不同旱養方式對鵝睪丸及外生殖器組織形態學的影響

卿恩華,唐彬鋮,牛 添,王珺琦,陳朝顏,胡繼偉,何 樺,李 亮,王繼文*,胡深強*

(1.四川農業大學 “畜禽遺傳資源發掘與創新利用”四川省重點實驗室,成都 611130;2.四川農業大學動物遺傳育種研究所,農業農村部畜禽生物組學重點實驗室,成都 611130)

研究表明,所有鳥類繁殖都通過體內受精完成,但僅有約3%雄鳥保留了外生殖器,在家禽上僅包括鴨和鵝,外生殖器發育狀況如尺寸大小、結構特征等與公禽交配行為和授精能力密切相關。公鵝生殖系統由雙側睪丸、附睪和輸精管以及一個外生殖器構成[1]。一般認為,公鵝配種能力主要取決于外生殖器和睪丸發育狀況與精液品質,其中外生殖器正常發育是自然交配發生的前提條件,而睪丸正常發育是精子發生的基礎。與同為家禽的雞、鴨等相比,公鵝繁殖性能較差,主要體現為公鵝繁殖具有明顯的季節性和擇偶性,出現外生殖器發育異常、性欲不振、無精、弱精等繁殖障礙比例高,且自然交配下種蛋受精率和孵化率均較低,這成為制約鵝產業發展的瓶頸因素[2-3]。

近些年,在畜禽種業振興、食品安全、環保壓力等新形勢下,我國水禽產業正逐步從傳統水邊粗放散養向現代規?；s化旱地養殖模式轉型升級,為適應新的養殖方式及滿足現代育種和生產要求,鵝的交配方式也將從自然交配向人工授精轉變,因此提高旱地養殖模式下公鵝的繁殖性能已成為當前鵝育種和生產者的主要目標之一[4]。研究表明,公禽的生殖器官發育受到日齡[5-7]、營養[8-11]、氣候[12-16](如光照、溫濕度等)、飼養方式等多因素的影響,其中飼養方式是重要的影響因素。前人研究發現,飼養方式轉變對公雞、公鴨繁殖性能均有顯著影響。例如,Du等[17]研究結果表明,相較于籠養,放養條件下公雞的精液量和精子活率更高;Shaheen等[18]研究結果表明,與地面平養條件下自然交配模式相比,籠養人工授精模式下的公雞繁殖性能損耗較低且繁殖效率更高;Etuk等[19]研究結果表明,飼養方式對番鴨精液品質如精子濃度、精子活率等有顯著影響;趙小玲等[20]分析了單籠和本交籠對肉雞睪丸發育和生殖激素含量的影響,發現本交籠混養的公雞睪丸重量和曲精小管面積均顯著大于單籠飼養。Alam等[21]有關肉雞的研究結果表明,與地面飼養相比,籠養能提高肉雞的產蛋量、生育能力、孵化率,并降低死亡率。Zhang等[22]對巢湖鴨的研究表明,網上養殖的鴨脂肪含量更高,血清中膽固醇含量更低,健康狀態更好。ukaszewicz等[23]研究結果表明,與半放牧方式相比,放牧條件下公鵝血清睪酮含量及精液品質更優。鵝的旱養方式主要包括地面平養、網上平養、地面網上混合平養、籠養等;相較于地面飼養,網上平養和籠養均實現了糞污分離,且更有利于養殖環境控制和日常飼養管理,顯著提高了生產效率[24-26]。然而,目前有關飼養方式尤其是籠養和混合平養對公鵝繁殖性能影響的研究報道還不多見。鑒于此,本研究以繁殖性能優秀的四川白鵝公鵝為試驗對象,通過比較分析籠養和網上地面混合平養對鵝睪丸及外生殖器形態學、組織學的影響,旨在為旱養條件下公鵝適宜的飼養方式選擇及提高公鵝繁殖性能提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品采集

本研究所用的100只四川白鵝公鵝均由四川農業大學水禽育種場(雅安,四川)提供,用于飼養試驗鵝的圈舍、籠具、料槽等設施設備在飼養前都進行了徹底的清洗和消毒。所有試驗鵝只均來自同批孵化的種蛋,并在相同的環境條件下進行育雛和上籠飼養,具體飼養管理制度為:第0～28日齡進行室內網上育雛,第29～120日齡進行室內網上地面混合平養,于第120日齡時挑選60只精神狀態良好、健康和體重相近的公鵝等分為2組(每組30只),分別進行籠養和網上地面混合平養,兩組均飼喂相同的飼料,具體飼料成分及含量列于表1;其中,籠養采用單籠飼養,單籠尺寸為長(0.55 m)×寬(0.37 m)×高(0.7 m);混合平養圈舍尺寸為長(13 m)×寬(6 m),由60 m2的網上平養區域和18 m2的地面平養區域構成。當飼養至270日齡(體成熟階段)時,對所有試驗鵝禁食12 h后,從各組隨機挑選16只活體測定其體重及外生殖器相關形態學指標,然后進行屠宰并測定宰后睪丸和外生殖器相關形態學指標,最后從各組采集8只鵝的左側睪丸和外生殖器用于組織學分析。

表1 飼料成分及含量Table 1 The feed ingredients and contents

1.2 形態學指標測定

禁食結束后,首先測定活體重量,然后對公鵝進行翻肛,使其外生殖器完全露出,記錄外生殖器螺旋數后,使用游標卡尺測量其基部直徑、自然長度和拉直長度。其中,基部直徑指鵝外生殖器基部的橫向長度;自然長度指鵝外生殖器完全露出后,其頂部至基部的長度;拉直長度指使用外力將鵝外生殖器拉至最長時,其頂部到基部的長度。將鵝頸靜脈放血處死后,迅速開膛取出雙側睪丸和外生殖器,使用電子天平測定左、右和雙側睪丸重量以及外生殖器重量,并使用游標卡尺測量各側睪丸的長徑、短徑和背腹徑;其中,長徑指睪丸腹側縱向長度,短徑指睪丸腹側橫向長度,背腹徑指睪丸背側至腹側的長度。睪丸和外生殖器的器官指數計算公示如下:睪丸器官指數=睪丸重量(g)/活體重量(g);外生殖器器官指數=外生殖器重量(g)/活體重量(g)。

1.3 組織學指標測定

首先將新鮮采集的鵝左側睪丸及外生殖器組織固定于4%多聚甲醛24 h以上,接著取出組織在通風櫥內用手術刀將切片部位修剪平整,然后將修剪好的組織放于脫水盒內,并采用不同濃度酒精、醇苯、二甲苯和蠟進行梯度脫水與浸蠟,最后置于切片機上進行切片,單張切片厚度約4～6 μm,每只鵝的睪丸和外生殖器組織均至少制作3張切片。將制作好的石蠟切片烘干、脫蠟后,采用蘇木精和伊紅進行H&E染色,隨后將染色后的鵝睪丸和外生殖器切片置于顯微鏡(BX53,OLYMPUS,美國)下觀察和拍照。每張切片至少選取3個不同視野進行組織學指標測量,采用 Image-Pro Plus 6.0軟件對每個視野內睪丸(曲徑細管直徑、實質面積、間質面積、生精上皮厚度等)或外生殖器(角化上皮厚度、外層膠原蛋白厚度、內層膠原蛋白厚度、淋巴管腔直徑等)組織學指標進行測量,并對睪丸切片視野中曲精細管、支持細胞、間質細胞、精原細胞、生殖細胞等進行計數。實質間質比計算公示如下:實質間質比=實質面積/間質面積。

1.4 數據統計分析

所有試驗結果均以“平均值±標準差”的形式表示。應用SAS 9.4軟件對鵝生殖器官形態學和組織學數據進行統計分析,采用單因素方差分析(ANOVA)比較兩組之間是否存在統計學差異,采用Pearson系數分析不同指標之間的相關性。P<0.01表示組間差異極顯著或不同指標間極顯著相關,P<0.05表示組間差異顯著或不同指標間顯著相關。采用GraphPad Prism 8.0軟件用于可視化統計結果分析。

2 結 果

2.1 籠養和混合平養方式下鵝睪丸及外生殖器形態學的比較分析

如圖1所示,在睪丸形態學層面,相較于混合平養組,籠養組鵝的左、右側睪丸尺寸和體積均相對較大。進一步統計分析發現,籠養組鵝左側、右側和雙側睪丸重量均極顯著高于混合平養組(P<0.01),且籠養組鵝左側、右側和雙側睪丸器官指數均極顯著高于混合平養組(P<0.01);與此同時,籠養組鵝右側睪丸長徑以及左側、右側睪丸短徑均顯著高于混合平養(P<0.05),但兩組之間左側睪丸長徑、背腹徑以及右側睪丸背腹徑差異不顯著(P>0.05)。

a. 籠養組代表公鵝的睪丸照片。R1～R3分別為各組代表個體1～3,L代表左側睪丸,R代表右側睪丸,下同。b. 混合平養組代表公鵝的睪丸照片。c. 睪丸重量。d. 睪丸器官指數。e. 睪丸形態學指標?！?”表示兩組間差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(P<0.01),下同a. The pictures of testes from representative male geese in CRS. R1-R3 represent individual 1-3. L represents the left testis, while R represents the right testis. Below is the same. b. The pictures of testes of male geese in MRS. c. The testicular weight. d. The testicular organ index. e. The testicular morphological parameters. "*" indicates a significant difference between the two groups (P<0.05), while "**" indicates an extremely significant difference between the two groups (P<0.01). Below is the same圖1 籠養和混合平養組鵝睪丸的形態學差異Fig.1 Morphological difference of the geese testis between the CRS and MRS groups

如圖2所示,在外生殖器形態學層面,相較于混合平養組,籠養組鵝的外生殖器尺寸相對較大、螺旋結構更明顯。統計學分析結果顯示,籠養組鵝外生殖器的自然長度和基部直徑顯著高于混合平養組(P<0.05),拉直長度極顯著高于混合平養組(P<0.01),但兩組之間鵝外生殖器重量及其器官指數和螺旋數差異不顯著(P>0.05)。

a. 籠養組代表公鵝的外生殖器照片;b. 混合平養組代表公鵝的外生殖器照片;c. 外生殖器重量;d. 外生殖器器官指數;e. 外生殖器螺旋數;f. 外生殖器形態學指標a. The pictures of the external genitalia from representative male geese in CRS; b. The pictures of the external genitalia from representative male geese in MRS; c. The external genital weight; d. The external genital organ index; e. The external genital helical number; f. The morphological parameters of the external genitalia圖2 籠養和混合平養組鵝外生殖器的形態學差異Fig.2 Morphological difference of the geese external genitalia between the CRS and MRS groups

2.2 籠養和混合平養方式下鵝睪丸及外生殖器組織學的比較分析

如圖3所示,在睪丸組織學層面,從兩種飼養方式下鵝睪丸切片中均能觀察到相似的曲精細管、生精上皮、間質細胞、支持細胞、精原細胞等組織學構成,但兩組之間部分組織學結構在數量和直徑上存在差異。統計學分析結果顯示,籠養組鵝睪丸精原細胞數量顯著高于混合平養組(P<0.05),睪丸實質間質比、生精上皮厚度、支持細胞數量和生殖細胞數量均極顯著高于混合平養組(P<0.01),且籠養組鵝睪丸間質細胞密度和曲精細管數量極顯著低于混合平養組(P<0.01),但籠養組與混合平養組鵝睪丸曲精細管直徑之間差異不顯著(P>0.05)。

如圖4所示,在外生殖器組織學層面,從兩種飼養方式下鵝外生殖器切片中均能觀察到角化上皮、外層膠原蛋白、內層膠原蛋白和淋巴管腔等組織學構成,但兩組之間部分組織學結構在厚度上存在差異。統計學分析結果顯示,籠養組鵝外生殖器的角化上皮厚度顯著低于混合平養組(P<0.05),但兩組之間外生殖器的外層膠原蛋白厚度、內層膠原蛋白厚度和淋巴管腔直徑差異均不顯著(P>0.05)。

a. 籠養組鵝外生殖器組織學結構.b. 混合平養組鵝外生殖器組織學結構。Ke. 角化上皮;Oc. 外層膠原蛋白;Ce. 內層膠原蛋白;Ll. 淋巴管腔。c. 外生殖器組織學指標a. Histological structure of the geese external genitalia in CRS. b. Histological structure of the geese external genitalia in MRS. Ke. Keratinized epithelium; Oc. Outer collagen; Ce. Inner collagen; Ll. Lymphatic lumen. c. The external genital histological parameters圖4 籠養和混合平養組鵝外生殖器的組織學差異Fig.4 Histological difference of the goose external genitalia between the CRS and MRS groups

2.3 鵝睪丸和外生殖器形態學與組織學指標的相關性分析

本研究進一步對兩種飼養方式下鵝睪丸、外生殖器的組織形態學指標進行了相關性分析。睪丸指標之間的相關性分析結果如圖5a所示,鵝睪丸重量、長徑、短徑及其器官指數均與生精上皮厚度、曲精細管直徑、生殖細胞數量呈顯著(P<0.05)或極顯著正相關(P<0.01),與曲精細管個數呈極顯著負相關(P<0.01);睪丸長徑、短徑及其器官指數與實質間質比呈顯著正相關(P<0.05);睪丸重量、長徑、短徑及其器官指數與間質細胞數量均不顯著相關(P>0.05)。

外生殖器指標之間的相關性分析結果如圖5b所示,鵝外生殖器內層膠原蛋白厚度與其自然長度、螺旋數均呈極顯著正相關(P<0.01);外生殖器重量與其拉直長度、基部直徑呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關;外生殖器基部直徑與其自然長度、拉直長度、螺旋數均呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關;外生殖器角化上皮厚度、外層膠原蛋白厚度和淋巴管腔直徑與其自然長度、拉直長度、基部直徑和螺旋數均不顯著相關(P>0.05)。

2.4 不同飼養方式下鵝睪丸與外生殖器組織形態學的相關性分析

本研究進一步分別對籠養、混合平養方式下的鵝睪丸與外生殖器組織形態學指標進行了相關性分析?；\養組的相關性分析結果如圖6a所示,鵝睪丸重量、器官指數、長徑和短徑與外生殖器重量和器官指數呈極顯著正相關(P<0.01);睪丸器官指數與外生殖器拉直長度呈顯著正相關(P<0.05);睪丸實質間質比與外生殖器基部直徑呈顯著正相關(P<0.05),與外生殖器外層膠原蛋白厚度呈顯著負相關(P<0.05);睪丸生精上皮厚度與外生殖器拉直長度和螺旋數呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關;睪丸曲精細管數量與外生殖器重量、器官指數、拉直長度和基部直徑呈顯著負相關(P<0.05);睪丸支持細胞數量與淋巴管腔直徑呈顯著正相關(P<0.05);睪丸間質細胞數量與外生殖器基部直徑呈顯著負相關(P<0.05),與外層膠原蛋白厚度呈極顯著正相關(P<0.01);睪丸生殖細胞數量與外生殖器重量和器官指數呈極顯著正相關(P<0.01)。

圖6 籠養組(a)和混合平養組(b)鵝睪丸與外生殖器組織形態學指標的相關性熱圖Fig.6 Heatmap of the correlation analyses in the histomorphological parameters between the geese testis and external genitalia in CRS (a) and MRS (b) groups, respectively

混合平養組的相關性分析結果如圖6b所示,鵝睪丸短徑與外生殖器外層膠原蛋白厚度呈顯著正相關(P<0.05),與內層膠原蛋白厚度呈顯著負相關(P<0.05);睪丸器官指數與外生殖器螺旋數呈顯著負相關(P<0.05);睪丸曲精細管直徑與外生殖器膠原蛋白內層厚度呈顯著負相關(P<0.05);睪丸曲精細管數量與外生殖器重量和淋巴管腔直徑呈顯著負相關(P<0.05);睪丸精原細胞數量和外生殖器拉直長度呈顯著正相關(P<0.05)。

3 討 論

在當前鵝養殖模式轉型升級背景下,提高公鵝的配種能力已成為鵝育種和生產者的主要目標之一。公鵝生殖系統主要由睪丸和外生殖器組成,前者決定其生精能力,后者影響其交配行為。公鵝睪丸和外生殖器發育過程受到品種、營養、光照、溫度、飼養方式等因素影響,但目前有關飼養方式尤其是旱養方式對公鵝繁殖性能影響的研究報道十分匱乏。本研究以四川白鵝為試驗對象,比較分析了籠養和網上地面混合平養對公鵝睪丸、外生殖器形態學及組織學的影響。在形態學層面的研究結果顯示,籠養組鵝睪丸重量、器官指數、長徑和短徑均顯著高于混合平養組,且籠養組鵝外生殖器自然長度、拉直長度和基部直徑均顯著高于混合平養組,表明不同旱養方式顯著影響了鵝睪丸和外生殖器的發育過程,籠養較混合平養更利于公鵝生殖系統的發育。一般認為,雄性鳥類的射精次數、射精量和精子濃度均隨睪丸重量的增加而增加[27]。在一些雄性哺乳動物上,外生殖器自然長度更長、基部直徑更粗的個體精子密度更大[28]。在鵝上的研究結果顯示,自然交配條件下外生殖器螺旋數更多的公鵝授精成功率更高[29]。以上研究結果提示,相較于混合平養,籠養條件下公鵝的精液品質及配種能力可能更好。在組織學層面的研究結果顯示,與混合平養組相比,籠養方式下鵝睪丸實質間質比、生精上皮厚度和曲精細管面積更大,且精原細胞、支持細胞和生殖細胞數量更多;籠養方式下鵝外生殖器的角化上皮厚度更薄,表明不同旱養方式顯著影響了鵝睪丸和外生殖器的組織學結構。睪丸曲精細管是精子發生的重要場所[30],睪丸間質細胞和支持細胞負責合成并分泌調控生殖系統發育的生殖激素,且睪丸支持細胞還能為精子的生成過程提供穩定的環境[31-32]。外生殖器的角化上皮層起著屏障作用,能夠防止內部水分的流失[33-34]。由此推測,籠養組鵝睪丸的組織學結構可能更有利于精子生成,而混合平養組外生殖器的組織學結構可能更有利于抵抗環境中的有害物質。在網上地面混合平養方式下,公鵝群體內會出現采食不均、打架等現象,且不同個體在群體中的社會地位也不同,而單籠飼養方式下則不會出現這些問題且環境衛生條件更好,這可能是造成籠養組鵝睪丸和外生殖器發育更好的主要原因。

為進一步弄清鵝睪丸與外生殖發育之間的關聯性以及飼養方式對二者共同發育的影響,本研究對兩種飼養方式下鵝睪丸、外生殖器的組織形態學指標之間的相關性以及不同飼養方式鵝睪丸與外生殖器組織形態學指標的相關性進行了分析。結果顯示,鵝睪丸重量及其器官指數、睪丸長徑或短徑與其生精上皮厚度、曲精細管直徑、生殖細胞數量和精原細胞數量等顯著相關,表明鵝睪丸的形態學與組織學指標之間存在較強的相關性。同時,鵝外生殖器自然長度和螺旋數與其內層膠原蛋白厚度存在顯著正相關,而與其他組織學指標相關性不顯著,表明膠原蛋白厚度可能是影響鵝外生殖器發育的關鍵因素之一。研究表明,鵝外生殖器的發育主要受到由睪丸分泌的雄激素的調控[35],推測鵝外生殖器的發育與睪丸發育密切相關。與此推論一致,本研究結果證實了兩種飼養方式下鵝睪丸與外生殖器的組織形態學指標之間存在顯著相關性。其中,籠養組鵝睪丸重量及其器官指數、睪丸長徑或短徑、生精上皮厚度、曲精細管數量、支持細胞數量、間質細胞密度、生殖細胞數量與外生殖器重量及其器官指數、外層膠原蛋白厚度、螺旋數、淋巴管腔直徑呈顯著正或負相關;而混合平養組僅有睪丸長徑、短徑、曲精細管數量、曲精細管直徑、睪丸精原細胞數量與外生殖器拉直長度、螺旋數、外層膠原蛋白、內層膠原蛋白、淋巴管腔直徑存在顯著相關性。由此可知,兩種飼養方式下鵝睪丸與外生殖器的發育過程緊密相關,且籠養組鵝睪丸與外生殖器組織形態學指標之間的相關性更強。李明陽[36]對籠養蛋鴨舍的環境參數進行檢測后發現,籠舍上層空間中粉塵和細菌濃度較下層更低、風速更高,且NH3、CO2和水蒸氣濃度更低,進而更有利于降低家禽的應激水平,這直接導致上層蛋鴨的健康狀況更好、生產性能更高。在籠養條件下,鵝處于較上層的空間位置,其生活環境相較于混合平養條件而言更加穩定,且接觸到有害物質的機會更少,促使籠養方式更有利于鵝生殖器官的發育[37-38]。Du等[39]研究發現,在地面平養模式下公雞會因采食不均對其精液質量造成負面影響?？紤]到鵝是具有社會等級劃分的動物[14],混合平養方式下存在更多影響公鵝生殖系統發育的因素,如社會等級、應激、搶食、環境衛生等,這些因素造成了籠養組鵝睪丸與外生殖器發育更好且相關性更強。

4 結 論

綜上,與網上地面混合平養方式相比,120日齡上籠且持續150 d的單籠飼養方式顯著促進了公鵝生殖系統的發育,改善了睪丸生精能力,且籠養組睪丸與外生殖器發育的同步性更好。