靈芝多糖γ-氨基丁酸片制劑研究及其改善睡眠功能驗證

劉春芳,林永祿,陳亮,李菁,黎宇盛,曾榮華,許文東

(廣州白云山漢方現代藥業有限公司,中藥制藥過程技術與新藥創制國家工程研究中心,廣東 廣州,510240)

睡眠是維持機體平衡的最基本條件,睡眠障礙不僅損害身體健康,還會降低生活及工作質量[1-2]。存在睡眠障礙問題的人群相當龐大,據國外流行病學數據顯示,15%～35%的成年人存在睡眠質量問題[3]。中國睡眠研究會發布的《2021運動與睡眠白皮書》亦顯示,我國超3億人存在睡眠障礙,約38%成年人有失眠困擾。然而,醫學上并不建議輕易使用安定等鎮靜催眠類藥物,因為存在成癮性、停藥反跳等風險。含有特定功能因子的保健食品可有效地避免這些安全性問題,為失眠人群的健康難題提供新的應對方案。因此,面對免疫力低下或者睡眠障礙等亞健康問題的困擾,人們對于傳統中醫藥的藥食產品或者天然產品的需求愈加強烈。

靈芝藥用歷史悠久,具有滋補強壯、扶正固本的功效,是用于治未病的“上品”,在民間為藥膳食療之佳品,安全無副作用?，F代藥理研究表明,靈芝多糖是其關鍵功效成分,具有改善睡眠[4-5]、抗腫瘤、調節免疫、護肝、抗輻射等作用[6-8]。國內外對靈芝的研究已深入到免疫系統、中樞神經系統,但相關成果在產品開發上的應用卻十分有限,市場上除了靈芝飲片這類初加工產品,大多是由多種原料組成的大復方產品,靈芝特有的應用價值并未得到充分發揮。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種天然存在的功能性氨基酸,是哺乳動物中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質,具備改善睡眠[9-11]、降血壓、抗焦慮、改善記憶力、抗癲癇、抗衰老等多種生理功能[12]。GABA在日本等國家作為一種功能食品因子已廣泛應用于飲料、果醬以及其他功能食品中[13-14],在我國也是一種安全的新食品原料,可用于開發普通食品和保健食品,目前仍具有較大的應用前景。

結合現代營養學開發傳統中藥材是保健食品研發的新路徑。本研究旨在開發功能因子明確、質量穩定可控的靈芝新產品,充分發揮靈芝多糖在改善睡眠方面的優勢。通過將γ-氨基丁酸與富含靈芝多糖的靈芝提取物進行合理科學配伍,并制成易于服用、依從性好的片劑,使得二者產生出整體綜合效應,為睡眠保健市場提供安全可靠的優質選擇,也為藥食同源精深加工產品的開發提供發展模式借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝提取物,公司自制;γ-氨基丁酸,上海統園食品技術有限公司;麥芽糊精、玉米淀粉,中糧生化能源有限公司;微晶纖維素、硬脂酸鎂,湖州菱湖新望化學有限公司;交聯羧甲基纖維鈉、羧甲基淀粉鈉,曲阜市天利藥用輔料有限公司;乙醇,中山市華士達生物科技有限公司;以上物料均為食品級。聚維酮K30(藥品級),博愛新開源醫療科技集團股份有限公司。

靈芝多糖γ-氨基丁酸片,0.41 g/片(包衣),由實驗室自制,推薦服用量為每日1次,每次2片,以成人體重60 kg計,推薦量為0.013 7 g/kg。

SPF級KM雌性小白鼠,體重為18～22 g,由廣東省醫學實驗動物中心提供,生產許可證號 SCXK(粵)2018-0002。在溫度為(22±2) ℃、相對濕度為(55±15)%的屏障環境中飼養。

1.2 儀器與設備

DFY-500C萬能高速粉碎機,溫嶺市林大機械有限公司;BSA224S-CW電子分析天平,北京賽多利斯天平有限公司;BS210S型電子天平,德國賽多利斯;101C-3B型電熱鼓風干燥箱,上海實驗儀器廠有限公司;ZP-7旋轉式壓片機,上海天峰制藥設備有限公司;YD-20智能片劑硬度儀、ZB-1E智能崩解儀,天大天發科技有限公司;篩網。

1.3 實驗方法

1.3.1 片劑工藝研究

1.3.1.1 制備工藝流程

本品設計為片劑,根據前期的初步研究結果,靈芝提取物黏度較大,輔料使用量需達到60%～65%時才能較好成型。綜合考慮片劑大小、服用次數、服用量等影響依從性的因素,本品規格設定為0.4 g/片(素片),每日服用2片。工藝路線設計為:

主料與輔料混合→制軟材→制粒(20目篩)→干燥(烘干至水分為3%～5%)→整粒(20目篩)→總混→壓片→包衣→包裝等。

1.3.1.2 質量評價標準

本試驗選定制粒情況、壓片情況、片劑硬度和崩解時限作為評價指標,篩選輔料的種類及用量,以制備得到良好的片劑。

1.3.1.3 填充劑的篩選

本試驗選擇片劑常用的填充劑玉米淀粉、麥芽糊精和微晶纖維素進行篩選,通過加入不同種類及用量的填充劑進行試驗,以制備1 000片為1次試驗,試驗方案見表1,其他因素不變,根據制粒過程中顆粒的性狀和所得片劑的性能指標來選擇適宜的填充劑用量。

表1 填充劑的種類和用量優化設計 單位:g

1.3.1.4 黏合劑的篩選

根據預試驗結果,分別對100 g/L淀粉漿、400 g/L羥丙甲基纖維素水溶液、400 g/L羧甲基纖維素鈉水溶液和650 g/L聚維酮K30乙醇溶液進行篩選,添加量為處方量的10%,其他因素不變,以制粒過程中顆粒的性狀和所得片劑的性能指標為依據來選擇適宜的黏合劑。

1.3.1.5 崩解劑的篩選

根據預試驗分別對干淀粉、羧甲基淀粉鈉和交聯羧甲基纖維素鈉進行篩選,添加量為處方量的5%(質量分數,下同),其他因素不變,以所得片劑的性能指標為依據來選擇適宜的崩解劑。

1.3.1.6 潤滑劑的篩選

根據預試驗分別對滑石粉、微粉硅膠和硬脂酸鎂進行篩選,添加量為處方量的0.5%,其他因素不變,以所得片劑的性能指標為依據來選擇適宜的潤滑劑。

1.3.1.7 片劑制備工藝驗證

根據以上考察結果,優選最佳工藝,進行五批制劑工藝驗證試驗,每批壓制1 000片。使用60 g/L透明薄膜包衣預混液進行包衣,控制增重2%～2.5%,包衣溫度40～45 ℃,霧化壓力約0.4 MPa。記錄制粒情況,檢查片劑的外觀、硬度和崩解時限,并進行標志性成分含量測定。

1.3.2 改善睡眠功能學實驗

本研究中的動物實驗均依據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)進行,實施方案通過了倫理委員會審核和批準(實驗動物研究倫理審查申請書:W96-027C)。將SPF小鼠在實驗室條件下喂養適應3 d,以下每個實驗均隨機將48只小鼠分為4組,每組12只,每日灌胃給予受試物,給藥量根據每周體重增減調整,實驗時間為4周。

1.3.2.1 樣品配制及給藥途徑

實驗時稱取樣品0.35、0.7、2.05 g,分別用純凈水制成50 mL的藥液,形成低(0.07 g/kg BW)、中(0.14 g/kg BW)、高(0.41 g/kg BW)3個劑量組,相當于人推薦日服量的5、10、30倍。每日按0.1 mL/10 g BW經口灌胃受試物,陰性對照組給予同等體積的純凈水。

1.3.2.2 直接睡眠實驗

觀察受試組動物給予3個劑量的受試樣品、陰性對照組給予同等體積溶媒后,是否出現睡眠現象。當小鼠置于背臥位時,能立即翻正身位,如超過30～60 s不能翻正者,即認為翻正反射消失,進入睡眠。翻正反射恢復即為動物覺醒,翻正反射消失至恢復這段時間為動物睡眠時間,記錄陰性對照組與受試樣品組入睡動物數及睡眠時間。

1.3.2.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

動物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后15 min,給各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉55 mg/kg BW,注射量為0.1 mL/10 g BW,以翻正反射消失為指標,觀察受試樣品是否延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間。

1.3.2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

動物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后15 min,給各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg BW,記錄30 min內入睡動物數。

1.3.2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

動物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后15 min,給各組動物腹腔注射巴比妥鈉300 mg/kg BW,注射量為0.1 mL/10 g BW,以翻正反射消失為指標,觀察受試樣品對巴比妥鈉誘導睡眠潛伏期的影響。

1.4 數據處理

用SPSS軟件包對各實驗結果進行統計分析。其中,入睡動物數為計數資料,用X2檢驗,若四格表總例數<40,或總例數≥40但理論數≤1時,改用確切概率法。動物體重和睡眠時間為計量資料,采用方差分析,對非正態或方差不齊的數據進行變量轉換后再統計;若變量轉換后仍未滿足正態或方差齊性,則改用秩和檢驗。統計結果中的動物體重和睡眠時間是各實驗組的平均值,用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 片劑工藝研究

2.1.1 填充劑種類的篩選結果

填充劑考察試驗結果見表2,從處方1～處方3的結果來看,單用一種填充劑,制粒情況和片劑的指標均不理想,但是對比之下,單用微晶纖維素較單用玉米淀粉或麥芽糊精的效果要好。2種填充劑組合使用效果遜于3種填充劑組合使用效果。根據各指標的結果綜合評判,處方10的填充劑種類及用量制得的顆粒均勻適宜,所壓的片劑片面光潔,硬度和崩解時限符合片劑質量要求。

表2 填充劑考察試驗結果

2.1.2 黏合劑種類的篩選結果

黏合劑考察試驗結果見表3,用100 g/L淀粉漿、400 g/L羥丙甲基纖維素水溶液、400 g/L羧甲基纖維素鈉水溶液作為黏合劑時,制粒過程困難,軟材黏性大,過篩粘篩網,且可能由于黏度過大造成片劑崩解時限延長。而使用650 g/L聚維酮K30乙醇溶液作為黏合劑時,黏合效果最好,容易制粒,壓制后片面光潔,片劑硬度和崩解時限均符合片劑質量要求。因此,應選用650 g/L聚維酮K30乙醇溶液作為制備靈芝多糖γ-氨基丁酸片劑的黏合劑。

表3 黏合劑考察試驗結果

2.1.3 崩解劑種類的篩選結果

崩解劑考察試驗結果見表4,用干淀粉、羧甲基淀粉鈉作為崩解劑時,制備所得的片劑外觀不夠光潔,且崩解時限過長。而使用交聯羧甲基纖維素鈉作為崩解劑時,制得的片劑外觀和崩解性能均較好。因此,應選用交聯羧甲基纖維素鈉作為制備靈芝多糖γ-氨基丁酸片劑的崩解劑。

表4 崩解劑考察試驗結果

2.1.4 潤滑劑種類的篩選結果

潤滑劑考察試驗結果見表5,用滑石粉、微粉硅膠和硬脂酸鎂作為潤滑劑時,制備所得的片劑硬度和崩解時限區別不大,主要區別在于片劑的片面光潔程度,滑石粉和微粉硅膠潤滑效果一般,片劑外觀表現為較光潔,而使用硬脂酸鎂潤滑劑制得的片劑外觀完整光潔,說明硬脂酸鎂可有效減小顆粒間及顆粒與模具間摩擦力,能顯示出良好的潤滑效果。因此,應選用硬脂酸鎂作為制備靈芝多糖γ-氨基丁酸片劑的潤滑劑。

表5 潤滑劑考察試驗結果

2.1.5 片劑制備工藝驗證結果與分析

采用最佳工藝條件制備5批靈芝多糖γ-氨基丁酸片,結果見表6。制粒方便,顆粒均勻,過篩容易,所壓片劑片面光潔,包衣后片面均勻光滑,片芯呈棕褐色。各項指標良好,且符合質量標準規定,表明此制備工藝穩定可靠。

表6 五批片劑工藝驗證結果

2.2 靈芝多糖γ-氨基丁酸片改善睡眠功能學實驗

2.2.1 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對小鼠體重的影響

記錄各實驗中小鼠的不同時期的體重,進行增重分析,統計結果如表7所示。各劑量組增重與陰性對照組比較,差異均無統計學意義,表明靈芝多糖γ-氨基丁酸片對小鼠體重無明顯影響。

表7 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對小鼠體重的影響

2.2.2 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對小鼠直接睡眠作用的影響

實驗中觀察發現,各劑量組入睡動物數均為0,與陰性對照組比較差異均無統計學意義(表8),說明靈芝多糖γ-氨基丁酸片對小鼠無明顯的直接睡眠作用。

表8 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對小鼠直接睡眠作用觀察結果

2.2.3 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響

中、高劑量組動物入睡時間縮短、睡眠時間延長,與陰性對照組比較差異有統計學意義(表9),表明靈芝多糖γ-氨基丁酸片延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗結果為陽性。

表9 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響

2.2.4 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響

各劑量組入睡動物數與陰性對照組比較,差異無統計學意義(表10),表明靈芝多糖γ-氨基丁酸片的戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗結果為陰性。

表10 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響

2.2.5 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對巴比妥鈉誘導小鼠睡眠潛伏期的影響

高劑量組動物睡眠潛伏期縮短,與陰性對照組比較差異有統計學意義(表11),表明靈芝多糖γ-氨基丁酸片的巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗結果為陽性。

表11 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對巴比妥鈉誘導小鼠睡眠潛伏期的影響

綜合上述實驗結果,根據《保健食品檢驗與評價技術規范》中的改善睡眠功能評價標準判斷,靈芝多糖γ-氨基丁酸片具有改善睡眠功能作用。

3 討論

片劑是保健食品的常用劑型,不僅服用方便,且適宜于工業化大生產,但在實際開發時,原料本身的特性對于片劑成型性與穩定性具有較大影響。靈芝提取物黏性大,可能影響制劑時的物料均勻性、硬度、崩解時限等。本研究利用多種輔料進行制粒、壓片,獲得功效成分均一的靈芝多糖γ-氨基丁酸片,加上包衣工序則有利于片劑的穩定保存。

將此靈芝多糖γ-氨基丁酸片作為樣品,進行功能學實驗,結果表明其具有改善睡眠的作用。靈芝多糖和GABA是處方中的2種主要功能因子,靈芝多糖可通過調節神經系統影響松果體對褪黑素的分泌,γ-氨基丁酸在非快動眼期引導入睡,并延長深睡眠時間,二者可協同增效,發揮改善睡眠的保健功能。引起睡眠障礙的因素較多,在壓力等不良情緒刺激時,人體下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸異常興奮,容易誘發失眠癥狀。靈芝多糖和GABA在抑制HPA軸時起到的協同作用可能與抑制氯離子通路和清除自由基有關,具體分子機制有待進一步研究。

靈芝是傳統的補益類藥材,安全有效,適宜于開發成滿足現代人需求的健康產品。結合現代營養學研究成果,與新食品原料γ-氨基丁酸復配并制成服用方便的劑型,得到一款幫助亞健康人群改善睡眠障礙的新興產品,可充分發揮二者的健康價值,實現從初級農產品到保健食品的轉變,引發靈芝下游經濟新的增長點,有利于促進靈芝產業鏈的延伸發展,并促進產業轉型升級。