固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒罐裝輔助食品果泥中展青霉素的含量

趙 迪,尹丹陽,袁文婷,張宇晨

(陜西省疾病預防控制中心,西安 710054)

展青霉素(patulin,PAT)又稱棒曲霉素,是一種有毒的真菌次級代謝產物[1]。20世紀40年代展青霉素作為抗生素被發現,主要存在于霉變水果及其制品中。人類膳食中展青霉素的最主要來源是蘋果及其制品[2]。展青霉素是一種極性不飽和內酯類小分子化合物,屬于聚酮類代謝產物,在酸性條件下穩定。在動物研究中,展青霉素可對人體不同器官造成損害,包括腦、腎、肝和胸腺[3-6]。毒理學試驗證明其具有毒性、誘變性、致癌性和致畸性[7],國際癌癥研究中心將其歸為第三類物質[8]。

嬰幼兒罐裝輔助食品果泥主要原料是蘋果汁、梨汁和山楂等,展青霉素污染也是該類產品中值得關注的問題。由于嬰幼兒對毒素污染物的敏感性,歐盟委員會法規(EC)No 1881/2006針對嬰幼兒輔食規定嬰幼兒食用的蘋果汁和固體蘋果產品及嬰幼兒食品(除嬰幼兒食用的谷物加工食品)中展青霉素的限量值為10 μg?kg－1。文獻[9]對2006－2009年陜西產蘋果濃縮汁中展青霉素的污染水平進行調查,發現2007年陜西產蘋果濃縮汁有少量樣品中展青霉素超50μg?kg－1。陜西省市售的嬰幼兒罐裝輔助食品(果泥)可能也存在類似的風險,因此對其展青霉素的污染情況進行監測十分必要。

展青霉素的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[10]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[11]和超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)[12]等。目前關于水果源制品中展青霉素檢測方法較多,而針對嬰幼兒罐裝輔助食品果泥中展青霉素的檢測報道比較少。果泥樣品含有蛋白質、脂肪和碳水化合物等多種物質,基質復雜。不同果泥樣品在液相色譜-質譜上的基質效應也存在差異,影響定量準確度。因此,本工作采用乙酸乙酯提取,MAX 固相萃取柱凈化,采用同位素內標-超高效液相色譜-串聯質譜法測定陜西省市售的以蘋果、山楂和梨為主要原料的33份嬰幼兒罐裝輔助食品果泥中展青霉素的含量,以了解陜西省市售的嬰幼兒罐裝輔助食品果泥中展青霉素的污染情況。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Dionex U3000 型超高效液相色譜儀;5500Qtrap型三重四極桿串聯質譜儀,配電噴霧離子源和流動注射泵;Milli-Q 型超純水制備系統;Waters Oasis MAX 固相萃取柱(150 mg/6 mL);MycoSep 228多功能凈化柱。

展青霉素標準溶液:100.1 mg?L－1。

13C7-展青霉素同位素內標溶液:25.13 mg?L－1。

展青霉素標準儲備溶液:1.00 mg?L－1,取100.1 mg?L－1展青霉素標準溶液0.10 mL,用4%(體積分數,下同)乙酸溶液定容至10 mL,配制成1.00 mg?L－1的展青霉素標準儲備溶液,于4 ℃避光保存。

13C7-展青霉素同位素內標工作溶液:取25.13 mg?L－113C7-展青霉素同位素內標溶液0.40 mL,用4%乙酸溶液定容至10 mL,配制成1.01 mg?L－1的13C7-展青霉素同位素內標工作溶液,于4 ℃避光保存。

展青霉素標準溶液系列:取適量的展青霉素標準儲備溶液和13C7-展青霉素同位素內標工作溶液,用0.2%(體積分數,下同)乙酸溶液配制成質量濃度為10.0,20.0,50.0,80.0,100,150,200μg?L－1的展青霉素標準溶液系列,其中同位素內標質量濃度為50.5μg?L－1。

果膠酶溶液(≥5 units/mg protein);乙酸乙酯、乙酸銨、乙酸均為色譜級;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫40 ℃;流量0.3 mL?min－1;進樣體積10μL;流動相A 為水,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～3.0 min時,B 為5%;3.0～3.1 min時,B 由5%跳轉至95%,保持0.9 min;4.0～4.1 min時,B由95%跳轉至5%,保持2.9 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負離子(ESI－)模式;多反應監測(MRM)掃描方式;電噴霧電壓－4 500 V;氣簾氣壓力206.8 kPa;霧化氣壓力275.8 kPa;輔助氣壓力275.8 kPa;離子源溫度550 ℃;碰撞室入口電壓(EP)、碰撞室出口電壓(CXP)、碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)見表1,其中“?”代表定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取1 g樣品(精確至0.001 g)于50 mL 離心管中,加入50μL13C7-展青霉素同位素內標工作溶液,靜置片刻后,再加入20 mL水與200μL果膠酶溶液,混勻,于55 ℃酶解2 h 后取出,以轉速5 000 r?min－1離心5 min。收集上清液于50 mL離心管中,加入乙酸乙酯10 mL,蓋緊蓋子,渦旋混合10 min,以轉速5 000 r?min－1離心5 min,吸取上層乙酸乙酯相,轉移到另一50 mL離心管中。重復提取一次,合并乙酸乙酯相,于40℃氮吹至近干,加入4%乙酸溶液5 mL 溶解殘渣,待凈化。MAX固相萃取柱預先用3 mL 甲醇、3 mL 水活化,將上述溶液全部過柱,自然滴下。上樣完畢后,依次加入3 mL的5 mmol?L－1乙酸銨溶液、3 mL 水淋洗。抽干MAX 固相萃取柱,用4 mL 甲醇洗脫,收集洗脫液。在洗脫液中加入20μL乙酸,于40℃氮氣緩緩吹至近干,用0.2%乙酸溶液定容至1.0 mL,渦旋30 s溶解殘留物,經0.22μm 濾膜過濾,按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

MRM 模式下標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard solution

2.2 色譜柱的選擇

展青霉素為強極性化合物,同時相對分子質量較低,因此試驗比較了Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.8μm)和Waters BEH Hilic(100 mm×2.1 mm,1.7μm)等兩種色譜柱對目標物的分離效果。結果發現,采用Waters BEH C18色譜柱時,展青霉素的出峰時間相對較晚,能較好地與雜質分離,峰形較好,質譜響應值高。因此,試驗選擇Waters BEH C18色譜柱作為展青霉素的分離柱。

2.3 質譜條件的選擇

展青霉素具有較強的電負性,因此試驗選擇ESI－模式。采用針泵模式進樣,對質量濃度為100μg?L－1的展青霉素和13C7-展青霉素標準溶液進行一級質譜掃描,確定母離子分別為m/z153.0和160.0。然后對母離子進行二級質譜掃描,展青霉素選擇豐度次高,背景干擾較小的m/z81.0為定量離子,m/z109.0為定性離子,13C7-展青霉素選擇豐度高,背景干擾較小的m/z115.0 為定量離子,m/z86.0 為定性離子。具體的質譜條件見1.2.2節。

2.4 固相萃取柱的選擇

果泥樣品基質復雜,需要去除提取液中各種雜質的干擾。試驗比較了Waters Oasis MAX 固相萃取柱和MycoSep 228 多功能凈化柱的凈化效果。Waters Oasis MAX 固相萃取柱是反相和強陰離子交換復合模式聚合物吸附柱;MycoSep 228多功能凈化柱是以極性、非極性及離子交換等基團組成填充劑,可選擇性吸附樣液中的脂類、蛋白質類等雜質。展青霉素基質加標溶液經酶解,乙酸乙酯提取后,分別經過Waters Oasis MAX 固相萃取柱和MycoSep 228多功能凈化柱凈化。結果顯示,展青霉素在兩種固相萃取柱上的加標回收率均達到95.0%以上,而Waters Oasis MAX 固相萃取柱價格相對便宜,且操作流程簡便,因此試驗選擇Waters Oasis MAX 固相萃取柱進行凈化。

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

試驗采用同位素內標法定量降低和消除基質效應對展青霉素測定結果的影響。按照儀器工作條件測定展青霉素標準溶液系列,以展青霉素的質量濃度為橫坐標,展青霉素和同位素內標峰面積比值為縱坐標,繪制標準曲線。結果顯示,展青霉素標準曲線的線性范圍為10.0～200μg?L－1,所得線性回歸方程為y＝5.600×10－3x－4.360×10－4,相關系數為0.999 7。

以3倍和10倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果顯示,展青霉素的檢出限為2μg?kg－1,測定下限為6μg?kg－1。

2.6 精密度和回收試驗

對陰性果泥樣品進行10 μg?kg－1(低)、20μg?kg－1(中)和50μg?kg－1(高)等3 個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2 可知,果泥中展青霉素的回收率為101%～112%,測定值的RSD 為2.2%～3.5%,說明方法具有較高的準確度和精密度。

2.7 樣品分析

從陜西省10個地市的商店和網店共采集33份嬰幼兒罐裝輔助食品果泥樣品,按本工作建立的超高效液相色譜-串聯質譜法進行檢測,均未檢出展青霉素,表明目前市面上的嬰幼兒罐裝輔助食品果泥質量狀況良好。MRM 模式下實際樣品及加標樣品的色譜圖如圖2所示。

本工作通過優化色譜柱和樣品前處理條件,提出了超高效液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒罐裝輔助食品果泥中展青霉素含量的方法,同位素內標定量,消除和降低了基質效應對檢測結果的影響。該方法簡單、準確、靈敏,能滿足歐盟對嬰幼兒及兒童食品(非加工谷物制品)中展青霉素殘留的檢測要求。