Fe2+螯合劑對羥脯氨酸發酵的影響

龔雨,李長庚,李旭,徐慶陽,3*

1(天津科技大學 生物工程學院,天津 300457)2(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室,天津 300457)3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室,天津 300457)

反式-4-羥基脯氨酸是一種常見的非標準蛋白質氨基酸,是動物結構蛋白(如膠原蛋白和彈性蛋白)的天然成分。在食品行業,反式-4-羥基脯氨酸具有的獨特風味,能夠改善果汁飲料風味,被用作增味劑[1]。在醫藥行業,可用于合成碳青霉烯類抗生素藥物[2]。并且還具備抗氧化等功能,在化妝品中也被廣泛使用[3]。反式-4羥基脯氨酸的廣泛用途使其近年來在世界范圍內的應用不斷增加。目前生產反式-4-羥基脯氨酸的主要方法分為蛋白水解法、化學合成法以及微生物發酵法3種[1,4]。蛋白水解法是指以蛋白質為原料經酸、堿或蛋白水解酶水解生成反式-4-羥基脯氨酸[4],化學合成法是采用具有對映選擇性合成法,經烷基化及水解反應得到。但成本高、過程復雜,而且造成嚴重的環境污染[5-6]。因此,近年來微生物發酵法成為了工業化生產反式-4羥基脯氨酸的主流方法[7]。

隨著生物技術的發展,對關鍵影響因子的探索被視作提高菌種發酵潛力的另一途徑。金屬離子常作為酶的輔因子及活性中心參與菌體的代謝活動。Fe2+是菌體生長、生產過程中必需的微量元素,起到電子轉移反應、基因調節、氧的結合和轉運等作用[8-9],它還是反式-4-羥基脯氨酸發酵過程中關鍵酶(脯氨酸羥化酶)的輔因子,參與脯氨酸的羥基化過程。脯氨酸羥化酶是一種α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶,是依賴單核非血紅素含鐵酶,發酵過程需要脯氨酸和α-酮戊二酸作為共同底物,Fe2+作為輔酶因子,分子氧作為供體[7,10]。但是目前微生物發酵生產常用的金屬離子大多以無機鹽的形式存在,例如Fe2(SO4)3、MnSO4、MgCl2等,在發酵時Fe2+不穩定,極易轉化成Fe3+,導致發酵過程Fe2+供應不足,造成反式-4-羥基脯氨酸的產量大大下降[11]。

金屬螯合劑廣泛應用于醫藥、化工、食品等領域。金屬離子與螯合劑能形成穩定螯合物,減少了金屬離子氧化作用的發生[12]。有研究報道金屬離子鰲合劑由于能和Fe、Co、Ni等金屬離子形成穩定的鰲合物從而可以大大提高它們的利用率,金屬螯合劑具有很強的穩定性,使得金屬離子的生物可利用性得到提高[13]。胡慶昊[14]通過實驗證實了金屬離子鰲合物的形成,使溶解性金屬離子濃度加倍。他以鎳離子為主要研究對象,通過采用向厭氧發酵系統中添加金屬離子螯合劑的方法,提高了金屬離子的生物可利用性,優化了甲烷菌的營養條件,甲烷菌發酵生產得到增強。劉小都[15]通過對3種金屬元素螯合劑的發酵優化,使色氨酸生產菌的菌體量及色氨酸產量大大提升。日常發酵生產中常面臨微量元素不能以充足量和有效的生物學形式存在,進而使底物的最大轉化率受到影響的問題,所以找到最適合羥脯氨酸發酵的Fe2+螯合劑是提高羥脯氨酸產量及轉化率的關鍵。

本實驗以實驗室前期構建的HYP-08為宿主菌株,分別添加甘氨酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵、富馬酸亞鐵、氯化亞鐵、硫酸亞鐵等Fe2+螯合劑,來探究Fe2+螯合劑對羥脯氨酸發酵的影響。氨基酸發酵生產常采用一次性添加培養基的方法,但前期過高的Fe2+對菌體生長并非有利,會對其產生毒副作用,還會造成浪費,因此,本實驗在發酵優化時設計3種Fe2+螯合劑的添加方式來探究最適發酵工藝,最終菌體生物量、羥脯氨酸產量、轉化率、發酵周期均得到了較大的提升。對其他α-酮戊二酸依賴型加氧酶的氨基酸的發酵生產具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

HYP-08[16],天津科技大學代謝工程實驗室。

1.2 培養基

種子培養基(g/L):葡萄糖30,檸檬酸0.8,酵母粉6.0,(NH4)2SO43.0,MgSO4·7H2O 0.4, MnSO45.0 mg/L,維生素B(1.3.5.12)0.5 mg/L,微混1.0 mL/L,谷氨酸0.5,蛋氨酸0.5,α-酮戊二酸2.0,維生素C 1.0。

發酵培養基(g/L):葡萄糖30,檸檬酸0.8,酵母粉2.0,(NH4)2SO43.0,MgSO4·7H2O 0.4, MnSO45.0 mg/L,維生素B(1.3.5.12)0.5 mg/L,微混1.0 mL/L,谷氨酸 1.5,蛋氨酸0.5,α-酮戊二酸2.0,維生素C 2.0。

1.3 儀器與設備

722G紫外分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;5 L自動控制發酵罐,上海保興生物設備工程有限公司;Agilent1200高效液相色譜儀,日本島津公司;SBA-40ES生物傳感分析儀,濟南延和生物科技有限公司。

1.4 培養方法

1.4.1 菌種活化

二代活化:將菌種從甘油管中接到斜面培養基中活化培養12 h;將斜面培養基上的菌株接入到茄形瓶中進行二次傳代培養12 h[17]。

1.4.2 搖瓶發酵培養

采用500 mL擋板瓶,接種量10%,總發酵體系為30 mL,以苯酚紅作酸堿指示劑,過程使用注射器注射氨水調節pH,培養36 h[18]。

1.4.3 5 L發酵罐培養

1.4.3.1 種子培養

種子罐發酵液體積為2 L,發酵溫度為37 ℃,攪拌轉速200 r/min,溶氧30%左右,通過流加25%(體積分數,下同)氨水維持發酵液pH 7.0左右,當OD600nm>20時接種發酵[19]。

1.4.3.2 發酵培養

接種量為20%～30%,發酵溫度37 ℃,攪拌轉速200 r/min,溶氧30%左右,通過流加25%氨水維持發酵液pH 7.0左右。

1.5 檢測與分析方法

1.5.1 pH、溶氧(dissolved oxygen,DO)、溫度值測定

發酵過程中的pH、溶氧、溫度通過發酵罐的智能檢測系統實時檢測,并通過pH試紙進行實測,已實現更為精準的發酵過程控制[18]。

1.5.2 菌體量測定方法

發酵過程中每2 h取1次樣,取樣稀釋一定倍數之后,分光光度計(600 nm處)測定菌體量。

1.5.3 羥脯氨酸及副產物測定

發酵液羥脯氨酸、脯氨酸產量采用高效液相色譜儀測定,乙酸通過Agilent 1200高效液相色譜儀測定,谷氨酸檢測采用生物傳感分析儀測定。

1.6 糖酸轉化率(saccharic acid convert ratio,SA)測定

SA計算如公式(1)所示,為保證數據的準確性,每個數據取3次平行實驗的平均值。

(1)

式中:m,產物質量濃度,g/L;V,發酵液體積,L;M,添加糖的總量,g。

1.7 實驗方法

1.7.1 Fe2+螯合劑添加種類及添加量的測定

保證其他營養條件及發酵條件一致的前提下,按照表1所示的5種不同種類的Fe2+螯合劑,進行梯度實驗,并設置3組平行。

表1 Fe2+螯合劑實驗批次及添加量 單位:mg/L

1.7.2 5 L發酵罐中葡萄糖酸亞鐵添加方式優化實驗

設計3種添加策略(表2),總的葡萄糖酸亞鐵添加量均為31.87 mg/L。

表2 葡萄糖酸亞鐵的添加方式Table 2 Addition method of ferrous gluconate

2 結果與分析

2.1 Fe2+螯合劑及其濃度對羥脯氨酸合成的影響

有機鐵離子鹽相較于無機鐵離子鹽具有較強穩定性,本研究選用了甘氨酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵、富馬酸亞鐵、氯化亞鐵、硫酸亞鐵等Fe2+螯合劑,以期能夠更好地加強脯氨酸羥化酶的表達能力,提高菌株性能。

圖1-a顯示了Fe2+螯合劑及添加量在生物量方面的影響,與對照組相比,Fe2+螯合劑添加后的生物量都有所提高,添加有機Fe2+螯合劑的生物量明顯高于添加Fe2+無機鹽的生物量。其中甘氨酸亞鐵對菌體生物量影響最大,在不添加Fe2+螯合劑時,生物量僅有47.2,甘酸亞鐵添加量為7.28 mg/L時,羥脯氨酸OD600達最大值67.3,較不添加增長了26%,但是隨著添加量的增加,菌體生物量呈下降趨勢。通過分析,無機微量元素會對菌體內環境酸堿平衡及pH值造成影響,且無機鹽過多時會與其他金屬離子產生拮抗作用[11]。甘氨酸亞鐵在菌體內能自我調控螯合結構的解離和形成,以此來控制細胞內Fe2+濃度,使其在正常范圍內緩沖,并節省了吸收無機鐵所須的大量復雜的生化過程,大大提高了鐵元素的利用率[9]。且甘氨酸螯合鐵能提供甘酸和Fe2+雙重營養因素,協同提供營養,具有營養強化劑的功效,因此有效地提高了菌體的生物活性,菌體量大幅度上升[11]。但菌體不能吸收過多的Fe2+,過量的Fe2+會對菌體產生毒副作用[20],導致超過最適濃度時菌體生物量大大降低。因此,菌體生長前期只需要少量的Fe2+即可滿足菌體生長需求。

a-生物量;b-產量;c-轉化率

圖1-b和圖1-c顯示了Fe2+螯合劑及添加量在產量和轉化率方面的影響。

由圖1-b可知,添加FeSO4和FeCl2時最高產量為24.6、24.1 g/L,均低于添加其他Fe2+螯合劑時的最高產量,分析原因是發酵過程中以游離的Fe2+形式存在,極易被氧化為Fe3+失去活性,導致反應過程中Fe2+供應不足,培養基中添加少量維生素C可改善此情況,因維生素C具有較強還原性[21],且促進Fe2+吸收。但有機Fe2+螯合劑能在發酵過程中保持穩定的化學性質,因此能提供較充足的Fe2+,其還具有較高的生物學效價[22]。添加葡萄糖酸亞鐵時產量及轉化率最高,當無外源添加Fe2+螯合劑時,羥脯氨酸產量僅有20.3 g/L,轉化率為18.80%,隨著葡萄糖酸亞鐵添加量增長至31.87 mg/L時,羥脯氨酸產量和糖酸轉化率達到最高,分別為30.81 g/L和28.53%,遠高于對照組。分析原因為Fe2+與代謝過程中眾多酶的活性相關或起到激活作用,比如乙酰輔酶A,琥珀酸脫氫酶等[23],尤其是在脯氨酸羥化酶催化脯氨酸的過程中,需要Fe2+結合α-酮戊二酸,與此同時Fe2+發揮作用與底物作用發生羥基化反應[24],而葡萄糖酸亞鐵由還原鐵中和葡萄糖酸而成,生物利用率高[25]。葡萄糖酸亞鐵通過基團轉運進入細胞,再根據不同組織的需求分解為葡萄糖和Fe2+,因此能更好地滿足細胞生長和生產的需求。但是過多時產量和轉化率出現了下降,對菌體產生了毒害作用,進而抑制了生長。因此,只有在添加最適的葡萄糖酸亞鐵濃度時,才能保證菌體的生長和生產性能達到最高。

2.2 發酵罐驗證實驗

上述實驗確定了最適合羥脯氨酸發酵的Fe2+螯合劑為葡萄糖酸亞鐵,添加量為31.87 mg/L時效果最好,以優化前添加FeSO4為對照組,以添加葡萄糖酸亞鐵為實驗組,驗證前期實驗結果。

如圖2所示,優化后實驗組菌體生物量最高達134.2,對照組菌體生物量為108.7,優化后較原始培養基提高了23.4%,整個發酵過程中,實驗組菌體生長速率一直高于對照組;并且在羥脯氨酸產量方面也有很大影響,在16～36 h,羥脯氨酸產量增長趨勢明顯,當發酵44 h時產量積累量為101.5 g/L,遠高于對照組的88.6 g/L,優化后培養基較大提升了羥脯氨酸產量。但菌體發酵后期出現的活性降低、產酸率下降等問題仍需解決,因此下一步進行葡萄糖酸亞鐵添加方式優化實驗,進一步提高羥脯氨酸產量。

圖2 優化前后在5 L發酵罐中對比Fig.2 Comparison in 5 L fermentor before and after optimization

2.3 添加方式對羥脯氨酸發酵產酸的影響

通過上述實驗選出了最適的Fe2+螯合劑及最適濃度,但原始的葡萄糖酸亞鐵添加方式會導致前期Fe2+濃度過高,對菌體產生毒害作用,后期又供應不足,進而選擇3種添加方式,對羥脯氨酸發酵進行優化實驗,以達到實驗預期。

2.3.1 添加方式對羥脯氨酸生物量、產量及糖酸轉化率的影響

為探究整個發酵過程中罐內最有利于提高產量及合成速率的葡萄糖酸亞鐵濃度,設計了優化葡萄糖酸亞鐵添加工藝,考慮到葡萄糖酸亞鐵對脯氨酸羥基化過程起到的關鍵作用,因此整個發酵過程中對其含量控制是至關重要的一步。按照1.7.2節中葡萄糖酸亞鐵的添加策略A、B、C,進行發酵對比實驗,結果如圖3所示。

圖3 不同葡萄糖酸亞鐵添加方式對生物量、羥脯氨酸產量和糖酸轉化率的影響Fig.3 Effects of different glucose ferrous addition methods on cell weight, hydroxyproline yield and sugar-acid conversion rate

如圖3可知,3種葡萄糖酸亞鐵添加策略對菌體生長和產酸都有較大的影響,添加策略C中生物量、產量及糖酸轉化率最高。通過對比可得,A添加方式一次性全部添加,因此發酵前期Fe2+供應充足,生長速率較快,但隨著發酵培養基底物中葡萄糖酸亞鐵濃度的降低,菌體對數生長期逐漸延后,后期生長狀態較差,最終OD600值為115.3,產量和轉化率分別為102.3和17.6%。添加策略B較A有明顯上升,結果表明補料添加使菌體量增長速度大大提升,在產量和糖酸轉化率方面也有明顯增幅,OD600值和產量分別為129.3、106.4 g/L,較方式 A 分別提高了12.0%和4.0%,添加方式 C會使發酵過程中Fe2+維持在相對穩定的濃度,為脯氨酸羥化酶提供足夠的動力,最后在生物量產量及糖酸轉化率方面都顯示出明顯的優勢,最終菌體生物量(OD600值)達到了146.2,比添加方式A和添加方式B分別提高了26.7%和13.1%,最終的羥脯氨酸產量為118.6 g/L,糖酸轉化率為20.4%。

2.3.2 添加方式對耗糖速率和生長速率的影響

由圖4可知,3組添加方式在生長前期耗糖速率都有迅速提升,策略C的耗糖速率整體趨勢較為穩定,發酵28 h時耗糖速率最高達到12.1 g/(h·L),策略A和B達到發酵中期后,耗糖速率出現明顯下降,穩定期縮短,菌體活性大大降低,這與生物量總體變化趨勢完全一致。對羥脯氨酸合成速率進行分析,3組均在20～28 h達到最大合成速率,C組最大合成速率為4.3 g/(h·L),明顯高于另外2組,且趨勢較為平穩,因此,添加策略C能使發酵過程中Fe2+維持較為穩定的水平,為菌體前期生長及后期羥基化過程提供充足的Fe2+。

圖4 不同葡萄糖酸亞鐵添加方式對菌體耗糖速率和羥脯氨酸合成速率的影響Fig.4 Effects of different glucose ferrous addition methods on sugar consumption rate and hydroxyproline synthesis rate of bacteria

2.3.3 添加方式對羥脯氨酸發酵副產物的影響

乙酸是氨基酸代謝中常見的副產物,而谷氨酸和脯氨酸為羥脯氨酸發酵過程中的前體物質,側面反映了脯氨酸羥化酶的轉化能力,C添加方式乙酸最終含量為1.05 g/L,分別比方式A和方式B降低了38.0%和15.2%,C方式大大提高了脯氨酸羥化酶活性,使代謝流更多流向羥脯氨酸的合成。策略A和B兩種添加方式中,前體物質谷氨酸和脯氨酸含量較大,分析原因為發酵后期Fe2+含量較低,導致脯氨酸羥化酶活性降低,進而導致前體物質剩余較多(圖5)。

圖5 不同葡萄糖酸亞鐵添加方式對代謝副產物的影響Fig.5 Effects of different ferrous glucose addition methods on metabolic by-products

3 結論

菌體合成羥脯氨酸過程中需要充足的Fe2+,常見的Fe2+化合物在發酵過程中極易氧化,不能滿足菌體生長生產的需要。但葡萄糖酸亞鐵活性穩定,使大腸桿菌生產羥脯氨酸的最終生物量和產量均有明顯提高。通過對葡萄糖酸亞鐵添加方式的優化,羥脯氨酸產量和生物量最高分別達到118.6 g/L和146.2,糖酸轉化率為20.4%,副產物乙酸降低到1.05 g/L。這一結果為實現羥脯氨酸大規模生產提供了參考。