免疫親和柱結合液相色譜串聯質譜法測定蜂花粉中黃曲霉毒素*

郭偉華，李熠

(中國農業科學院蜜蜂研究所農業部蜂產品質量安全風險評估實驗室，北京，100093)

蜂花粉是蜜蜂從植物花蕊中精心挑選的食物，并作為其生存和生產蜂王漿的重要蛋白來源。它富含蛋白質、碳水化合物、礦物質、維生素和其他活性物質，既是極好的天然營養食品，同時也是一種理想的滋補品，并具有一定的醫療作用［1］。然而，蜂花粉在采集、儲存和銷售過程中的不適當操作(如未充分干燥)則很容易滋生霉菌而有可能產生其有毒代謝物，如黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)。AFs是由真菌類如黃曲霉菌(Aspergillusflavus)、寄生曲霉菌(Aspergillusparasiticus)產生的一類有毒的次級代謝產物，主要包括AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，其中AFB1的毒性最大。AFs被認為是食品和飼料的最危險污染物之一［3］，并且可通過食品或飼料進入人和動物體內造成危害，如肝腎毒性、中樞神經系統異常、雌激素異樣反應，甚至可造成人與動物急性中毒死亡［2］，因此許多國際組織及貿易組織對大部分農產品中的AFs含量都規定了限量值，如食品法典委員會(CAC)推薦食品、飼料中AFs最大允許量標準為總量(B1+B2+G1+G2)小于15 μg/kg。但目前，蜂花粉產品還沒有相應的限量標準規定。因此，建立蜂花粉中AFs的測定方法，對于蜂花粉中生物毒素的安全性評價和安全限量的制定有著重要的研究意義。

目前文獻中報道的食物中真菌毒素的分析方法通常是用乙腈水［4-5］、甲醇水［6-7］或三氯甲烷［8］進行提取，之后凈化并采用液相色譜結合不同的檢測器來對其進行測定［9］。由于AFs具有顯著的熒光特征，因此液相色譜結合熒光檢測器曾是測定AFs的首選方法。但近幾年來液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)因其能縮短運行時間并具有較高的選擇性和靈敏度而成為測定AFs的一種普遍方法［10-11］?？紤]到花粉中的AFs研究很少，而攝食受AFs污染的花粉具有潛在的健康風險，因此有必要對花粉中的AFs進行定性定量分析。本研究即采用免疫親和柱結合LC-MS/MS來對花粉中的超痕量的 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2進行分析測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器和設備

高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國Agilent公司);三重四極桿串聯質譜(6460，美國 Agilent公司);分析天平(Mettler-Toledo公司);高速冷凍離心機(CR22GⅡ，日本日立公司);多用途旋轉搖床(QB-206，海門市其林貝爾儀器制造有限公司);超聲波清洗器(KQ-100E，昆山市超聲儀器有限公司);氮吹裝置(N-EVAP 112，美國Labnet公司);Milli-Q純水發生器(美國Millipore公司)。

1.1.2 試劑和耗材

標準品:AFs混標5mg/L(Trilogy分析實驗室，美國華盛頓)。其中 AFB1、AFG1為 2 mg/L，AFB2、AFG2為0.5 mg/L。標準品于-20℃密閉保存。

甲醇、乙腈和甲酸均為色譜級，乙酸銨(Fisher公司);微纖維濾紙(PriboLab，110mm，北京泰樂琪科技有限公司);定性濾紙(47 mm，杭州特種紙業有限公司);超純水由Milli-Q純水發生器制備。

AFs總量免疫親和柱(ToxinFast，北京華安麥科生物技術有限公司);多功能凈化柱(PriboFast，100 mg，3 mL，北京泰樂琪科技有限公司)。分散固相萃取柱(北京維康公司)，陽離子交換柱(100 mg，3 mL，北京泰樂琪科技有限公司)。

蜂花粉樣品:從市場隨機抽樣20個，人為培養發霉樣品10個。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

基于本研究檢測靈敏度和線性范圍配制標準工作溶液，使用前用乙腈將AFs混標溶液配制成50，500 μg/L的混合工作溶液并于4℃冰箱密閉保存。

1.2.2 樣品前處理過程

準確稱取10g蜂花粉樣品(精確到0.01 g)于50 mL具塞聚四氟乙烯離心管中，加入20mL提取液［V(乙腈)∶V(水)=60∶40］，25℃超聲輔助提取 10 min，均勻振蕩15 min，-4℃高速離心(12 000 r/min)15 min，將上清液過定性濾紙，取8 mL濾液用水定容至40 mL，-20℃冷凍12h。樣品解凍后，-4℃高速離心(12 000 r/min)15 min，上清液經微纖維濾紙過濾，取10 mL濾液過AFT免疫親和柱，流速為1 d/s，10 mL超純水淋洗，抽干后，2 mL甲醇洗脫。洗脫液于50℃下氮氣吹干，1 mL提取液定容，過0.2 μm濾膜于自動進樣瓶中，待LC-MS/MS檢測。

1.3 液質聯用儀分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm);柱溫:35℃;進樣量:10 μL;流速:0.2 mL/min;流動相A:1 mmol/L乙酸銨水溶液(0.1%甲酸)，流動相B:1 mmol/L乙酸銨甲醇溶液(0.1%甲酸);流動相梯度洗脫，洗脫比例見表1。

表1 流動相洗脫梯度Table 1 The elution gradient of mobile phase

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式掃描;監測方式:多反應監測模式(multiple reaction monitoring，MRM);干燥氣溫度:50℃;干燥氣流速:6 L/min;鞘流氣溫度:350℃;鞘流氣流速:10 L/min;霧化器壓力:40 psi;毛細管電壓 4 000 V。AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的其他質譜分析條件參數見表2。

表2 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 的質譜參數Table 2 MS/MS parameters of AFB1，AFB2，AFG1 and AFG2

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優化

以乙腈-水為流動相時，乙腈能夠抑制AFs化合物的離子化而導致質譜信號降低，并且色譜峰出現拖尾現象。因此本研究采用1mmol/L的乙酸銨甲醇溶液(0.1%甲酸)和1mmol/L乙酸銨水溶液(0.1%甲酸)作為流動相來對花粉中的 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2進行分離。

2.2 提取溶劑的優化

AFs中的 B1、B2、G1、G2 化學結構類似，基本結構中都含有二呋喃環和氧雜萘鄰酮(又名香豆素)，易溶于有機溶劑。采用乙酸乙酯和乙醚作為提取液時，操作復雜，需增加一步旋轉蒸發的操作，而乙腈和甲醇作為提取液時可以減去這步操作，縮短實驗時間，并且降低實驗成本。本實驗考察了不同體積比的乙腈-水(5∶5、6∶4、7∶3)的提取效果如圖 1。

圖1 不同提取溶劑與回收率關系圖(n=3)Fig.1 Comparison of recoveries of different extraction solvents for AFB1，AFB2，AFG1，AFG2

結果表明隨著乙腈-水的體積比增大，提取回收率變化不大，但B1和G1在乙腈-水體積比為6∶4時的回收率最好。而考慮到有機相繼續增加會降低目標物在凈化柱上的保留效果，因此綜合考慮本研究選擇體積比為6∶4的乙腈-水作為提取液，這與已有的報道結果相一致［12］。不同提取溶劑與回收率關系見圖1。

2.3 凈化條件的選擇

本研究比較了免疫親和柱(IAC)、多功能凈化柱(MFC)、分散固相萃取柱(d-SPE)和陽離子交換柱(PCX)提取4種毒素的效果。通過比較發現，d-SPE、MFC和PCX的提取回收率很差，而免疫親和柱由于其抗體的特異性結合而表現出了最佳的凈化效果。圖2顯示了3種固相萃取方法的回收率比較。

圖2 四種不同的萃取柱的提取回收率比較Fig.2 Comparison of the recoveries of fourcleanup procedures for 4 aflatoxins(AFB1，AFB2，AFG1，AFG2)

此外，在樣品前處理過程中，當濾液用水稀釋定容時會出現很嚴重的乳化現象，而且過免疫親和柱時會堵塞柱子，影響實驗結果。但是將定容好的混合液冷凍過夜后再解凍離心，則可以很好的破乳，從而解決柱子堵塞問題［13］。

2.4 基質效應、線性、檢出限(LOD)與定量限(LOQ)

由于在串聯質譜中，樣品基質通常對分析物的離子化具有增強或抑制效應［14］，因此采用空白蜂花粉樣品提取液對AFs混標液進行稀釋，即配置與蜂花粉空白基質匹配的不同濃度的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的標準溶液，以各組分的質量濃度(μg/kg)為橫坐標(x)，相應的色譜峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線。結果顯示:4種組分均成良好線性關系，相關系數(r2)在0.997～0.999之間。以線性的最低濃度作為檢出限(LOD)，得出 B1、B2、G1、G2 的定量限分別為 0.05，0.1，0.013，0.025 μg/kg，見表 3。其定量限水平的基質校正標準色譜圖見圖3。

圖3 4種黃曲霉毒素定量限水平的基質校正標準色譜圖Fig.3 Typical LC-MS/MS chromatogram of the matrix-matched standard at LOQ level

表3 4種黃曲霉毒素的標準曲線參數，檢出限及定量限Table 3 The standard curve parameters，LODs and LOQs of AFB1，AFB2，AFG1，AFG2

2.5 回收率與相對標準偏差(RSD)

選擇不含黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的蜂花粉作空白樣品，分別在3個添加濃度下按照1.2.2和1.3所述步驟進行回收率和精密度實驗。結果表明黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)的平均回收率為74% ～97%，RSD為3.6% ～10%(見表4)。

2.6 實際樣品測定

用建立的方法分析20個從市場隨機抽取的蜂花粉(包括油菜，茶花和荷花花粉)樣品，均未檢出4種黃曲霉毒素;分析人為培養的10個發霉的花粉樣品，也未檢出4種毒素;對檢測結果進行分析，推測可能是花粉中的霉菌并未產生孢子，所以未生成毒素。

表4 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2 的添加回收率與精密度(n=5)Table 4 Therecoveries and precisions of AFB1，AFB2，AFG1，AFG2

圖4 空白樣品色譜圖Fig.4 Typical LC-MS/MS chromatogram of the blank bee pollen sample

3 結論

目前我國及歐盟對很多農產品中的AFs限量都有規定，但蜂花粉中限量還未制定。本實驗利用免疫親和柱結合高效液相色譜串聯質譜，建立了一種同時測定蜂花粉中的黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2含量的方法。該法簡單、準確、快速、靈敏，并且回收率高、重現性好，為蜂花粉中AFs的檢測方法和限量制定提供了參考。

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