蝦青素的功能及其微生物工程菌構建研究進展

黃廣文,黃明珠,2,劉斌,陳雪嵐,2*

1(江西師范大學 生命科學學院, 國家淡水魚加工技術研發專業中心,江西 南昌, 330027)2(江西師范大學 健康學院,江西 南昌, 330027)

蝦青素(astaxanthin)是一種具有酮式結構的類胡蘿卜素,β-胡蘿卜素與天然蝦青素結構大體一致,由一條長的共軛雙鍵碳鏈和兩端α-羥基酮的六元環組成,共軛雙鍵碳鏈是由4個異戊二烯結構組成。蝦青素的抗氧化能力是維生素E的550倍,β-胡蘿卜素的10倍。正因為蝦青素超強的抗氧化能力,可以去除因陽光或細胞老化產生的氧化自由基,從而保護人體的眼睛和皮膚,降低太陽輻射對人體的傷害,防止心臟的血管老化、預防癌癥和老年癡呆等。蝦青素在保健品、化妝品等領域有著廣泛的應用,這使得蝦青素的市場需求與日俱增。

目前,研究的主流方向是以微生物作為生產者,利用代謝工程手段獲得高產蝦青素的工程菌,常用的微生物有解脂耶氏酵母、大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌等。與化學合成法相比,微生物生產具有結構明確、副產物少、對環境無污染,培養時間短,生產成本價格低廉,可以在發酵罐中,以超高的密度進行培養等優勢。

本文綜述了蝦青素的生物功能及其應用、蝦青素的來源,并對蝦青素合成途徑及如何利用合成生物學提高微生物蝦青素積累的方法進行了詳細介紹,其目的是為蝦青素的高效合成研究提供一定的參考。

1 蝦青素的生物學功能及其應用

科研人員一直都在研究具有抗氧化成分的物質。從起初的維生素類物質,到第二代擁有抗氧化功效的物質,如β-胡蘿卜素、過氧化物歧化酶、輔酶Q10等,再到近年來較為熱門的第三代抗氧化物質,如葡萄籽、花青素、藍莓提取物、番茄紅素、綠茶素等。目前最新的抗氧化成分即為蝦青素,也是第四代抗氧化成分。蝦青素極強的抗氧化能力使其在醫藥、食品及養殖業等領域有廣泛的應用[1]。

1.1 醫藥中的應用

在人體視網膜中富含不飽和脂肪酸,中樞神經系統中同樣也富含不飽和脂肪酸,氧化產生的自由基非常容易使視網膜細胞和中樞神經系統發生過氧化導致機體損傷[2]。有研究表明,蝦青素因為具有非溶于水的特殊分子構造很容易穿過細胞膜和血腦屏障[3],通過強力清除氧化自由基,保護中樞神經系統,最終起到保護大腦的作用[4],有效治療由于氧化自由基引起的中樞神經系統損傷,如缺血再灌注損傷、脊髓損傷、帕金森綜合征等[5];通過直接清除掉細胞內的氧化自由基,可以有效增強細胞的再生能力,維持人體機能平衡,并且減少體內衰老細胞的積累,由內而外保護細胞和DNA的健康;清除體內細胞中的氧化自由基,防止損傷視網膜中的視桿細胞和視錐細胞[6]。另外,蝦青素治療視網膜黃斑變性的效果好于使用葉黃素治療的效果。蝦青素可克服因抗血小板藥物導致凝血功能的障礙,在美國,已經有公司將蝦青素作為藥物來研發,其目的是防止腦梗塞后再次梗塞[7]。

1.2 食品中的應用

脂溶性的蝦青素呈現出自然的艷麗紅色,具有著色力強、安全無害、用量不多、無異味、口感佳的特點,被廣泛用于保健品、食用油脂、冰淇淋、糖果及調料的著色等,尤其是含脂類較多的食品[8]。

蝦青素不僅充當優質色素,還因其增強免疫、抗衰老等[9-10]作用而充當保健品中的功能成分;因其極強的抗氧化性能,蝦青素能保持食品的營養成分不被破壞,從而充當了食品的保鮮、保味及保質成分[11]。在日本,蝦青素通常被看作一種功能性食品添加劑,常常用來浸泡水果、海藻和蔬菜,同時蝦青素也作為蔬菜的紅色染料來使用[12]。

1.3 養殖業中的應用

在水產養殖方面,將蝦青素作為激素可以促進魚卵受精,減少胚胎死亡率,加快個體生長,增加魚類成熟速度[13]。在魚餌料中添加產蝦青素的紅法夫酵母碎片,鮭魚和鱘魚食用餌料后,蝦青素通常會積累在魚類的皮膚和魚肉中,使魚呈現出紅色[14]。這些魚和不食用蝦青素的魚類相比,呈現出較鮮艷的色澤,營養豐富,口感更出色,在歐美市場很受消費者的喜愛。顯然,富含蝦青素的魚的價格也要比普通魚更昂貴。但由于極大的市場需求,鱘魚和鮭魚在歐美國家的養殖業發展仍然很迅速。蝦青素在紅鮭魚體內的含量要達到5～20 mg/kg鮮重,含有蝦青素濃度為40～150 mg/kg的餌料是紅鮭魚食用餌料的基本標準,這樣一來紅鮭魚每年需要的蝦青素可達數十萬噸,總價值超數億美元。我國的水產養殖業發展迅速,添加蝦青素的飼料生產高檔水產品,有著十分廣闊的前景[15]。

蝦青素不僅可以用在水產養殖中,也可以用在禽業養殖中。研究表明,在雞的飼料中加入2.95%的紅法夫酵母來補充蝦青素,蛋黃會因蝦青素的增加使其特征吸收峰從571 nm 紅移到593 nm,遠高于使用10.85%黃玉米為飼料的紅移,添加高濃度的黃玉米僅僅從571 nm紅移到575 nm[16]。添加了蝦青素的飼料能促進家禽的生長,提高家禽的產蛋率,肉禽的皮膚、腳、喙也都呈現出消費者喜愛的金黃色。蝦青素的添加能提高各種蛋和肉的商品價值。因此,蝦青素的使用能對養殖業經濟的發展起到有效的促進作用[17]。

2 蝦青素的來源

目前國內和國外制備蝦青素的方法有2類:一種是運用化學合成法獲得蝦青素?；瘜W合成法是利用化工原材料或角黃質、玉米黃質和葉黃素等類胡蘿卜素制備蝦青素;但是化學合成法副產物多,結構不明確,對環境不友好,其產品主要用做工業原料[18]。另一種方法是從藻類、酵母和水生動物中分離獲得天然蝦青素,這種來源獲取可以克服化學制備法的缺陷,且獲取的天然蝦青素可以作為食品添加劑使用[19]。

2.1 藻類生產蝦青素

隨著生物技術發展,微藻的應用范圍逐步從飼料向食品及藥品發展,從生產簡單的生物物質到生產有價值的產品邁進。如雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)[20]和杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)[21]可以合成蝦青素和蝦青素前體β-胡蘿卜素,藍藻(cyanobacteria)[22]通過引入外源蝦青素的基因也可以成為蝦青素的生產宿主。雨生紅球藻是一種單細胞淡水微藻[23],分布在全球許多水生環境中,被認為是最豐富且最有前途的天然蝦青素商業生產來源之一[24],成熟期其胞內蝦青素含量約占胞內類胡蘿卜素總量的90%[25],重量可以達細胞干重的7%[26]。杜氏鹽藻是一種生存在海洋中的藻類,能夠產生β-胡蘿卜素,可通過代謝工程手段改造杜氏鹽藻來合成蝦青素[21]。藍藻可以利用太陽能和CO2來合成有機物質,被認為是可再生的微生物細胞工廠,其特點是培養簡單、易于基因操作和相對明確的遺傳背景,通過代謝工程改造用來生產高價值的蝦青素[22]。

2.2 酵母生產蝦青素

除了藻類,蝦青素也能從酵母中合成。紅法夫酵母(Phaffiarhodozyma)[19]是一種耐寒擔子菌酵母。蝦青素是其主要合成的類胡蘿卜素。研究發現,在該菌中,蝦青素約占總類胡蘿卜素的84%[27],其可利用多種糖類作為碳源進行生長代謝,不需光照,培養時間短,可在發酵罐進行超高密度的培養;且該菌細胞含有17%的脂類物質,蝦青素是屬于脂溶性的,可以更加均勻地分布于細胞質中,有利于蝦青素在細胞內的儲存[19];酵母提取蝦青素后,其副產物含有豐富的蛋白質、酯類和維生素B等營養物質,可作為富含營養的飼料添加劑使用。

2.3 原核生物生產蝦青素

部分原核生物中亦存在蝦青素前體物質合成途徑,可以合成蝦青素前體β-胡蘿卜素、番茄紅素以及蝦青素前體異戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)。因為存在這些前體,添加外源蝦青素基因可以實現高產蝦青素。作為常用的外源基因表達宿主——大腸桿菌,大腸桿菌是應用最多、最成功的一種表達體系,大腸桿菌的遺傳背景很清晰,操作技術與培養條件相對簡單。將外源的蝦青素合成基因引入到大腸桿菌中,使大腸桿菌成功生產出蝦青素[28-29]。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是在20世紀50年代首次被發現的一種天然可以生產谷氨酸的革蘭氏陽性菌。近幾十年,已成為上百萬噸的各種氨基酸的生產菌株,用于飼料和食品工業中。谷氨酸棒桿菌可以合成番茄紅素,番茄紅素是蝦青素的前體物質,重組谷氨酸棒桿菌的末端工程可構建蝦青素合成途徑。因此,谷氨酸棒桿菌這種無毒的典型工業微生物具有生產蝦青素的巨大潛力[30]。

8.牛呼吸道合胞體病毒感染。剖檢可見肺出現彌漫性水腫或氣腫，間質性肺炎灶，并見大小不等的肝變區；繼發細菌性支氣管肺炎時，肺前腹側區域呈現暗紅色、堅實、有纖維素覆蓋和實變。

3 蝦青素合成途徑

上述不同來源菌種依靠其自身產蝦青素的能力遠遠不能滿足市場對蝦青素的需求。要實現高產,通常需要對微生物進行工程改造,改造的前提是要清晰了解其合成途徑。

生物生產蝦青素的過程可分成3個階段[19],第一階段稱為中心碳代謝循環階段(圖1-a),第二階段稱為蝦青素前體物質合成階段,蝦青素前體物質異戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的合成(圖1-b),第三階段為蝦青素合成階段(圖1-c)。

a-中心碳代謝循環階段。葡萄糖經過糖酵解和磷酸戊糖途徑生成甘油三磷酸(G3P)、丙酮酸(pyruvate)和乙酰輔酶A(acyl-CoA);b-蝦青素前體物質合成階段。MVA 途徑多存在于真核生物及古生菌。MEP 途徑常存在于植物及大多數細菌中;c-蝦青素合成階段。IPP和DMAPP作為類胡蘿卜素前體合成蝦青素圖1 蝦青素生物合成代謝路徑圖Fig.1 Astaxanthin bioanabolic pathway注:AcAcCoA,乙酰乙酰輔酶 A;HMG-CoA,羥甲基戊二酰輔酶A;Mevalonate,甲羥戊酸;Mevalonate-5P,甲羥戊酸-5-磷酸;Mevalonate-5PP,甲羥戊酸二磷酸;DXP,1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸鹽;CDP-ME,4-二磷酸胞基-2-甲基赤蘚糖醇;CDP-MEP,4-二磷酸胞苷基-2-甲基赤蘚糖醇2-磷酸酯;ME-cPP,2-甲基赤蘚糖醇2,4-環焦磷酸鹽;HMBPP,4-羥基-3-甲基丁-2-烯基焦磷酸鹽;GGPP,牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸;Phytoene,八氫番茄紅素; Lycopene,番茄紅素;β-Carotene,β-胡蘿卜素。

3.1 中心碳代謝循環階段

第一階段的中心碳代謝循環是生物通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑消耗葡萄糖和果糖等碳源,合成大量的甘油三磷酸(G3P)、丙酮酸(pyruvate)和乙酰輔酶A(acyl-CoA)[31]。作為蝦青素合成的碳源, 甘油三磷酸、丙酮酸和乙酰輔酶A將會合成IPP和DMAPP流入下一個合成蝦青素的途徑中[32]。部分乙酰輔酶A進入三羧酸循環,生成生物生存所必須的能量、糖類、脂類、氨基酸等物質。合成的ATP、NADPH等供能物質流向細胞代謝中,不僅為生物的生存提供了能量,也為蝦青素的合成提供了能量[33]。

3.2 蝦青素前體物質合成階段

第二階段是蝦青素的前體異戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸合成。甲羥戊酸途徑(mevalonate,MVA)和甲基赤藻糖醇磷酸(mevalonate pathway,MEP)途徑是IPP和 DMAPP合成的2種天然的合成途徑[33]。MVA途徑(圖1-b中綠色箭頭)主要存在于古生菌、酵母及少部分的革蘭氏陽性菌,也是這些生物體內形成 IPP的唯一途徑[34];MEP途徑則存在于藻類和大部分細菌中,在植物體內也有此途徑存在[35]。IPP和DMAPP可由細菌、藻類、酵母及植物中的 MVA途徑和 MEP途徑產生[36]。

在 MVA途徑中,乙酰輔酶A通過圖1中的6個蛋白酶:乙酰CoA-?；D移酶(acetyl-CoA acetyltransferase,AtoB)、3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA synthase,ERG13)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,tHMG1)、甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase,ERG12)、磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonatekinase,ERG8)和甲羥戊酸二磷酸脫羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MVD1)合成IPP[20]。通過異戊烯基焦磷酸異構酶異構化反應,IPP生成同分異構體DMAPP。

在MEP途徑(圖1-b中黃色箭頭)中,甘油三磷酸和丙酮酸分子經過縮合及異構化反應形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸酯(1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate,DXP),由1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)參與催化。MEP再與三磷酸胞苷偶聯后經過一系列的磷酸化反應形成 IPP,這些磷酸酶分別是D-核糖醇-5-磷酸胞苷轉移酶(D-ribitol-5-phosphate cytidylyltransferase,IspD)、4-(胞苷5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶[4-(cytidine 5′-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase,IspE]、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2,4-環二磷酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase,IspF)、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶[(E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase (flavodoxin),IspG]、4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase,IspH)。在異戊烯基焦磷酸異構酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)的作用下,IPP可與DMAPP互相轉化[37]。

3.3 蝦青素合成階段

第三階段是蝦青素的合成[38]。在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,CrtE)的作用下,IPP或DMAPP被催化成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸在八氫番茄紅素合酶(phytoene synthase,CrtB)和八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,CrtI)2種酶的催化下,縮合形成番茄紅素。番茄紅素在番茄紅素β-環化酶(lycopene beta-cyclase,CrtY)催化下合成蝦青素的前體 β-胡蘿卜素。合成蝦青素的最后一步在不同生物體內略有不同,但主要都是通過β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase,CrtZ)和β-胡蘿卜素酮醇酶(β-carotene ketolase,CrtW)催化β-胡蘿卜素來合成蝦青素的。

4 蝦青素合成細胞工廠的構建及構建策略

4.1 擴大前體池增加蝦青素產量

在蝦青素前體合成階段,MEP途徑和MVP途徑最終都可以合成蝦青素的2種前體物質IPP和DMAPP。HEIDER等[30]研究谷氨酸棒桿菌產蝦青素的過程中,將谷氨酸棒桿菌中的dxs單獨過表達,蝦青素前體物質中的番茄紅素產量達到0.08 mg/g DCW,相比較沒過表達dxs之前,番茄紅素產量增加了2倍,而單獨過表達idi的菌株同樣也可以使番茄紅素產量達到0.08 mg/g DCW,增加2倍的番茄紅素產量,但是在谷氨酸棒桿菌中同時過表達dxs和idi并沒有發現疊加的效果。由于idi負責IPP和DMAPP的相互轉化,在大部分生物中都以IPP為前體,在消耗完IPP后,idi活性越高,DMAPP轉化為IPP的速度就會越快,因此idi成為了MEP途徑中的一個限速酶,過表達idi可以減少2種前體之間的比例發生劇烈變化而影響蝦青素的合成。在過表達idi的基礎上構建了完整的蝦青素通路,蝦青素產量為0.1 mg/g DCW,由于產量較低,通過進一步過表達蝦青素合成基因crtE、crtB、crtI、crtY、crtW、crtZ,最終使蝦青素產量達到了1.2 mg/g DCW,除了打開限速酶的限速,擴大整體的代謝通量可以顯著增加蝦青素的最終產量。

引入外源的前體供應途徑可以增加IPP和DMAPP的產量,可以使蝦青素產量提高,以生產β-胡蘿卜素為例,MA等[41]在改造解脂耶氏酵母產β-胡蘿卜素的研究中引入外源的異戊烯醇利用途徑(isopentenol utilization pathway,IUP),表達膽堿激酶(choline kinase,CK)和異戊烯基磷酸激酶(isopentenyl phosphate kinase,IPK),IUP 途徑以異戊烯醇的同分異構體異戊二烯醇或戊烯醇為底物,經過兩步磷酸化酶反應有效地增加了蝦青素前體IPP和DMAPP,最終使解脂耶氏酵母的β-胡蘿卜素產量從3.43 g/L增加到4.22 g/L,β-胡蘿卜素作為蝦青素合成前體,其β-胡蘿卜素產量的提高對于蝦青素產量的增加具有指導意義。

XIE等[42]在解脂耶氏酵母產β-胡蘿卜素的研究中發現番茄紅素底物抑制作用,過量的番茄紅素抑制了番茄紅素環化酶的活性,導致番茄紅素被積累,不能快速地轉化為β-胡蘿卜素,最終影響蝦青素的生產。XIE等[42]研究發現雙功能番茄紅素環化酶/八氫番茄紅素合成酶(bifunctional lycopene cyclase/phytoene synthase,CarRP)是一種雙功能酶,擁有番茄紅素環化酶活性的P區和番茄紅素β-環化酶活性的R區,將R區的序列進行隨機突變后,篩選出有效去除番茄紅素底物抑制的最佳突變位點Y27R,β-胡蘿卜素在類胡蘿卜素總量的占比從18%提升到了98%,有效地去除了番茄紅素底物抑制。他們還從另一種角度出發,在不去除番茄紅素底物抑制的情況下,用限制代謝流的方法緩解底物抑制,控制番茄紅素前體GGPP生成的量,使番茄紅素生成的量低于觸發底物抑制水平的量,間接地去除了番茄紅素底物抑制,增加了β-胡蘿卜素的產量,最終通過發酵培養使其產量達到了39.5 g/L,比初始菌株提高了1 441倍,解除代謝中間體的反饋抑制效應,可以顯著提高蝦青素前體β-胡蘿卜素的產量,對蝦青素的生產同樣具有指導意義。

4.2 級聯酶增加反應速率

圖1顯示,從β-胡蘿卜素到蝦青素合成過程中要經歷7種中間產物[43],分別是海膽酮(echinenone)、角黃素(canthaxanthin)、金盞花紅素(adonirubin)、羥基海膽酮(hydroxyechinenone)、β-隱黃質(β-cryptoxanthin)、玉米黃質(zeaxanthin)、阿多尼紅素(adonixanthin)。如此多的中間產物生產線影響了蝦青素最終產量。為縮短中間產物與催化酶之間的距離, HENKE等[43]在谷氨酸棒桿菌產蝦青素的研究中使用了一種簡單的方法將酶連接在一起,即在β-胡蘿卜素羥化酶和β-胡蘿卜素酮醇酶之間連上一段Linker,拉近了酶與底物的距離,最終使蝦青素產量達到了3.1 mg/g DCW,相比改造前產量提高了7倍。

KANG等[44]在大腸桿菌產蝦青素的研究中采用Mi3(一種球狀蛋白籠)作為支架,將MVP途徑中的3個酶AtoB、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-synthase,HmgS)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase,HmgR)通過SpyCatcher和SpyTag固定在Mi3表面,使酶與底物的距離拉近。結果顯示,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導使最終蝦青素前體物質番茄紅素效價達151.6 mg/L,是原始菌株的8.5倍。SUN等[45]通過模仿模塊化聚酮合成酶(modular polyketide synthases,PKSs)在原核生物大腸桿菌中將蝦青素合成途徑中的酶進行組裝,拉近酶與底物的距離,減少中間產物的游離,發酵后蝦青素產量為16.9 mg/g DCW,是目前原核生物生產蝦青素的最高產量。

真核生物由于存在多種細胞器,使得細胞代謝涉及廣泛的串擾和復雜的調節機制,如MA等[46]在解脂耶氏酵母產蝦青素的研究中發現,脂溶性的β-胡蘿卜素隨著脂質合成從內質網轉移到脂質體,最后隨著游離脂肪酸轉移到過氧化物酶體中,這種現象會導致終產物產量低并形成不良副產物。MA等[46]將外源引入解脂耶氏酵母的β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ,來自雨生紅球藻)和β-胡蘿卜素酮醇酶(CrtW,來自副球菌)融合表達,再通過添加膜蛋白定位標簽的方式分別同時定位到內質網、脂質體和過氧化物酶體上,有效地解決了由細胞器隔離機制導致的底物和酶距離遠的問題,使解脂耶氏酵母在補料分批發酵中蝦青素產量為16.7 mg/g DCW,是目前真核生物生產蝦青素的最高產量。

5 結論

蝦青素具備極強的抗氧化功能,因而在食品營養、醫療保健、飼料等領域擁有非常大的應用價值和發展空間。近年來,蝦青素在市場上的需求量不斷加大,構建蝦青素合成細胞工廠生產蝦青素也備受關注。合成生物學技術的迅速發展也為蝦青素合成細胞工廠的構建提供了新的契機,為實現大規模的設計、開發、改造與應用蝦青素細胞工廠提供了更多可能。微生物合成蝦青素分為3個階段,分別為中心碳代謝循環階段、蝦青素前體物質合成階段和蝦青素合成階段。構建高產蝦青素的菌株,就要從這3個階段出發,綜合設計,通過打開限速酶的限速、擴大及平衡蝦青素前體池、采用多酶級聯等方法,及通過動態調控的方式來獲得更多的細胞工廠和更高的產量。

綜上所述,通過多種途徑對微生物進行代謝工程改造以提高蝦青素產量顯示出巨大的潛力,未來還會有更多的微生物會被開發作為蝦青素的生產宿主,從而逐步滿足市場的需求。