢漢遜酵母的BGLs、蛋白酶、酯酶等活性普遍優于葡萄汁有孢漢遜酵母。也有學者發現同種菌種的不同菌株之間也會存在明顯的差異,在其所篩選的漢遜德巴利酵母中,漢遜德巴利酵母4025具有較強的BGLs活性,而漢遜德巴利酵母533、6010、618、1和1M的BGLs活性則較低[73]。

表1 不同非釀酒酵母產β-葡萄糖苷酶的活力Table 1 Enzyme activity of β-D-glucosidase produced by different non-Saccharomyces yeast

果膠酶廣泛分布于高等植物和微生物中,可用于降解底物葡萄中的果膠,還能提高果汁產量,澄清和過濾葡萄酒,從葡萄皮中釋放顏色和風味化合物,對葡萄酒香氣產生積極貢獻[74]。龍舌蘭酒菌群含有多種類型的非釀酒酵母,是龍舌蘭果聚糖水解的新果聚糖酶和用于低聚果糖合成新酶的潛在來源。研究人員從其中分離出了新型的果糖酶和果糖基轉移酶,它們將被應用在果聚糖水解和益生元的工業生產中[75]。在接種非釀酒酵母[阿德利隱球菌(Cryptococcusadeliensis)、東方伊薩酵母和克魯維畢赤酵母]的紅葡萄酒中添加果膠后,可滴定酸度、乙酸、pH和D-半乳糖醛酸發生顯著的變化[76]。

關于非釀酒酵母產生的BGLs、木聚糖酶、果膠酶、纖維素酶等的研究和工藝應用較少,且大部分研究集中于BGLs。研究證明,非釀酒酵母所產酶具有很大的應用潛力,參考釀酒酵母產酶的研究,探索新型胞外酶和穩定的產酶非釀酒酵母是篩菌工作的重點。關于酶的研究,改善萜烯、硫醇、去甲異戊二烯和其前體等物質的釋放,能否有效解決產品中蛋白質、果膠引起的渾濁問題是研究重點。

2.3 產生風味物質

啤酒和葡萄酒等產品因其獨特且豐富的香氣深受消費者的喜愛,但僅靠現有產品是無法滿足市場需求的。非釀酒酵母對香氣的貢獻引起了廣大研究者的關注,如德爾布有孢圓酵母能提供草莓、獼猴桃和黑莓香氣,光滑念珠菌能提供瓊瑤漿典型性香氣,覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsiscrataegensis)和葡萄汁有孢漢遜酵母能提供甜香和花香等[77]。

釀造過程中,除釀酒酵母外,存在一大部分產脂的非釀酒酵母,它們利用乙醇、糖、醛等代謝物生產酯類物質,是酒產品中的主要呈香物質?？勰覐湍ゆ呓湍?Saccharomycopsisfibuligera)是目前研究較多的產酯酵母。SU等[78]將扣囊復膜孢酵母和釀酒酵母進行生物強化接種后用于小曲酒的發酵,與傳統發酵相比,成品的醇酯含量分別提高了42.5%和11.8%,醛酮和雜環化合物的含量分別下降了73.7%和77.1%。葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)也是一種在釀造工業中廣泛應用的產酯酵母,經過其強化的大曲,在發酵后期能產出更高含量的乙酸乙酯[79]。耐熱拉錢斯氏酵母能提高混合發酵時有益的芳香族分子濃度,包括乙酯、萜類化合物[80-81]以及甘油[82]。

同時,大多數非釀酒酵母可以產生更多的有機酸和多酚類物質,部分非釀酒酵母還具備調節和平衡能力[83]。酸度是影響果酒純正和清爽的重要參數,多酚類物質能影響酒產品的顏色和風味,并具有多種保健功能。LI等[84]就利用魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、拜耳接合酵母和異常威克漢姆酵母發酵出具有極低pH值和更高含量多酚的獼猴桃酒。LIU等[85]使用不同的釀酒酵母與德爾布有孢圓酵母共培養發酵獼猴桃酒,檢測到檸檬酸、L-蘋果酸和琥珀酸等有機酸含量升高。耐熱拉錢斯氏酵母和經過篩選的粟酒裂殖酵母菌株組合,能夠從蘋果酸的角度穩定葡萄酒,而不需要進行MLF[33],實現pH的穩定。拜耳接合酵母與釀酒酵母的順序接種發酵也通過降低蘋果酸含量產生積極作用,同時顯著提高了低乙醇獼猴桃酒中的總黃酮、總酚、部分單酚含量及抗氧化活性[86]。

風味是酒類產品最重要的指標之一,其豐度甚至決定著產品的優劣。上述研究證實了非釀酒酵母增加酒中脂、酸、酚類等風味成分的可能性,為未來的風味研究提供一定的參考。但是酒的風味通常還受多種因素的影響,如菌株的接種方式會影響風味物質的產生順序及含量,接種數量有利于增加風味的豐度,但可能影響菌株的生長情況。風味的評估也缺乏一套統一的評價方法,無法在不同研究間進行直接的對比評價。

3 結論和展望

非釀酒酵母曾被人們視為腐敗菌而被排除在酒精發酵的全過程?，F有研究充分證明,非釀酒酵母可以同釀酒酵母良好共存,并利于其生長和生產更優質的產品。非釀酒酵母與微生物相互作用的研究,有助于控制發酵環境,如控制pH、SO2、AMPs等,確保目的菌株的正常生長。在同釀酒酵母的混合發酵中,如何確保非釀酒酵母的持久性以實現貢獻最大化,如何確保不同時期不同菌株的主導地位及穩定發酵效率是保證非釀酒酵母用于酒類混合發酵的重點之一。使用特定裝置(如微膠囊、生物膜等)固定和保護非釀酒酵母以增強競爭力,有望達到弱化微生物間負相互作用的效果。優質的非釀酒酵母-釀酒酵母組合要求能夠降低終產品的乙醇水平,產生多種胞外酶降解大分子,還能產生(相較于釀酒酵母純發酵)新的醇、酯、醛等芳香化合物。除不斷篩選和培育外,嘗試應用多種已知的非釀酒酵母與釀酒酵母進行混合發酵,實現品質的疊加效果也是方法之一。另外,葡萄酒、黃酒等產品在發酵完成后會進行陳釀操作,部分非釀酒酵母具備降解醛、酯的能力,可以探索其在釀造酒陳釀過程中的應用。