紡錘體毒物檢測新方法的建立和應用

鄭 璐，王 瓊

紡錘體毒物（SP）是一種非遺傳毒物，其作用終點并不是遺傳物質本身，而是細胞分裂中的紡錘體[1]。因而SP不能被現行的基因突變、染色體畸變試驗檢出，但SP與一般誘變劑的效應是相同的，最終會引發癌變等嚴重后果。由此，筆者根據SP的作用終點及其誘變效應，經過反復優化，建立了檢測SP的不同實驗方法。根據國內外文獻報道，選擇了偏二甲基肼、雌二醇、利血平、糖精、石棉、秋水仙堿為被檢物，它們均有確定的致癌性，但它們的短期致突變試驗均未獲得滿意的結果[2-4]。應用新建立的方法對其誘變活性進行了檢測，證明該方法靈敏可靠，從而為防止SP漏檢提供了實用、有效的檢測手段?，F將檢測工作報告如下。

1 紡錘體形態損傷的直接觀察

首先，借鑒國外先進的經驗摸索建立了分化染色技術[5，6]。該技術方法的創新點是用番紅和燦爛藍復合染液將有絲分裂細胞的染色體、細胞質、紡錘絲染成不同顏色，這樣在一個完整的細胞中同時顯示紡錘體和與之相連的染色體。用這種方法能較容易地分析大量的有絲分裂細胞，使得直接觀察紡錘體形態及損傷成為可能。應用該技術方法對所選擇的6種被檢物進行了檢測，隨著培養液中濃度的增加，各種形態異常的紡錘體明顯增加，呈現良好的劑量效應關系。高染毒量完全破壞了紡錘體結構。

2 誘發非整倍體的檢測

紡錘體損傷必然導致整條染色體丟失或增加，即誘發非整倍體。筆者用3種實驗方法對其進行了檢測。

2.1 完整中期細胞染色體計數法 這是根據非整倍體的定義而設計的。該方法的創新點之一：檢測目的性十分明確，通過直接計數染色體數目的變化來反映SP誘發非整倍體的活性。創新點之二：常規中期相標本制備中，低滲處理較強，破壞了細胞膜，造成染色體人為丟失。為了避免這種人為誤差，筆者采用了減弱低滲處理的實驗條件。對低滲濃度和處理時間進行了反復摸索，最終確定以0.094M（0.7%）KCL溶液低滲處理2～3 min的最佳實驗條件。獲得了細胞膜完整、細胞質背景清楚、染色體分散良好的中期相。保證了染色體計數結果的準確性。應用該方法對6種被檢物進行了檢測，觀察到CHL細胞染色體數目發生了明顯的變化，染色體數目增加和減少的發生概率相近，而且所形成的非整倍體多為增加或減少1條染色體。

2.2 胞質分裂阻滯微核（CBMN）試驗 紡錘體損傷誘發非整倍體的效應可用微核試驗來驗證。該技術方法的創新點在于使用了CBMN法：CHL培養物染毒的同時加入Cyt-B阻斷胞質分裂，第一次分裂細胞均形成雙核細胞，在分析時很容易識別，只計數雙核細胞的微核率，提高了試驗結果的準確性。CBMN試驗結果表明6種被檢物均誘導細胞微核率明顯增加。

2.3 流式細胞術測量 染色體數目的變化必然使細胞內DNA含量改變。用流式細胞術測定每個細胞的DNA含量，給出細胞周期各期所占比例 （G0/G1）和DNA信號的分散度（CV），從分子水平檢測到SP誘發非整倍體效應。

美、日、歐共體及我國現行的新藥臨床前致突變試驗組合中，仍沒有一項專門檢測SP的試驗。SP損傷紡錘體后會出現嚴重的遺傳效應，使染色體丟失，造成子細胞染色體數目的改變，產生非整倍體，使基因產物不平衡，引發癌癥等嚴重后果。建立有效的檢測SP試驗方法勢在必行。

3 結 論

應用分化染色技術方法直接觀察紡錘體形態損傷，雖然能檢測出秋水仙堿、糖精、雌二醇、石棉、硝酸鉛、偏二甲基肼的初始誘變作用，但這種實驗技術方法復雜，難度也較大[7]。CBMN試驗也獲得陽性結果，流式細胞術雖然也能檢出非整倍體的發生，但靈敏性不夠高[8]。完整中期細胞染色體計數可以直觀、準確地檢查出它們誘發染色體數目異常。且該實驗方法很簡便，在一般實驗室均可進行，因此筆者建議，將此方法推薦為篩檢SP的試驗方法。

[1]樓鐵拄，王 瓊，高沛永.偏二甲基肼誘發中國倉鼠肺細胞非整倍體[J].中國藥理與毒理學雜志，1997，11(4):304.

[2]高沛永，王 瓊，張學中，等.雌二醇誘發中國倉鼠肺細胞有絲分裂紡錘體損傷[J].中國藥理與毒理學雜志，1994，8(4):301-304.

[3]王 瓊 高沛永.偏二甲基肼誘發中國倉鼠肺細胞有絲分裂紡錘體損傷[J].中國藥理與毒理學雜志，1998，12(3)：239-240.

[4]Cliet I.Fournier E.Melcion C.Cordier A.In vivo micronucleus test using mouse hepatocytes[J].Mntat Res,1989,216(6):321-326.

[5]Salassidis K,Bauchingerg M.Mitotic spindle damage induced by 3,4-dichloroaniline in V97 Chinese hamster cell examined by differential staining of the spindle apparatus and chromosomes[J].Mutagenesis,1990,5(4):367-370.

[6]高沛永.在致突變試驗中應重視對紡錘體毒物的檢測[J].遺傳，1993，15(6):38-39.

[7]高沛永，王 瓊.硝酸鉛對CHL有絲分裂細胞紡錘體的損傷作用[J].衛生毒理雜志，1995，9(4):228-2230.

[8]高沛永，王 瓊.秋水仙堿引起CHL細胞有絲分裂紡錘體損傷的觀察[J].軍事醫學科學院院刊，1993，17(4):259-261.