金屬離子對羊血超氧化物歧化酶活性的影響

楊學山，楊孝樸，吳 兵，楊志杰

（甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州730070）

金屬離子對羊血超氧化物歧化酶活性的影響

楊學山，楊孝樸，吳 兵，楊志杰

（甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州730070）

以離子交換層析法制備的羊血SOD（Superoxide dismutase）為原料，加入不同濃度的Na+、K+、Ba2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+等金屬離子，25℃保溫4h后，利用鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活力，并計算相對酶活力。結果表明：不同金屬離子在不同濃度下對羊血SOD酶活的影響不同。Na+對SOD酶活影響不大；K+、Ca2+、Fe2+在體外對羊血SOD具有激活作用，且Fe2+作用明顯，相對酶活力可達378.98%；Ba2+、Mg2+在低濃度下對SOD影響不大，在高濃度下有一定的激活作用，但不同濃度激活效果不同；Zn2+、Cu2+在體外對羊血SOD表現有抑制作用，但二者的抑制程度不同。

超氧化物歧化酶，金屬離子，酶活力

1969年Mccord和Fridovich根據血銅蛋白、肝銅蛋白和腦銅蛋白皆有超氧負離子歧化活性，而將其命名為超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD EC1，15，1，1）［1］。SOD的作用底物是機體產生的超氧陰離子（Superoxideanions，O-2·），它可使超氧陰離子發生歧化反應生成過氧化氫和分子氧，從而促使超氧自由基分解，消除對機體的損害。所以SOD在一定程度上具有防止腫瘤發生、抗衰老、提高機體免疫力的作用，被用于某些急性炎癥、自身免疫性疾病、營養缺乏、腫瘤等的輔助治療［2］；SOD還可作為罐頭食品、果汁、啤酒等的抗氧化劑，防止過氧化酶引起的食品變質及腐敗現象；另外，還可將SOD作為營養強化劑加入食品中制成新的保健食品［3］?？茖W界預言，SOD將是全人類健康長壽的最新型酶制劑，會被廣泛用于食品、醫療、化妝品等領域。SOD是一種金屬酶，金屬離子對維持酶的分子結構及催化活性有重要作用，不同金屬離子對酶活性的影響不同［4］。研究金屬離子與酶活性的關系，有利于選擇合適的金屬離子作為佐劑或添加劑，提高SOD酶在醫藥衛生和食品方面的利用價值。本研究以羊血為原料，利用離子交換層析法分離純化SOD，并研究了不同金屬離子在體外對羊血SOD活性的影響，以期為羊血中SOD的進一步開發利用和提高產品品質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮羊血 采自蘭州小西湖屠宰場；乙醇、氯仿、丙酮、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、焦性沒食子酸（鄰苯三酚）、氯化鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鋇、硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化鈣等試劑均為分析純；牛血清白蛋白 購自上海試劑廠；DEAE-Sephadex A-50 購自pharmacia公司。

SL-1001電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；TGL-166臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PHS-828 pH計 成都全速科技有限公司；808型紫外與可見分光光度計 日立公司；BJQ-74-2型部分收集器，移液槍，真空泵，透析袋，磁力攪拌器等。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊血SOD分離純化工藝流程 羊血預處理→收集紅血球→制備粗酶液→丙酮沉淀→熱變性→透析→層析→活性測定→成品

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 羊血預處理 將收集的新鮮羊血去除毛等雜質，加入10.0g/L檸檬酸三鈉抗凝。

1.2.2.2 收集紅血球 取新鮮羊血，以5000r/min離心15min，收集紅血球沉淀；將紅血球加0.9%NaCl溶液，5000r/min離心10min，重復3次，得潔凈紅血球。

1.2.2.3 制備粗酶液 取潔凈紅血球100mL，加等量去離子水攪拌溶血，4℃放置12h。按溶血體積的0.25倍緩慢加入預冷至4℃的無水乙醇和氯仿，攪拌15min，靜置2h。離心除去血紅蛋白，上清即為粗酶液。

1.2.2.4 丙酮沉淀 將粗酶液加1.5倍體積的冷丙酮，靜置20min。5000r/min離心15min，收集沉淀物。

1.2.2.5 熱變性處理 將沉淀物加適量去離子水溶解，置60℃熱處理15min，5000r/min離心15min，除去熱變性蛋白，收集上清液。

1.2.2.6 透析 將上清液置于透析袋中，在磷酸鉀鹽緩沖液中動態透析6～8h。

1.2.2.7 DEAE-Sephadex A-50柱層析 將透析液小心加到已用磷酸鹽緩沖液平衡好的DEAE-Sephadex A-50柱，以流速0.5mL/min進行梯度洗脫。

1.2.2.8 活性測定 收集具有蛋白吸收峰部分的洗脫液，以牛血清白蛋白作標準曲線，采用考馬斯亮藍染色結合法測定蛋白質濃度［5］；以鄰苯三酚自氧化法測酶活力［6-7］。將比活力為6871U/mg的羊血 SOD提取液冷凍保存備用。

1.2.3 不同金屬離子處理SOD 在酶活力最佳溫度及底物濃度條件下，向2.0mL酶液中分別加入0.5mL的NaCl、K2SO4、BaCl2·2H2O、CaCl2、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和FeSO4·7H2O，各金屬離子濃度梯度分別為1×10-5、3×10-5、5×10-5、1×10-4、3×10-4、5×10-4、1×10-3mol/L，25℃保溫4h。以上操作平行處理5次。

1.2.4 不同金屬離子處理后SOD活力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性［6-7］，并以無金屬離子反應系統為對照，計算各種金屬離子存在下的相對酶活力。

2 結果與討論

2.1 Na+、K+對SOD活力的影響

將25℃保溫4h后測定的SOD酶活力換算成相對酶活力（以不加金屬離子時的酶活力為100計），實驗結果見圖1。

在酶液中加入不同濃度的氯化鈉后，SOD酶活力隨濃度的增加有輕微變化，當 Na+濃度為0.5mmol/L時，酶活力為對照的92.68%。其他濃度下酶活力有略微增加，但不明顯，說明Na+對羊血SOD酶活力影響不大。

在酶液中加入K+后，SOD酶活力上升，其中加入K+濃度達到0.03mmol/L時，酶活力為最大，相對酶活力為140.67%，酶活力提高近1.5倍。K+濃度在0.05～1mmol/L之間時，酶活力變化不大，相對酶活力保持在120%左右，說明K+對羊血SOD有一定激活作用。

圖1 Na+、K+對SOD活力的影響

2.2 Ba2+、Ca2+對SOD活力的影響

將25℃保溫4h后測定SOD酶活換算成相對酶活力（以不加金屬離子時的酶活力為100計），實驗結果見圖2。

圖2 Ba2+、Ca2+對SOD活力的影響

在酶液中加入低濃度的Ba2+后，對SOD有抑制作用，當加入的Ba2+濃度為0.03mmol/L時，相對酶活力為101.01%，超過0.03mmol/L時，酶活力開始上升，在0.3mmol/L時，相對酶活力為111.11%，并逐漸呈增加的趨勢，說明高濃度的Ba2+對羊血SOD有激活作用。

在酶液中加入不同濃度的Ca2+后，SOD酶活力總體略有上升，當加入的 Ca2+濃度為0.03mmol/L時，相對酶活力為140.67%，酶活力達到最大值；當加入的 Ca2+濃度為 0.1mmol/L時，相對酶活力為110.37%，酶活力為最小值，但相對酶活力仍大于100%，說明Ca2+對羊血SOD有激活作用。

2.3 Mg2+、Zn2+對SOD活力的影響

將25℃保溫4h后測定的SOD酶活力換算成相對酶活力（以不加金屬離子時的酶活力為100計），實驗結果見圖3。

圖3 Mg2+、Zn2+對SOD活力的影響

在酶液中加入不同濃度的Mg2+后，當Mg2+濃度在0.01～0.05mmol/L低濃度范圍內時，相對酶活力基本保持在100%，酶活力變化不大，而當Mg2+濃度在0.05～0.5mmol/L范圍內時，相對酶活力逐漸增加，當加入的Mg2+濃度為0.5mmol/L時，酶活力達到最大值，相對酶活力為 146.76%，但當 Mg2+濃度大于0.5mmol/L時，酶活力下降。說明適宜濃度的Mg2+對羊血SOD具有激活作用。

在酶液中加入不同濃度的Zn2+后，SOD酶活力都有下降，當加入的Zn2+濃度為0.3mmol/L時酶活力達到最小值，相對酶活力為64.49%，說明Zn2+對羊血SOD有抑制作用，且0.3mmol/L時抑制作用最明顯。

2.4 Cu2+、Fe2+對SOD活力的影響

將25℃保溫4h后測定SOD的酶活力換算成相對酶活力（以不加金屬離子時的酶活力為100計），實驗結果見圖4。

圖4 Cu2+、Fe2+對SOD活力的影響

在酶液中加入不同濃度的Cu2+后，SOD酶活力下降，當Cu2+濃度為0.01mmol/L時，酶活力達最小值，相對酶活力為49.78%，而當Cu2+濃度為1mmol/L時，相對酶活力為99.15%，基本不影響酶活力，說明不同濃度的Cu2+對羊血SOD的抑制作用不同，且濃度低的Cu2+對SOD抑制作用較大。

在酶液中加入不同濃度的Fe2+后，SOD酶活力明顯上升，當Fe2+的濃度為0.01～0.05mmol/L時，酶活力最大，且基本保持穩定，相對酶活力為378%左右，比對照酶活力提高3.8倍，隨著Fe2+濃度的增加，酶活力略有下降，當Fe2+濃度為1mmol/L時，相對酶活力為273.82%，說明Fe2+對羊血SOD有明顯的激活作用。

3 討論

酶要產生活性，必須有輔酶參與，已知許多金屬離子是酶或輔酶的組成成分［8］。不同的金屬離子對酶的影響有較大的差別，在有影響的金屬離子中，它們對酶的活力和功能所起的作用也不盡相同，同一種金屬離子對不同來源的特定酶也可能產生不同的效應［9］。

本文研究了 Na+、K+、Ba2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+對羊血SOD的影響，發現Na+對羊血SOD影響輕微，可以認為Na+對SOD活性幾乎無影響。K+、Ca2+、Fe2+對羊血SOD都有激活作用，使SOD酶活上升，但酶活性并非呈直線上升趨勢。K+、Ca2+濃度達到0.03mmol/L時，酶活力為最大，酶活力提高將近1.5倍，濃度在0.05～1mmol/L之間時，酶活力基本變化不大，相對酶活力保持在120%左右。Ba2+在低濃度時對SOD有抑制作用，當濃度大于0.03mmol/L時，酶活力開始上升，對SOD有激活作用。隨著Fe2+濃度的增加，酶活力升高，相對酶活力總體呈現先增后減的趨勢，但當Fe2+濃度為1mmol/L時，相對酶活力為273.82%，活力仍很大，說明Fe2+對羊血SOD有明顯的激活作用。

分析這些離子對酶活影響的原因，一方面可能是金屬離子可直接與金屬酶SOD活性中心發生相互作用，并與酶活性中心的金屬離子發生誘導、置換作用等反應，從而形成新的配位化合物，進而影響酶活；另一方面，可能是因為加入過量的重金屬離子產生的毒害作用［10］。同時，加入的金屬離子可能與酶活性中心的金屬離子發生拮抗作用，從而激活或抑制酶活性。

4 結論

本實驗以離子交換層析法分離純化的羊血SOD為原料，研究了加入不同種類、不同濃度的常見金屬離子在體外對SOD活性的影響。結果證實，不同金屬離子在不同濃度下對羊血SOD酶活的影響不同。K+、Ca2+、Fe2+及高濃度的Ba2+、Mg2+對羊血SOD具有激活作用，且 Fe2+作用明顯，當加入 0.01～0.05mmol/L的Fe2+時，相對酶活力最大，可將酶活力提高3.8倍；高濃度的Zn2+、Cu2+在體外對羊血SOD活性有抑制作用，當加入0.3mmol/L Zn2+時，相對酶活力為44.49%，達到最小值。

［1］張博潤，譚華榮.SOD研究進展及應用前景［J］.微生物學通報，1992，19（16）：352-357.

［2］LinCT，LeeTL，DuanKJ，etal.Molecularcloning，characterization，and expression of a cDNA coding copper/zinc superoxide dismutase from black porgy［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2007，48（2）：4-7.

［3］Marikovsky M，Ziv V，Nevo N.Cu/Zn superoxide dismutase plays important role in immune response［J］.Immunol，2005，109（6）：3321-3325.

［4］林少琴，蘭瑞芳.金屬離子對蚯蚓CAT、GSH-Px及SOD酶活性的影響［J］.海峽藥學，2007，13（2）：23-25.

［5］黎瑞珍，楊慶建，陳貽銳.SOD活性的測定及其應用研究［J］.瓊州大學學報，2004，11（5）：34-36.

［6］謝衛華.鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶［J］.醫藥工業，1998，19（5）：217-219.

［7］徐桂花，于穎.羊血中超氧化物岐化酶（SOD）活性的測定［J］.肉類工業，2009（10）：32-33.

［8］吳眾望，潘魯青，張紅霞.重金屬離子對凡納濱對蝦肝胰臟、鰓絲和血液SOD活力的影響［J］.應用生態學報，2005，16（10）：1962-1966.

［9］Vaglio A，Landriscina C.Changes in liver enzyme activity in the teleost Sparus aurata in response to cadmium intoxication［J］. Ecotoxicol Environ Saf，2008，43（1）；111-116.

［10］Buzadic B，Korac B，Lazic T，et al.Effect of supplementation with Cu and Zn on antioxidant enzyme activity in the rat tissues［J］.Food Res Inter，2007，35（3）：217-220.

Effect of metal ions on activities of SOD extracted from sheep blood

YANG Xue-shan，YANG Xiao-pu，WU Bing，YANG Zhi-jie
（College of Life Scienceamp;Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

The activities of SOD extracted by ion-exchange chromatography from sheep-blood enzyme solution were determined by means of pyrogallo autoxidation method under the different concentrations of Na+，K+，Ba2+，Ca2+，Mg2+，Zn2+，Cu2+，Fe2+at 25℃ for 4h.The results showed that different concentrations of metal ions had different influence on sheep blood SOD activity.Na+had little effect on SOD activity.K+，Ca2+and Fe2+had an activation on the activity of SOD in vitro，especially Fe2+could add the relative enzyme activity of SOD up to 378.98%.Ba2+，Mg2+had little effect on activity of SOD at low concentrations，whereas the activation was detected at high concentrations.Zn2+and Cu2+inhibited the activition of SOD in vitro.

superoxide dismutase；metal ions；enzyme activity

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0089-03

2010-01-07

楊學山（1977-），男，講師，研究方向：生物化學與生物制品。

甘肅省農業生物技術研究與應用開發項目（GNSW-2010-03）。