一株犬細小病毒CPV-2a變異株的分離鑒定及生物學特性研究

丁 軻，余祖華，何 雷，張 才，李 旺，李元曉，彭春平，程相朝,3*，夏咸柱,3

(1.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南洛陽 471003；2.河南科技大學宏翔發酵飼料實驗室，河南洛陽 471003；3.解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林長春 130122)

犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)病毒粒子大小為20 nm～26 nm，為等軸二十面體，無囊膜，核酸由單股負鏈DNA 組成。該病毒能夠引起犬的急性高度接觸性烈性傳染病，臨床主要以嘔吐、急性出血性腸炎、非化膿性心肌炎為特征，尤其對幼犬的致病性和致死率均很高，發病率高達90 %，病死率10%～50%，是影響犬健康最主要的疾病之一[1]。胎貓腎細胞(F81)為該病毒的易感細胞，并能夠引起細胞病變(CPE)。

自1967 年Binn 等從犬分離到第一株CPV-1 后，近50 年來，CPV 就不斷地發生變異。1978 年Kelly和Thomson 等從病犬中分離到CPV-2，該型病毒已呈世界性分布[2]；1979 年Parrish 等分離到CPV-2 的第一個亞型CPV-2a，該亞型病毒能夠引起犬和貓發病，目前臨床上絕大部分病例均為該亞型引起，也是最主要的疫苗株來源；隨后在1984 年和2000 年，分別分離到CPV-2b 和CPV-2c 亞型，其變化主要是在VP2 蛋白Asn426Asp 和Asn426Glu。我國于1982 年首次發現該病，并于次年報道了該病的流行[3]，并且主要是以CPV-2a 和CPV-2b 感染為主，2010 年我國首次檢測到CPV-2c[4]，表明中國目前CPV 病已呈多型感染或混合感染狀況。本實驗室前期已對河南省CPV 病進行了流行病學調查[5]，又分離到一株變異較大的病毒株。在此基礎上，本研究采用病毒分離鑒定、間接ELISA、PCR 等方法又分離到一株變異較大的CPV 株，為進一步研究CPV 的變異情況和CPV 病的防制奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 F81 細胞由本實驗室保存；兔抗CPV 高免血清由本實驗室制備；胎牛血清、羊抗兔IgG-HRP 購自北京欣經科生物技術有限公司；Tks GflexTMDNA Polymerase、DNA Marker、pMD18-T、JM109 感受態細胞等均購自TaKaRa 公司；DNA 凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒、病毒基因組DNA 抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；50 日齡實驗犬購自洛陽某養犬場，健康狀況良好。

1.2 病料樣品的采集與處理 病料樣品采集于洛陽市某寵物醫院，為膠體金檢測陽性的CPV 患犬的肛拭子，采集后的棉拭子立即放入含有10%雙抗和3%胎牛血清的DMEM 離心管中，2 mL/管，-80 ℃凍存。

1.3 病毒的分離與增殖 將病料樣品反復凍融3次，取棉簽浸出液，5 000 r/min 離心10 min，吸取上清，0.22 μm 濾器無菌過濾，接種于F81 單層細胞，37 ℃5 % CO2孵育24 h，換維持液后繼續培養。同時設正常對照。每天觀察細胞生長情況和CPE。盲傳3 代無CPE 的棄去，產生CPE 的細胞再連續傳3 代，當出現90 %的CPE 時，收獲病毒。

1.4 病毒的血清學檢測

1.4.1 血凝試驗 采集健康豬血制備1 %的豬紅細胞懸液，根據文獻[6]的方法，采用微量96 孔V 型板法檢測分離株的血凝性。

1.4.2 間接ELISA檢測 分別以培養的第6 代病毒原液感染F81 細胞和未感染的F81 細胞為包被抗原，以兔抗CPV 高免血清為一抗，以羊抗兔IgGHRP 為二抗，采用間接ELISA 檢測病毒分離株，酶標儀測定各孔的OD490nm值。

1.5 病毒的分子鑒定

1.5.1 病毒的PCR 鑒定 根據國標法GB/T275233-2011 設計的特異性引物(P1：5'-GAATCTGCTACTC AGCCACCAAC-3'/P2：5'-GTGCACTATAACCAACCT CAGC-3')，擴增位于CPV 基因組3 248 bp～3 806 bp的片段，預期擴增片段大小為559 bp。采用病毒基因組DNA 抽提試劑盒提取第3 代病毒液病毒基因組DNA，利用引物P1/P2 進行PCR 檢測，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5.2 病毒VP2 基因序列測定 參照GenBank 中登錄的CPV 全基因組序列(NC_001539)，設計合成檢測CPV VP2 基因的引物(PVP2R：5'-AGAGACAATCT TGCACCAAT-3'/PVP2L：5'-ATGTTAATATAATTTTCT AGGTGCT-3')。以第3 代病毒DNA 為模板，采用引物PVP2R/PVP2L進行PCR 擴增。反應條件如下：94 ℃5 min；94 ℃30 s、48 ℃50 s、72 ℃110 s，35 個循環；72 ℃10 min。PCR 產物經1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將回收的PCR 產物克隆于pMD18-T載體中，陽性重組質粒由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.5.3 CPV VP2 基因遺傳進化分析 利用DNAStar6.0軟件包中的Meglign 將所測定的CPV VP2 基因及其推導的氨基酸序列與國內外已發表的相應片段進行同源性比較，采用Kimura2-parameter 法計算遺傳距離，利用Neighbor-Joining 法構建系統發育樹，同時利用DNAman7.0 軟件對其突變位點進行統計和亞型分型。

1.6 動物實驗 選取3 只經抗原和抗體檢測均為CPV 陰性的幼犬，其中1 只為空白對照，2 只背部皮下接種102.5TCID50的CPV 細胞毒。觀察犬的臨床癥狀，對糞便樣品進行PCR 檢測，并采集病犬的心、腸管等組織經福爾馬林固定，制作石蠟組織切片，HE 染色，觀察其病理變化。

2 結果

2.1 病毒的分離 取患病犬的直腸棉拭子樣品，處理后接種F81 細胞單層后進行病毒分離，結果顯示，于盲傳3 代開始出現CPE，主要表現為細胞圓縮、脫落、拉網等病變(圖1)。

圖1 病毒分離株接種F81 細胞的病變效應(20×10)Fig.1 The CPE on F81 cells induced by the virus isolate(20×10)

2.2 病毒的血清學鑒定

2.2.1 血凝試驗 利用96 孔微量反應板檢測該病毒分離株對豬新鮮血紅細胞的血凝性，結果顯示其血凝效價為211，表明該分離株具有血凝特性。

2.2.2 間接ELISA 檢測 分別以培養的第6 代病毒原液感染F81 細胞和未感染的F81 細胞為包被抗原，以兔抗CPV 高免血清進行ELISA 檢測，結果顯示，CPV 培養液3 個平行孔平均值約為1.523±0.021?？瞻讓φ? 個平行孔平均值為0.188±0.015，P/N 平均值為8.1，表明該細胞培養毒為CPV 陽性。

2.3 病毒的PCR鑒定 采用國標法確定的CPV 檢測引物對病毒基因組DNA 樣品進行PCR 鑒定，結果顯示擴增到一條大小約為500 bp 的特異性片段，測序結果(KR869738)與CPV 參考病毒株序列(AY742953)的同源性為98.6 %，表明該分離株為CPV，將其命名為CPV-henan32-2013。

2.4 VP2基因序列測定及同源性分析 采用引物PVP2R/PVP2LPCR 擴增VP2 全基因，結果顯示，擴增出一條大小約為1 700 bp 的目的片段。將測序結果提交至GenBank(KM924289)。同源性分析結果表明該序列與國內外已登錄的CPV VP2 基因的同源性為98.2 %～99.5 %，氨基酸同源性為98.1 %～100 %。進化樹分析也表明該分離株CPV-Henan32-2013 與CPV 黑龍江分離株(JQ743897)親緣關系最近，并且與中國分離株的親緣關系普遍較近，與國外分離株較遠(圖2)。

圖2 基于Neighbor-Joining 法構建CPV VP2 基因核苷酸序列遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree analysis based on VP2 gene sequence from CPV isolates and other 20 reference CPV strains by Neighbor-Joining methods

2.5 推導氨基酸序列分析 將分離獲得的CPV VP2 基因及其推導的氨基酸序列與國內外已發表的相應片段進行同源性比較，結果顯示，與傳統的CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c 和新近分離的CPV-2a、CPV-2b 相比較，分離株VP2 基因推導氨基酸序列中，主要在297、322、324、333、334、348、426、555 等8 個位點發生了變異，其中322、324、333、334、348 等5 個位點發生了與以往亞型完全不同的變異，而297 位和555 位的變異與CPV 各型近年的變異規律一樣，426 位氨基酸為Asn 表明該分離株為CPV-2a 型的變異株(表1)。

2.6 動物實驗 將病毒分離株接種犬后，體溫先升高后降低，嘔吐、腹瀉，糞便帶血，2 只犬均約在第60 h 時死亡。剖檢后可見典型的出血性腸炎，腸腔內有紅色水樣物，回腸中有紅色淤積物，腸系膜淋巴結出血、腫脹。心包液增多，心臟腫大。膽囊膨脹、充盈。肺臟水腫、充血、出血，呈斑駁狀。病理切片檢測可見心肌纖維排列疏松紊亂，肌纖維溶解，其間有水腫液貯積，心肌細胞斷裂、崩解現象，胞核變長(圖3A)；肺泡毛細血管擴張、充血、出血，肺泡腔內可見脫落的上皮細胞、嗜中性粒細胞和大量紅細胞(圖3B)；肝臟可見大量巨噬細胞、中性粒細胞，血管壁變薄，導致出血，壞死(圖3C)；腸粘膜上皮細胞壞死、脫落，固有層充血、出血，伴有炎性細胞浸潤(圖3D)。

表1 CPV 分離株VP2 氨基酸突變位點Table 1 The amino acid mutation sites of CPV isolate

圖3 感染犬組織病理變化Fig.3 Histological pathological change after CPV-Henan32-2013 infection

3 討論

雖然CPV 為DNA 病毒，但由于其基因組較小(約5.3 kb)，所以極易發生變異[7]。尤其是將CPV作為常規免疫的疫苗，疫苗株和野毒株之間的相互影響，以及環境的因素，導致在近50 年來CPV 在基因型上已發生了5 次變異，主要有CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-2c(a)和CPV-2c(b)型，其中CPV-2a、CPV-2b 和CPV-2c 型是當前最主要流行的基因型，CPV-2c(a)和CPV-2c(b)型是新近發現的新型CPV[8]。另外，不同地方還不時報道有各種新的亞型，更增加了CPV 的復雜性。這可能也是CPV 病幾十年來一直發生的原因之一。因此，要做好CPV 病的防控，就必須掌握CPV 的變化規律，所以CPV 流行病學調查和分離鑒定尤顯重要。本實驗在對2011 年～2013 年河南省CPV 流行病學調查的基礎上，發現了該病毒株CPV-Henan32-2013，并對其進行進一步的鑒定和生物學特性研究。

研究表明VP2 基因是CPV 的特異性基因，為其最主要的毒力基因，也是CPV 最易變異的集中區段[9-11]，尤其是CPV 基因型分型依據就是位于VP2蛋白的第426 aa。為進一步驗證該分離株，本實驗又對該病毒株的VP2 基因進行了克隆和分析。結果顯示從病料樣品和細胞培養物中均能夠擴增出大小約為1 700 bp 的基因片段，測序后進行同源性比較顯示該基因與CPV VP2 的同源性可達98.2%～99.5%。將該基因與GenBank 中登錄的具有代表性的CPV VP2 基因建立了遺傳進化關系樹，也表明該分離株與CPV 的親緣關系較近，尤其是與國內CPV 株關系最近。因此，從分子水平上也證明了該分離株為CPV。進一步對VP2 基因對應的氨基酸序列分析表明，該病毒株426aa 為Asn，符合CPV-2a 型的特征，但該病毒株在一些其他位點上卻發生了變異，與以往報道的病毒株均不同，如T322S、Y324I、P333A、P334G、S348C。323aa 為影響CPV 感染宿主范圍最關鍵位點之一，也可決定CPV 的抗原性[12-14]，而該分離株在323aa 沒有變異，但兩側的322aa 和324aa 卻發生了變化，這很可能會影響323aa 的空間構象，從而可能會影響該分離株的感染譜或毒力。333aa、334aa 和348aa 變異在以往的研究中還未見報道，而這3 個位點位于構成VP2 蛋白三折疊單元肩部的loop3 區，其突變可能會影響單克隆抗體對相應位點的識別。另外，S297A 和I555V 也是近年來CPV 各型病毒株的變異趨勢。

以上研究表明CPV 的易變性，從而提示我們CPV 防控的復雜性，不能僅滿足于現有的疫苗株，尤其是在當遇到免疫失敗時要考慮CPV 在基因型上是否發生了變異，這種變異是否會使病毒的抗原表位發生變化。下一步的研究將集中對其基因組進行全序列測定，從全基因組水平對該病毒進行深入的研究，為研究CPV 的變異規律提供科學的信息。

[1]Mittal M,Chakravarti S,Mohapatra J K,et al.Molecular typing of canine parvovirus strains circulating from 2008 to 2012 in an organized kennel in India reveals the possibility of vaccination failure[J].Infect Genet Evol,2014,23:1-6.

[2]Kelly W R.An enteric disease of dogs resembling feline panleukopenia virus[J].Aust Vet J,1978,54:593.

[3]徐漢坤，金淮，郭寶發，等.某犬群暴發犬病毒性腸炎的流行病學和臨床病理學觀察[J].畜牧與獸醫，1983，5：8-10.

[4]Zhang Ren-zhou,Yang Song-tao,Zhang Wei,et al.Phylogenetic analysis of the vp2 gene of canine parvovirus circulating in China[J].Virus Gen,2010,40(3):397-402.

[5]丁軻，余祖華，彭春平，等.2011～2013 年河南省犬細小病毒分子流行病學調查與分析[J].畜牧獸醫學報，2014，45(10)：1671-1678.

[6]程雪梅，柴春彥.犬細小病毒病臨床診斷方法的篩選及新治療手段的研究[D].上海：上海交通大學，2008.

[7]Yong K K,Seong I L,Sarah C,et al.A novel assay for detecting canine parvovirus using a quartz crystal microbalance biosensor[J].J Virol Methods,2015,219:23-27.

[8]Keda Y,Nakamura K,Miyazawa T,et al.Feline host range of canine parvovirus:recent emergence of new antigenic type types in cats[J].Emerg Infect Dis,2002,8(4):1-11.

[9]Soma T,Taharaquchi S,Ohinata T,et al.Analysis of the VP2 protein gene of canine parvovirus strains from affected dogs in Japan[J].Res Vet Sci,2013,94(2):368-371.

[10]Mohan R J,Mukhopadhyay H K,Thanislass J,et al.Isolation,molecular characterization and phylogenetic analysis of canine parvovirus[J].Infect Genet Evol,2010,10:1237-1241.

[11]Doqonyaro B B,Bosman A M,Sibeko K P,et al.Genetic analysis of the VP2 encoding gene of canine parvovirus strains from Africa[J].Vet Microbiol,2013,165(3-4):460-465.

[12]Pérez R,Calleros L,Marandino A,et al.Phylogenetic and genome-wide deep-sequencing analyses of canine parvovirus reveal co-infection with field variants and emergence of a recent recombinant strain[J].PLoS One,2014,9(11):1-10.

[13]Pérez R,Bianchi P,Calleros L,et al.Recent spreading of a divergent canine parvovirus type 2a(CPV-2a)strain in a CPV-2c homogenous population[J].Vet Microbiol,2012,155(2-4):214-219.

[14]Feng Hao,Liang Meng,Wang Hua-lei,et al.Recombinant canine parvovirus-like particles express foreign epitopes in silkworm pupae[J].Vet Microbiol,2011,154(1-2):49-57.