瘦素對肥胖飲食小鼠的脂質合成相關基因表達影響的研究

石衛紅，李小林，熊清華，萬冠群，曾 琪，胡云剛，覃 煦

（江西省人民醫院整形頜面外科，江西 南昌，330006）

肥胖是指機體脂肪積累過多，與其他組織失去正常比例的一種狀態[1,2]。近些年來，隨著經濟發展及人們生活方式的轉變，全球肥胖率呈持續上升趨勢，因此預防肥胖成為全球面臨的最大的公共衛生挑戰。瘦素是一種功能廣泛、多靶器官的內分泌激素，與肥胖、高血壓、骨代謝、Ⅱ型糖尿病等生理病理過程密切相關[3,4]。目前研究認為脂肪體積的大小決定了瘦素合成量的多少，因此，瘦素對肥胖和肥胖相關的疾病有直接的影響[5]。所以，在肥胖治療和預防方面瘦素具有顯著的研究前景，但相關報道較少，所以本研究將探討瘦素對肥胖飲食小鼠脂質合成相關基因表達的影響，為瘦素的臨床應用提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

16只清潔級C57BL/6小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可許可證號：SCXK（湘）2016-0002）。

1.2 實驗試劑與儀器

瘦素（廠家：MedChemExpress，批號：#25973）；高脂飼料（南京盛名科研動物有限公司）。Trizon Reagent（CW0580S，CWBIO 康為世紀）；Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒（CW0581M，CWBIO 康為世紀）；HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒（CW2569M，CWBIO 康為世紀）；UltraSYBR Mixture（CW0957M，CWBIO 康為世紀）。微型離心機（D1008E，SCJLOGEX）；旋渦混合器(XH-C，常州越新儀器制造有限公司）；紫外可見分光光度計（UV-1600PC，上海美譜達儀器有限公司）；低溫高速離心機（TGL-16G，常州中捷實驗儀器制造有限公司）；熒光PCR儀[CFX Connect?實時，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]。

1.3 實驗分組

隨機將16只C57BL/6小鼠分成4組，每組4只，正常對照組、高脂膳食組、高脂膳食瘦素0.5mg/kg組、高脂膳食瘦素1mg/kg組。其中高脂飼料：普通飼料79%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1%。

1.4 動物造模及給藥[6,7]

正常對照組：給予普通飼料喂養8周后，繼續普通飼料喂養4周，同時每天灌胃0.1ml/10g生理鹽水，每天1次，連續4周。高脂膳食組：高脂飼料喂養8周后，繼續高脂飼料喂養4周，同時每天灌胃0.1ml/10g生理鹽水，每天1次，連續4周。高脂膳食瘦素0.5mg/kg組、高脂膳食瘦素1mg/kg組：高脂飼料喂養8周后，繼續高脂飼料喂養4周，同時每天分別對大鼠灌胃，灌胃劑量分別為0.5、1 mg/kg，每天一次，連續灌胃4周。

1.5 取材

連續灌胃4周結束后，將4%水合氯醛注射到小鼠腹腔，后剪斷小鼠下腔靜脈，充分放出血液并吸干血液，用鑷子捏住邊緣系膜結構將整個肝臟小心取出來，取肝臟中葉放于液氮罐中速凍30 min，每個肝臟多凍存幾份，轉移到-80℃冰箱，用于蛋白基因的提取。

1.6 Realtime PCR

提取RNA，將RNA通過逆轉錄HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以GAPDH為內參，計算出各組FAS、ACC-1、PPARγ、SREBP-1的相對表達量。操作體系:RNase Free dH20 9.5μL、cDNA 1 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Rrimer 1 μL、2×qPCR Mixture12.5 μL。反應程序，三步法：預變性：95℃、10min，變性：95℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、30s，40個循環。融解曲線分析：95℃、15s，58℃、1min，95℃、15s，58℃、15s，58℃、15s，95℃、0.5s。引物如表1。

表1 引物

1.7 統計學方法

應用SPSS 20.0軟件進行統計分析。所有實驗重復3次，定量結果采用均數±標準差（）表示。兩組之間定量數值比較采用獨立樣本T檢驗，多組之間定量數值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

各組小鼠肝臟組織中PPARγ、ACC-1、FAS、SREBP1 mRNA表達量的測定結果與正常組比較，高脂肪組小鼠肝臟組織中PPARγ、ACC-1、FAS、SREBP1 mRNA表達量均顯著下調（P＜0.01）；與高脂肪組比較，瘦素低、高劑量組小鼠肝臟組織中PPARγ mRNA表達量上調，瘦素高劑量組中小鼠肝臟組織中ACC-1、FAS、SREBP1 mRNA表達量顯著上調（P＜0.01）。見圖1～9。

圖1 PPARγ擴增曲線

3 討論

肥胖是一種慢性疾病，是食物攝入過多或機體代謝的改變而導致體內脂肪積聚過多造成體重過度增長的一種生理狀態，也是心腦血管疾病、Ⅱ型糖尿病、腫瘤等疾病的重要因素，是導致早死、致殘，影響人們生命健康及經濟負擔的重要公共衛生問題[1,8]。隨著研究的深入，認為高脂膳食引起的肥胖可能很大程度上是取決于機體能量代謝相關基因發生變化，從而使得脂質合成與分解、脂肪酸氧化代謝等異常[9-11]。

固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1）作為脂質合成的關鍵轉錄因子，被活化后能夠啟動下游靶基因脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-Coa carboxylase，ACC-1）等與脂質合成相關的關鍵酶合成，進而參與脂質的合成。FAS催化長鏈脂肪酸合成，ACC-1催化丙二酰輔酶A合成，因此在脂肪酸和甘油三酯的代謝過程中發揮重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR）是參與脂質合成、分泌及積累的轉錄因子。其中PPARγ促進脂肪代謝限速酶合成，進而增強脂肪代謝限速酶的抗脂質分解作用，使本該流向肌肉及肝臟的游離脂肪酸流向脂肪組織，進而減少糖異生。激活PPARγ后，脂質細胞不僅形態上發生一些變化，還會出現脂質的積累及胰島素的敏感等現象。因此，通過調控PPARγ、FAS、ACC1、SREBP-1的表達對于肥胖引起的脂質積聚具有重要的意義。

1950年，Ingalls發現了一種會誘導肥胖和糖尿病的“肥胖基因”，后經過多年學者研究，利用定位克隆技術獲得了肥胖基因，并將這種基因編碼的細胞因子命名為瘦素（leptin）。瘦素由骨骼肌、心臟、胃黏膜、肝臟、胰臟、卵巢等部位產生和分泌，也可以由脂肪組織分泌，瘦素具有很強的親水性，能夠以單體形式存在于血漿中，并可以通過促進甘油三酯分解，抑制脂肪酸合成酶表達，最終發揮抑制脂肪合成的作用[12,13]。有研究發現將肥胖小鼠給予瘦素蛋白，發現肥胖小鼠的食物攝入量顯著降低，解剖后也發現其脂肪組織量明顯降低[14,15]。說明瘦素具有調節脂肪合成的作用。因此本研究進一步通過Realtitme PCR檢測瘦素對肥胖小鼠肝臟組織中脂肪合成相關基因表達的影響，以進一步探討其對脂質合成影響的機制。Realtitme PCR檢測結果表明瘦素能夠顯著的上調PPARγ、FAS、ACC1、SREBP-1 mRNA表達，從而抑制肥胖引起的小鼠脂質積聚。

圖2 PPARγ溶解曲線

圖3 ACC-1擴增曲線

圖4 ACC-1溶解曲線

圖5 FAS擴增曲線

圖6 FAS溶解曲線

圖7 SREBP1擴增曲線

圖8 SREBP1溶解曲線

圖9 PPARγ、ACC-1、FAS、SREBP1 mRNA表達量柱狀圖與正常對照組比較，**P＜0.01；與高脂肪組比較，P＜0.01

另外有研究表明韓國濟州島紅海菜（GEE）60%乙醇提取物對3T3-L1細胞和高脂飲食（HFD）誘導的肥胖小鼠具有抗脂肪活性。體內肥胖小鼠實驗表明GEE能夠顯著降低脂肪生成蛋白SRBEP-1和PPARγ表達，進而降低肥胖小鼠體重及脂肪肝、血清甘油三酯、總膽固醇含量。體外實驗表明GEE能顯著降低3T3-L1細胞中PPARγ和C/EBPαmRNA表達，進而減少細胞內脂質的積累[16]。膠原肽喂養高脂飲食喂養的小鼠，SREBP-1、FAS、ACC1、SREBP-2及3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶（HMGCR））的蛋白表達水平顯著降低，PPARα、肉堿棕櫚酰轉移酶1（CTP1））和膽汁酸（細胞色素P450家族7亞家族系成員1（CYP7A1））的合成提高，從而說明膠原肽具有抑制肥胖飲食小鼠脂肪堆積和調節脂質代謝的作用[17]。以上這些研究認為GEE、膠原肽有望成為治療肥胖相關問題的藥物，在結合本實驗研究結果，進一步推測瘦素也可能成為治療肥胖的新型藥物。

綜上所述，瘦素可以通過調節脂質合成相關基因表達影響肥胖飲食小鼠脂質代謝。但缺乏對其作用機制研究，本課題組下一步將對瘦素調節脂質合成相關基因表達具體機制進行深入探究，為瘦素臨床應用提供理論依據。