L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中4種有害醛類形成的抑制作用及其品質的改善效果

劉百里，鄭潔，黃才歡，劉付，歐仕益

（暨南大學理工學院，焙烤食品安全粵港聯合創新平臺，廣東廣州 510632）

曲奇是全世界最受歡迎的烘焙產品之一[1]。它們含有大量糖、蛋白質和脂質，并經過高溫烘烤處理，因此曲奇是研究美拉德反應衍生的化學危害的典型模型。以往研究焙烤加工食品的有害物方面多專注于丙烯酰胺問題[2]。然而，在美拉德反應或糖類的直接熱裂解過程中，還會產生5-羥甲基糠醛（HMF）、α-二羰基化合物如3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG）、乙二醛（GO）、丙酮醛（MGO）等[3]。此外，脂質氧化也會產生GO、MGO等α-二羰基化合物[4]。研究表明，HMF可生物轉化為5-亞砜甲基-2-糠醛（SMF），后者能夠與DNA發生反應且具有潛在致癌性[5]。二羰基化合物與蛋白質反應形成晚期糖基化終末產物（AGEs），AGEs與多種和年齡相關的慢性炎癥疾病的發展相關，例如糖尿病、心血管疾病[6]、癌癥[7]、中樞神經系統疾病[8]。在分子水平上，羥基酪醇可以有效捕獲乙二醛和丙酮醛，它們與3-脫氧葡萄糖醛酮一起，代表了食物中最豐富的二羰基化合物[9]。L-半胱氨酸由發酵法制得，我國年產約1×104t[10]。它是一種還原劑，能切斷蛋白質分子內的二硫鍵進而弱化蛋白質的結構，使蛋白質伸展開。L-半胱氨酸在食品、化妝品和醫藥保健品中有廣泛用途，其中食品添加劑用途占比60%以上。同時，L-半胱氨酸還具有抗氧化應激、改善人體脂質代謝和益生元等作用[11]。

根據課題組前期研究，在生理條件下半胱氨酸可以與3-DG、GO、MGO、HMF形成加合物并降低細胞毒性，如丙烯醛的毒性降低近60倍[12,13]。因L-半胱氨酸溶解度小，食品工業中都用其鹽酸鹽；L-半胱氨酸鹽酸鹽是面粉改良劑，但在曲奇中的使用劑量，能否顯著降低以上四種有害醛類還未知。因此，本研究通過將不同添加量的L-半胱氨酸鹽酸鹽加于曲奇中，研究對曲奇外觀品質、4種有害醛類含量及細胞毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低筋小麥粉，益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；酥油、烤焙油，天津南僑食品有限公司；二甲基亞砜、氯化鈉、蔗糖、碳酸氫鈉，均為分析純，天津大茂有限公司；2,4-二硝基苯肼、鄰苯二胺、甲醇，德國默克試劑有限公司；5-羥甲基糠醛（98%），北京百靈威科技有限公司；乙二醛、丙酮醛，質量分數40%水溶液，北京百靈威科技有限公司；3-脫氧葡萄糖醛酮，加拿大TRC有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（99%），北京夢怡美生物科技有限公司；MTT，德國BIOFROX公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜、GCMS-QP2010 ULTRA氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司；Centrifuge 5810 R離心機，德國Eppendorf公司；XW-80A型微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；SPECTRONIC-200分光光度計，賽默飛；QTS質構儀，英國Stable.Micro System公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 曲奇的制備

參照美國AACC 10-54[14]方法制作曲奇。曲奇配方如表1（原料小麥粉不含有L-半胱氨酸鹽酸鹽）所示，首先將酥油迅速攪拌，加入蔗糖、奶粉、鹽、小蘇打攪打；之后取高果糖漿、碳酸氫銨、水，混合再向其中添加L-半胱氨酸鹽酸鹽（L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為0.0、0.3、0.6、1.0、1.5 g/kg）制得混合溶液。將溶液與干粉料攪拌均勻，置于心型模具內制成曲奇，放在預熱45 min后的烤箱中，于200 ℃下烘焙15 min制得曲奇。

表1 曲奇配料 Table 1 Cookie ingredients (g)

1.3.2 感官評價

構建感官評價小組，小組有12名成員（3名男性和9名女性，年齡21至24歲）。對曲奇樣品進行評價，分別從顏色、形態、香味、甜味、細膩度、裹齒感、后味七個特性分析。每種特性分數構成為：顏色0～20分，形態0～15分，香味0～15分，甜味0～15分，細膩度0～10分，裹齒感0～10分，后味～15分。

1.3.3 曲奇中揮發性風味物質的測定

根據鐘京等[15]的方法稍加改動，采用固相微萃取方法檢測曲奇中風味物質。取5 g研磨后的曲奇樣品放入40 mL的頂空采樣瓶中，于60 ℃恒溫條件下吸附萃取30 min。吸附結束后，將萃取頭立即插入氣相色譜-質譜聯用儀進樣口，于250 ℃解析3 min，進行分析。色譜條件：DB-5MS色譜柱（300 mm×0.25 mm，0.25 μm）；載氣（氦氣）流量：恒定流速，0.8 mL/min；升溫程序：初溫40 ℃，保留3 min，以5 ℃/min升至90 ℃，之后按照12 ℃/min升至220 ℃，保留7 min。

質譜條件：離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，電離方式為電子轟擊（electron impact），質量掃描范圍為30～490。

1.3.4 曲奇白度、質構測定

采用白度計對曲奇樣品的色度進行測定，以L*、a*和b*為色度參數。用質構分析儀檢測曲奇樣品的質構（配備探頭TA11/1000和TA90平臺），測試速度2 mm/s，觸發點負載1 g，返回速度2 mm/s[16]。

1.3.5 曲奇中水提物的制備

將1 g研磨后的曲奇樣品置于50 mL離心管中，加入5 mL去離子水，渦旋3 min，在10000 r/min下離心10 min，收集上清液，用5 mL去離子水重復提取兩次，合并上清液，用去離子水定容至15 mL。

1.3.6 HMF的測定

將曲奇水提物用0.22 μm濾膜過濾，參照Huang等[17]的方法，進行高效液相色譜分析，色譜柱為Zorbax SB-Aq柱。流動相：5%甲醇水溶液；樣品進樣體積：10 μL；流速：0.6 mL/min；檢測波長：284 nm。通過HMF標準曲線定量。HMF的標準曲線的回歸方程為y=101278x-145308（R2=0.9992，線性范圍10～600 μg/mL）。每處理重復3次。

1.3.7 MGO、3-DG的測定

對于MGO和3-DG的檢測采用OPD衍生法進行高效液相色譜檢測，取1.0 mL樣品水提物與100 μL 10%（m/V）鄰苯二胺甲醇溶液混合后，60 ℃水浴避光衍生24 h。將衍生后的混合物用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液采用HPLC測定?；旌暇鶆蚝笤?0 ℃水浴中加熱60 min，然后取出用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液進樣分析。根據Ou等[18]的方法，樣品分離在Zorbax SB-Aq柱上進行，流動相：A為0.1%乙酸水，B為甲醇，進行梯度洗脫，梯度程序設置：B=28%～43%，0.00～15.00 min；B=43%～75%，15.01～ 30.00 min；B=75%，30.01～35.00 min。流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL，柱溫：40 ℃，檢測波長：314 nm。通過MGO和3-DG的標準曲線進行定量，其中MGO濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2 μmol/mL，3-DG濃度為10、30、50、70、90、120 μg/mL由本實驗測得標準曲線回歸方程：MGO為y=2128405.56x- 12276.93（R2=0.9996，線性范圍0.1～1.2 μmol/mL）3-DG為y=21986.31x+3027.17（R2=0.9999，線性范圍10～120 μg/mL）。每處理重復3次。

1.3.8 GO的測定

對于GO的檢測采用2,4-二硝基苯肼衍生法[19]進行高效液相色譜檢測。取0.2 mL樣品水提物加入1.8 mL乙腈和1 mL DNPH（濃度為12.5 mmol/L溶于乙腈/濃鹽酸9:1）混合均勻后在70 ℃水浴中加熱2 h，冷卻后取出用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液進樣分析。根據Ou等[18]的方法，流動相A為0.1%乙酸水，流動相B為甲醇，進行梯度洗脫，梯度程序設置：

B=28%～43%，0.00～15.00 min；B=43%～75%，15.01～ 30.00 min；B=75%，30.01～35.00 min。進樣量：10 μL；流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃。檢測波長：435 nm。繪制GO的標準曲線進行定量，其中GO的濃度設置為0.01、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/mL，由本實驗測得GO的標準曲線回歸方程如下y=3095277.65x-15928.29（R2=0.99，線性范圍0.01～0.40 μmol/mL）。每處理重復3次。

1.3.9 細胞活力

通過MTT法檢測曲奇水提物對人胃粘膜上皮細胞（GES-1）的毒性，向96孔細胞培養板中加入100 μL 104cells/mL的GES-1細胞單細胞懸液，然后加入100 μL曲奇水提物在37 ℃培養箱中培養24 h，移除培養液，用120 μL含有5 mg/mL MTT溶液的培養基替代藥物，37 ℃繼續培養4 h后終止培養，移除培養液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置于搖床上振蕩10 min，然后在570 nm處檢測吸光度。每處理重復3次。

1.4 數據分析

實驗數據采用Microsoft Excel軟件處理，使用平均數±標準差（mean±SD）表示，應用SPSS 25.0軟件進行方差分析，并在p=0.05水平下進行Duncan’s顯著性差異分析。

2 結果與討論

2.1 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇感官、色澤和質地的影響

感官評價的結果如表2所示。從顏色、形態、香味、甜味、細膩度、裹齒感、后味七個屬性的得分分析，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后曲奇的感官評價得分高于空白組，當L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為1.0 g/kg時，曲奇的感官評價得分最高。

表2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇的感官評分的影響 Table 2 The sensory scores of cookies after adding L-cysteine hydrochloride

曲奇的白度可以通過三個參數來確定，即L*值、a*值和b*值，其中L*值表示黑色（0）/白色（100）顏色，a*值表示綠色（-）/紅色（+），b*值表示藍色（-）/黃色（+）[20]。隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增大，L*值顯著提高，b*值下降，證實了曲奇經L-半胱氨酸鹽酸鹽處理后會變白。

隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加，硬度先升后降。在1.5 g/kg添加量時硬度小于空白組曲奇，咀嚼性顯著增加。所以，L-半胱氨酸鹽酸鹽可對曲奇質構中的硬度和咀嚼性有較大的影響，可使曲奇口感變得更酥脆[21]。

表3 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇質構的影響 Table 3 Effect of L-cysteine hydrochloride on texture in cookies

2.2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中二羰基化合物含量的影響

在本實驗中，我們研究了L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中3種二羰基化合物（3-DG、GO、MGO）的影響。二羰基化合物3-DG、GO、MGO等化學性質非?；顫?，對人體健康產生有害影響，是焙烤食品中需要把控的物質[22]。

由表4可知，L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加可顯著降低曲奇中3-DG、GO、MGO的含量。

表4 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中3-DG、GO、MGO的影響(mg/kg) Table 4 Effect of L-cysteine hydrochloride on 3-DG, GO, and MGO in cookies (mg/kg)

當L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量為0.3 g/kg時，3-DG含量顯著下降，減少了30.05%（p＜0.05），隨著添加量繼續增大，3-DG、GO、MGO都有顯著降低，L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為1.5 g/kg時，3-DG、GO、MGO含量分別下降了62.73%、46.27%、36.59%（p＜0.05）。以往的研究中，Liu等[23]在熱加工模擬體系中添加槲皮素分別降低MGO、GO含量32.60%、40.48%。與此結果相比，L-半胱氨酸鹽酸鹽效果較好。實驗結果表明，L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中產生的二羰基化合物有明顯的抑制作用，能有效地降低烘焙過程中產生的有害物。這可能是因為L-半胱氨酸和二羰基化合物形成了加合產物[13]。

2.3 L-半胱氨酸鹽酸鹽對HMF的影響

研究表明HMF在高濃度下具有細胞毒性，對眼睛、上呼吸道、皮膚和粘膜有刺激性[24]。由表5可知，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽可顯著降低曲奇中的HMF含量：當添加量達到0.3 g/kg后，HMF顯著下降，降低幅度達到28.75%（p＜0.05）。繼續增加L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量，抑制率顯著增加，添加量至1.5 g/kg時，HMF下降82.95%。

表5 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中HMF的影響 Table 5 Effect of L-cysteine hydrochloride on HMF in cookies

2.4 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中揮發性風味物質的影響

半胱氨酸可以通過美拉德反應產生肉香、燒烤風味[25]。添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后，曲奇中的揮發性醛、醇和吡嗪含量升高，除呋喃酮外大部分酮類物質含量減少。如表6所示，風味物質含量采用峰面積歸一化法計算。吡嗪類物質在對照組中檢測到2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪，添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后增加了2,3-二甲基-吡嗪，2-(正丙基)-吡嗪。其中添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪含量分別增加了72.51%、92.54%、40%，2,6-二甲基吡嗪含量降低11.18%。醇類物質在對照組中檢測到苯甲醇、乙醛縮丙醇苯乙醇、3-呋喃甲醇、1-戊醇、1-辛醇、1,2-丙二醇、3-甲基-4戊烯-1醇、2,3-丁二醇、葉醇，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后1,2-丙二醇、3-甲基-4戊烯-1醇含量分別降低72.22%、100%，苯甲醇、乙醛縮丙醇苯乙醇、3-呋喃甲醇、葉醇含量分別升高80%、25%、8.15%、4.65%。醛類物質在對照組中檢測到乙醛、壬醛、糠醛、2,4-二甲基-苯甲醛、辛烷醛，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后增加了桃醛、反式-2,4-癸二烯醛、苯甲醛、2-噻吩甲醛。添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后，壬醛、2,4-二甲基-苯甲醛、辛烷醛含量分別升高85.71%、728.57%、66.67%，乙醛、糠醛含量分別降低88.24%、43.59%。酮類物質在對照組中檢測到1-羥基-2-丙酮、3,4-二氫-6-甲基-2H-吡喃-2-酮、5-乙基二氫-2(3H)-呋喃酮、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、3-甲基-1,2-環戊二酮、1-羥基-2-丁酮、2-庚酮、3-[3-溴苯基]-7-氯-3,4-二氫-10-羥基-1,9(2H,10H)-吖啶二酮、2(5H)-呋喃酮、二氫-5-丙基-2(3H)-呋喃酮、5-丁基二氫-2(3H)-呋喃酮、二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮、5-己基二氫-2(3H)-呋喃酮，添加前后酮種類基本不變，含量有較明顯變化，在添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后3-[3-溴苯基]-7-氯-3,4-二氫-10-羥基-1,9(2H,10H)-吖啶二酮、2-庚酮、2(5H)-呋喃酮、5-丁基二氫-2(3H)-呋喃酮、二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮含量分別升高200%、17.24%、7.69%、46.27%、176.14%，1-羥基-2-丙酮、3-甲基-1,2-環戊二酮、1-羥基-2-丁酮、二氫-5-丙基-2(3H)-呋喃酮物質含量分別降低4.75%、61.90%、79.31%、42.67%。這可能是因為半胱氨酸和還原糖的美拉德反應會降低脂肪族羰基的水平源自脂質氧化和降解的化合物，例如酮[26]。含硫化合物-噻吩是肉香味的重要來源[27]。對照組中檢測到4-甲基-5-(beta-羥乙基)噻唑，在添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后增加了2-乙基-噻唑、2-乙酰噻唑。

表6 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中揮發性風味物質的影響 Table 6 Effect of L-cysteine hydrochloride on the volatile flavor substances in cookies

續表6

2.5 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇水提物細胞毒性的影響

采用人胃粘膜細胞（GES-1）研究了曲奇水提物對細胞活力的影響。未加藥的對照組細胞存活率為84.8%，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽的曲奇水提物培養GES-1細胞的存活率分別為103.7%、100.9%、86.3%、99.2%。添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽的曲奇水提物培養細胞的存活率均有提高，說明L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加對GES-1細胞活力有促進作用。

3 結論

本實驗通過添加不同量L-半胱氨酸鹽酸鹽，研究對烘焙曲奇外觀品質及有害物質的影響。研究表明：L-半胱氨酸鹽酸鹽提高了曲奇的白度和感官評分，更加酥脆的口感。抑制了曲奇中的活潑羰基化合物（HMF、3-DG、GO、MGO）的形成。同時對風味成分有不同程度的影響，揮發性醛、醇和吡嗪含量升高，除呋喃酮外大部分酮類物質含量減少。添加L-半胱氨酸鹽酸鹽對細胞沒有抑制作用。結合實驗數據分析可以得出結論，在1.0 g/kg L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量時，曲奇的外觀、氣味、口感均令人滿意，有害醛類含量較少且對GES-1細胞活力有促進作用。