國產醬類產品中的生物胺

朱天傲，劉春鳳，王金晶，李永仙，鄭飛云，鈕成拓，李崎*

1(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

國產醬類產品中的生物胺

朱天傲1,2，劉春鳳1,2，王金晶1,2，李永仙1,2，鄭飛云1,2，鈕成拓1,2，李崎1,2*

1(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

采用高效液相色譜法檢測了五大類38種市售醬類產品中8種生物胺的含量，并測定了相關理化指標。所有樣品都有生物胺檢出，總量范圍7.21～45.11mg/100g，其中組胺、β-苯乙胺和酪胺的占比最大。五類醬品的生物胺總量從高到低依次是豆醬、菌菇醬、海鮮醬、肉醬和面醬。對于原料不同的醬品，生物胺含量與理化參數的相關性并不一致，部分參數數值和生物胺含量呈現顯著相關。

醬；生物胺；食品安全

生物胺是一類含氮的小分子物質，主要由脂肪族(腐胺、尸胺、亞精胺、精胺)、芳香族(酪胺、β-苯乙胺)和雜環族(色胺、組胺)構成。生物胺作為一類生理活性物質，參與生物體內的代謝活動[1]，因此食品中的生物胺可由原材料帶入，同時微生物的脫羧反應也是重要來源。因為傳統的發酵過程難以控制、機理不明晰，天然發酵食品中的生物胺問題愈發受到人們關注。過量攝入生物胺，可能會引發頭痛、頭暈、惡心、呼吸窘迫、心悸等各種中毒癥狀[2-3]。出于對食品安全的考慮，人們應盡可能降低生物胺的攝入量，而檢測和監控食品中生物胺的含量則是必不可少的一環。

醬是一種有悠久歷史的食品，用于佐餐和調味，因其風味獨特、味道鮮美、營養豐富而被廣泛制作和食用。但醬的制作普遍采用自然發酵的方法，發酵菌種復雜，存在較高的微生物源性生物胺安全隱患。韓國[4-5]、西班牙[6]、臺灣[7]等對當地醬品中的生物胺進行過報道。中國內地的報道則較少，胡鵬等測定和比較了18種毛霉和細菌型豆豉中的生物胺，但未結合其他理化數據進行深入討論[8]。此外，目前醬類產品中的生物胺研究大多集中于豆類醬，而已有報道表明，魚肉和發酵肉制品的生物胺含量較高[9-10]，因此以魚或肉制成的醬品值得重點關注。為了綜合全面地評估傳統醬類食品中的生物胺問題，本研究檢測了市場上包括肉類和非肉類在內的多種類型醬品，同時分析和討論了pH、鹽度、總酸、氨基酸態氮等可能影響生物胺含量的理化參數，并結合相關系數，以期分析出可能影響生物胺的因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從當地超市購買38種不同種類的醬品，所有樣品都儲存于4℃，并盡快進行分析。

標準品：組胺二鹽酸鹽，購自加拿大Bio Basic公司；色胺、β-苯乙胺，購自瑞士AdamasReagent公司；腐胺二鹽酸鹽、尸胺二鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、精胺、亞精胺，購自美國Sigma-Aldrich公司。所有標品的純度都高于98%。

試劑：色譜級乙腈、甲醇，購自美國Sigma-Aldrich公司；苯甲酰氯，購自瑞士AdamasReagent公司；超純水，購自無錫飄之霖公司。

標準溶液配制：用超純水溶解標準品，配制1 g/L的儲備液，4℃避光保存，3個月內有效。分別吸取1.00 mL各生物胺單組分標準儲備液，置于同一個10 mL容量瓶中，0.1 mol/L超純水定容，配制成生物胺標準混合使用液。隨后，分別吸取一定量的標準混合使用液置于多個10 mL容量瓶中，分別加水定容，使終濃度為0.1、1、2.5、5、10、15、25、50 mg/L。

1.2 儀器與設備

SHZ-B型水浴恒溫振蕩器，上海博訊公司；LE438型pH計，瑞士Meltler-Toledo 公司；Centrifuge 5804R型低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；日立高效液相色譜儀，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物胺含量檢測

根據HWANG[9]和欒光輝[11]等的方法稍作調整。準確稱取5 g醬品置于50 mL離心管中，加入40 mL 60 g/L三氯乙酸溶液后，放入30 ℃的水浴恒溫振蕩器，200 r/min下振蕩30 min。隨后離心10 min，濾紙過濾。2 mL濾液放入10 mL離心管中，與1 mL NaOH溶液(2 mol/L)混合。加入20 μL苯甲酰氯后，立即將離心管放入水浴恒溫振蕩器，30℃，200 r/min振蕩20 min。加入2 mL飽和NaCl溶液停止衍生化反應后，加入3 mL無水乙醚萃取，200 r/min振蕩5 min后，1 200 g離心5 min。小心吸取上清液置于5 mL離心管中，氮氣吹干。用1 mL乙腈溶解管中殘留物，0.22 μm濾膜過濾后上機檢測，進樣體積10 μL，梯度洗脫程序如表1所示。色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18，柱溫28℃，流速0.6 mL/min，檢測波長254 nm。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program for separation of biogenic amines

注：A相是乙酸銨溶液(0.01 mol/L)，B相是乙腈。

1.3.2 理化參數

PFD最常見的癥狀是POP、SUI，對女性正常生活影響最大。POP是盆底支持組織(肌肉和筋膜)松弛導致盆腔組織器官移位而出現的盆腔功能異常，子宮脫垂發生率較高，其次是陰道前壁膨出、陰道后壁膨出。我國中老年婦女POP患病率為30%，美國老年女性POP患病率為50%[10]。71%POP患者伴有SUI，59%SUI患者伴有POP[11]。PFD病因尚不十分清楚，流行病學研究[12]顯示，年齡、雌激素水平下降、妊娠和陰道分娩、便秘、肥胖、盆腔手術史等是PFD的主要致病因素,其中年齡、經陰道分娩、多產是PFD獨立危險因素，肥胖、便秘、雌激素分泌減少、慢性咳嗽是非獨立危險因素。

根據SHUKLA[12]等描述的方法，取10mL去離子水加入5 g醬醅樣品中，充分攪拌均質后，用pH計測定樣品的pH。

根據國標GB 5009.40—2003，對樣品的鹽度、總酸、氨基酸態氮(AAN)進行檢測。

1.4 數據分析

使用SPSS Statistic19.0 軟件，根據樣品中生物胺含量進行聚類分析，并結合pH、鹽度、總酸、氨基酸態氮等理化指標進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 檢測方法的效果

生物胺衍生物的分離效果如圖1所示。圖1-a表示質量濃度為10 mg/L的生物胺標準混合液出峰情況，圖1-b則是樣品中的生物胺的譜圖。由圖可知，該方法對標準品和樣品中的生物胺都有較好的分離效果。

1-腐胺；2-尸胺；3-亞精胺；4-精胺；5-色胺；6-苯乙胺；7-組胺；8-酪胺圖1 生物胺混合標準品與樣品檢測色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed biogenic amine standards and tested sample

根據進樣結果制作標準曲線，計算回歸方程，并進行相關實驗確定檢出限、精密度和回收率，結果如表2所示。8種生物胺的濃度在0.1～50 mg/L時，其回歸系數R2≥0.981 5。色胺的檢測限(LOD)最低，為0.002 mg/L，亞精胺最高，達到0.098 mg/L，本文使用LOD的3倍含量作為定量限，含量大于檢出限但低于定量限者不定量。連續對同一生物胺標準品進樣6次，其精密度(RSD)≤1.30%。醬樣品中，生物胺的加標回收率為87.8%～110.5%，可滿足檢測要求。

2.2 醬品中的生物胺含量

本研究對38種市售醬品中的8種生物胺進行了檢測，結果列于表3和表4，各類醬品中都含有一定量的生物胺，總量范圍7.21～45.11 mg/100 g。其中腐胺0～5.04 mg/100g，尸胺0～6.48 mg/100 g，亞精胺0～2.07 mg/100g，精胺0～1.36 mg/100g，色胺0～1.80 mg/100g，β-苯乙胺0～6.75 mg/100g，組胺0～16.52 mg/100g，酪胺1.61～18.83 mg/100 g。樣品中的各類生物胺按濃度占比從低到高分別是精胺(3.4%)、色胺(8.3%)、亞精胺(9.6%)、腐胺(10.4%)、尸胺(11.2%)、組胺(14.0%)、β-苯乙胺(19.9%)和酪胺(23.3%)。BYUN等發現被測豆瓣醬樣品中含量最高的是腐胺(39.1%)和β-苯乙胺(38.6%)[13]。KUNG等檢測的27個味增樣品中的主要生物胺則是尸胺(32.0%)、酪胺(27.4%)和組胺(16.6%)[7]。

表2 檢測方法的回歸方程、相關系數、檢測限和精密度Table 2 Regression equations, R2, LOD and RSD of the detection method

注：以信噪比S/N=3時的進樣濃度為最低檢測限。

表3 市售非肉類醬品中生物胺含量 單位：mg/100gTable 3 BA contents of commerical pastes made from non-meat ingredients

注：數值重復測定3次，平均值±標準差；ND表示未檢出。表4同。

顯然，組胺、β-苯乙胺和酪胺是中國內地市售醬品中最主要的生物胺，占總胺含量的58%。組胺是已知毒性最強的一種生物胺，會引發低血壓、紅臉和頭痛[14]。酪胺已被證明是“乳酪反應”的原因，其過量攝入會導致末梢血管收縮、呼吸加速、高血糖[15]。過量攝入β-苯乙胺則會升高血壓并導致頭痛?？紤]到這幾種生物胺的強毒性，一些學者和機構給出了相應的安全閾值。歐洲食品安全機構(EFSA)建議組胺和酪胺的一次性攝入分別不應該超過50 mg和600 mg[16]。TAYLOR等[17]認為食品中生物胺總含量達到1 000 mg/kg會對人體有害。BRIMK等[3]建議食品中的組胺、酪胺和β-苯乙胺含量應分別低于100、100～800和30 mg/kg。若以上述建議為參考，則21種樣品存有潛在的生物胺超限問題。

表4 肉類醬品中生物胺含量 單位：mg/100gTable 4 BA contents of commerical pastes made from meat

為對比不同醬品中的生物胺含量，本研究選擇了豆醬、面醬、海鮮醬、肉醬和菌菇醬這五類原料相異的醬品。由大豆或蠶豆制得的豆醬是最常見的醬類。本研究中的海鮮醬特指添加了諸如魚蝦等水產品的醬品，包括沙茶、蝦醬等，一般出產于靠海區域。面醬起源于種植業興起的農業社會，值得一提的是，部分市售的所謂肉醬和海鮮醬，其配料表中其實不含肉類或水產品，而是以面醬為基料，通過香料等調配出類似于肉類或海鮮的風味，因此在本研究中都歸入面醬范疇。豬肉和牛肉則是主要的肉醬原料。菌菇醬主要是以香菇為代表的菇類原料，輔以面醬或豆醬共同制成。

在SPSS 19.0 軟件中，以生物胺總量的平方Euclidean距離為度量標準進行聚類分析，可將樣品分為4個集群：第一組的生物胺總量小于15 mg/100g，包含20個樣本；第二組范圍15～30 mg/100g，包含16個樣本；第三組和第四組的范圍分別是30～40 mg/100g和40 mg/100g以上，各包含1個樣本。聚類結果表明，樣品的生物胺總量較為集中，大部分豆醬樣品被歸為第二組，與其他四類醬品的區別較大。圖2是對五類醬品的生物胺總含量的比較。

圖2 五類醬品中8種生物胺總含量Fig.2 Total biogenic amines contents of paste samples made from different ingredients

結果顯示，豆醬中生物胺含量最高，接下來依次為菌菇醬、海鮮醬、肉醬和面醬。這五類醬品的平均生物胺濃度范圍是12.69～19.78 mg/100g，水平總體差異不大，且水產品和肉類與其他非肉類的醬品的生物胺濃度并沒有顯著區別。豆醬中的生物胺含量最高，接下來依次是菌菇醬、海鮮醬、肉醬，而面醬中的最低。PAVEL KALAC[14]總結稱，一些溫血動物、豆類和菇類自身就含有較多的生物胺，這些食材也碰巧是中國傳統醬品中常見的原料。因此，這三類醬品中的生物胺含量應值得特別注意。

不同原料的醬品間，豆醬中的精胺、β-苯乙胺、酪胺平均含量最高，面醬中尸胺、色胺的平均含量最高，菌菇醬中組胺的平均含量最高，肉醬中則是腐胺、亞精胺的平均含量最高。一般認為，魚類和肉類富含蛋白質[15]且易腐敗滋生雜菌[16]，有利于微生物脫羧形成生物胺。WANG等[5]檢測了魚肉中的生物胺，其組胺含量高達84.1 mg/100 g。張海萍等[17]檢測了新疆各地的熏馬腸，生物胺總含量最高的超過了1 000 mg/kg。但圖2的結果表明，以海鮮和肉類為原料的醬品，生物胺含量較豆醬、面醬和菌菇醬等非肉類醬品體系，并沒有顯著區別。這可能是因為醬品的生產加工中，生物胺含量會受到較多因素的影響。而且肉類的加工條件更加嚴苛，已有報道發現高溫[18]或輻射[19]會降低食品中生物胺含量，因此原料帶入或后期積累的生物胺很有可能在加工過程中大量降解而損失。此外，醬品中往往會加入香辛料進行調味，JAE-HYUNG MAH等發現大蒜提取物對鹽腌鳳尾魚中生物胺的生成有很強的抑制作用[20]，丁香和肉桂也有相近的效果[21]。這些發現能在一定程度上解釋解釋含肉和不含肉類的醬品中生物胺含量的微小差異。

2.3 醬品理化指標檢測

與醬品質量相關的理化參數因為代表了環境特性，與生物胺的關系值得探究，本研究測定了樣品中pH、NaCl、總酸、氨基酸態氮這4個理化性質，結果列于表5。

被檢測的38種樣品的pH為3.89～6.05，可知醬品體系是一種酸性環境。pH可以影響微生物的氨基酸脫羧酶[14]和胺氧化酶活性[18]，進而影響生物胺的形成。BOVER-CIDA等根據乳酸菌在酸性環境下產生物胺使pH發生變化的現象，從而開發了改進的指示性培養基[19]。而盧士玲等卻發現，低pH對屎腸球菌的生長和生物胺的產生均有顯著的抑制作用[20]?？梢妏H與生物胺形成量的關系并不能一概而論，還要視微生物和其他條件而定。醬品中富含多種有機酸，檢測結果表明，樣品中的總酸含量范圍0.18～3.16 g/100g(以乳酸計)。對于某些微生物，尤其是乳酸菌，發酵后期的培養基含酸量較高，微生物為抵抗酸脅迫而合成氨基酸脫羧酶，產生堿性的生物胺以改善生存環境。鹽在醬品生產中可以抑制雜菌并帶來風味，不同樣品的檢測結果(以NaCl計)相差較大，范圍1.46～14.74 g/100g。有報道發現，在高鹽度的條件下，大多數的細菌生長緩慢，合成生物胺的能力也會變弱[18]。豆醬和面醬是含鹽量最高的2種醬品，但二者生物胺含量的差距最大，這可能是因為不同原料的醬醅體系富集的發酵菌種不同，在含鹽量相近的條件下依舊表現出相異的生物胺合成能力。氨基酸態氮是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是評價醬和醬油品質的重要指標。被測的38種樣品中的氨基氮含量為0.04～0.9 g/100g，其中豆醬的氨基酸態氮平均含量高于其他類型醬品。

2.4 相關性分析

本研究同時對所有樣品的生物胺濃度和理化參數進行相關性分析(Pearson)，相關系數列于表6和表7。與腐乳的研究結果[21]相近的是，不同類別醬品的相關系數和正負性并不一致，呈顯著相關的也較少，可知不同的環境條件對不同類別的醬品中生物胺的存在影響各異。

表6 非肉類醬品中理化參數與生物胺的相關系數Table 6 Correlation coefficients for physicochemical properties and BAs contents of non-meat paste samples

注：*表示相關系數在0.05水平呈顯著差異；**表示相關系數在0.01水平呈顯著差異(雙尾檢驗)。

雙變量相關分析表明，面醬和海鮮醬的pH分別與組胺(-0.770)和酪胺(0.912)呈現顯著的高度相關性。對于豆醬來說，鹽度與亞精胺(-0.714)、組胺(-0.599)和總胺(-0.621)呈現較高的線性負相關，表明鹽度對某些生物胺的形成有較顯著的負面作用。以此推測，如果在加工過程中能選擇合適的加鹽量和添加方式，可以有效地控制生物胺的含量。微生物代謝來源的生物胺，是以游離氨基酸作為前體，經過脫羧作用生成的[22]。胡鵬等跟蹤了永川豆豉制曲過程中生物胺含量變化，發現與氨基酸態氮的變化趨勢一致[23]。本研究中，面醬的氨基酸態氮和尸胺(0.872)、酪胺(0.885)、總胺(0.926)呈現顯著和高度的相關性，表明氨基酸與面醬中的生物胺含量具有緊密聯系，控制氨基酸含量有助于降低面醬中生物胺的含量。

表7 肉類醬品中理化參數與生物胺的相關系數Table 7 Correlation coefficients for physicochemical properties and BAs contents of meat paste samples

注：*表示相關系數在0.05水平呈顯著差異；**表示相關系數在0.01水平呈顯著差異(雙尾檢驗)。

3 討論

目前醬的加工普遍采用自然發酵技術，通常是對原料預處理之后，將其轉移至敞口容器曬露。不能忽視的是，大量未知的微生物都參與了發酵過程，一旦基質環境有利于生物胺的形成，安全風險就會急劇升高。本研究檢測了市售常見的38個醬類樣品，8種生物胺的總量為7.21～45.11 mg/100g。盡管國內并沒有對醬品中的生物胺含量有限定，被測樣品目前都是合格的，但是55.3%的樣品中β-苯乙胺和組胺含量超過了相關研究者的建議值，可能具有潛在的生物胺風險。聚類分析可根據事物數值的特征進行分類，分析結果顯示，94.7%的樣品中生物胺總量都集中于0～30 mg/100g。被測樣品涵蓋了豆醬、菌菇醬、海鮮醬、肉醬和面醬五大類，生物胺總量濃度范圍12.69～19.78 mg/100g，總體差異較小。

雙變量相關性分析常用于衡量變量之間相互線性關系的強弱，本研究通過對理化參數和各種生物胺含量的相關分析，探究環境因素對各種生物胺的影響，并給出適當的推論。分析結果表明，不同原料來源的醬品，生物胺含量與理化參數的相關系數并無一致性。所有理化指標中，鹽度與多種生物胺呈顯著的負相關，因此鹽可能是控制豆醬中生物胺含量的有效添加劑。而對于面醬來說，氨基酸態氮是影響最為顯著的因素，如果選取低蛋白含量的原料或蛋白降解能力適當的發酵菌種，或許能更好地控制面醬中的生物胺含量。

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BiogenicaminesincommercialsauceproductsinChina

ZHU Tian-ao1,2,LIU Chun-feng1,2,WANG Jin-jing1,2,LI Yong-xian1,2,ZHENG Fei-yun1,2,NIU Cheng-tuo1,2,LI Qi1,2*

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Eight biogenic amines (BAs) in 38commercial sauce products in five categories were evaluated using high performance liquid chromatography (HPLC). Meanwhile, physico-chemical properties of the samples were measured. BAs was detected in all samples with the range from 7.21 to 45.11 mg/100g. Histamine, β-phenethylamine and tyramine were the majority biogenic amines. Bean sauces contain the highest level of BAs, followed by mushroom sauce, hoisin sauces, meat sauce and flour sauce. The correlations between BAs and physico-chemical properties are not consistent in different sauces, and some showed significant correlation.

paste product; biogenic amine; food safety

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013852

碩士研究生(李崎教授為通訊作者,E-mail：liqi@jiang-nan.edu.cn)。

江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)；國家高新技術研究發展計劃(863計劃，No.2013AA102106-03)；國家自然科學基金(No.31271919，No. 31571942，No.31301539，No.31601558，& No.31601445)；江蘇省自然科學基金(BK20150159)；江蘇基礎研究資助項目(JUSRP51306A, JUSRP51402A & JUDCF13008)

2017-01-16，改回日期：2017-04-19