代謝工程改造釀酒酵母合成β-胡蘿卜素

周頌,李由然,張梁,丁重陽,顧正華,石貴陽,徐沙*

1(江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

β-胡蘿卜素屬于類胡蘿卜素家族,存在于植物、水果和微生物中[1],它可以作為維生素原、功能性化妝品、食品著色劑和飼料補充劑,因此被廣泛應用于制藥、保健品、化妝品和食品工業等領域,是一類具有重要生物功能和商業價值的色素[2-3]。另外,β-胡蘿卜素還是一種最常見的維生素A補充劑,維生素A對于人體視覺發育至關重要,如果身體缺少維生素A,視力就會出現問題,甚至會導致夜盲癥[4]。盡管90%的商業化β-胡蘿卜素是通過化學合成方法得到的[5],但考慮到化學品的安全合成問題,以及消費者對天然添加劑、微生物的偏好,利用微生物異源表達合成β-胡蘿卜素受到越來越多的關注[6]。

由于遺傳背景清楚、基因操作工具豐富、營養需求簡單、對高糖低pH等耐受性強、安全性高等特點,釀酒酵母不僅是生物化學和分子生物學等研究的首選模式真核微生物,也是傳統發酵食品生產和現代生物技術領域的重要工業微生物[7-9]。通過對釀酒酵母的系統改造,已經實現多種以乙酰輔酶A作為主要前體高效合成重要化合物,如中長鏈脂肪酸、長鏈醇、萜類、黃酮等[10-11]。在釀酒酵母中構建的β-胡蘿卜素的合成途徑可以分為兩部分,上游甲羥戊酸途徑合成前體香葉基香葉基焦磷酸,以及下游β-胡蘿卜素的合成。類胡蘿卜素合成途徑非常復雜需要多種酶的協同作用,包括合成酶、脫氫酶、環化酶、羥化酶和酮化酶等。此外,大多數類胡蘿卜素在胞內大量積累后,因其疏水性會損傷細胞膜結構并危害細胞的正常生理功能[12]。而脂質體的積累可以緩解其產物毒性,但由于微生物底盤細胞中有限的膜結構在一定程度上限制了類胡蘿卜素產量提升空間。

本研究室前期研究發現,以釀酒酵母YPH499為底盤細胞,過量表達關鍵基因dga1、pah1以及與脂滴形成關聯緊密的ldp1基因,得到一株脂質體含量提高的菌株LFD18,番茄紅素單位產量為109.3 mg/g CDW。本研究以LFD18為出發菌株,在實驗中偶然得到一株β-胡蘿卜素產量提高的突變株,通過轉錄組分析發現hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2等基因轉錄水平提高。進一步研究改造后得到工程菌ZS20,其β-胡蘿卜素產量提高到194.3 mg/L。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌株和所用引物

研究過程中所用的菌株及質粒如表1所示,所用引物如表2所示,實驗所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 本實驗使用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本實驗使用的引物Table 2 Primers used in this study

續表2

1.2 培養基

大腸桿菌培養基LB (g/L):蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10、固體培養基添加瓊脂粉18,121 ℃、20 min滅菌。酵母培養基YPD (g/L):蛋白胨20、酵母粉10、葡萄糖20、若需固體培養基添加瓊脂粉18,115 ℃、20 min滅菌。篩選培養基(g/L):蛋白胨20、酵母粉10、葡萄糖20、5-FOA 1,115 ℃、20 min滅菌。氨基酸補足液(μg/mL):亮氨酸100、賴氨酸100、色氨酸80、尿嘧啶30、組氨酸30,超凈臺過濾除菌。

1.3 實驗材料

Phanta?Max Super-Fidelity DNA polymerase、HiScript?Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR、質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司;Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox),羿圣生物科技上海有限公司;Fast Digested TM快速限制性內切酶,美國Thermo公司;T4 DNA連接酶、pY26質粒,大連TaKaRa公司;氨芐青霉素、諾爾斯菌素、潮霉素, Sigma-Aldrich公司;Simply P 總RNA提取試劑盒,杭州博日科技股份有限公司;蛋白胨、酵母粉,索萊寶科技有限公司。

1.4 重組菌發酵實驗

將平板活化得到的單克隆工程菌株挑取單菌落接種于裝有50 mL YPD液體培養基的250 mL錐形瓶中,30 ℃、200 r/min振蕩培養至對數生長中期(30 h左右)得到種子液,然后以體積分數3%轉接于含50 mL YPD液體培養基的250 mL錐形瓶中,30 ℃、200 r/min培養,每隔12 h取樣測定。

1.5 β-胡蘿卜素的提取和產量測定

對發酵過程中提取的發酵液樣品進行快速提取,具體方法如下所述:先配制β-胡蘿卜素標樣梯度制作標曲,之后分別各取兩等份1 mL發酵液,離心收集菌體,無菌水清洗后,其中一份菌體80 ℃烘干至恒重,稱重計算菌體干重;另一份用于產物提取。向待提取β-胡蘿卜素的離心管中加入等體積的玻璃珠(0.5 mm)和1 mL氯仿,振蕩破碎5 min,冰浴1 min,10 000 r/min離心1 min,取上清液直到樣品無色,合并上清液;用N2吹干至色素析出,1 mL丙酮復溶后用酶標儀測定,計算產物濃度。

1.6 RT-qPCR測定目的基因相對表達量

首先,采用Simply P總RNA提取試劑盒提取總RNA;然后,將提取好的RNA反轉錄成cDNA,經微量紫外分光光度計定量,使濃度約在200 ng/μL左右,以cDNA為模板,以act1為內參基因。之后采用SYBR Green Master Mix在熒光定量PCR儀檢測系統CFX96上進行qPCR。其中退火溫度為60 ℃,條件如下:循環1次(95 ℃,5 min),循環40次(95 ℃,10 s;60 ℃,30 s),結束時采集數據。采用2-ΔΔCq法計算目的基因的相對表達量[13]。

1.7 β-胡蘿卜素定性檢測

將待測菌株平板劃線活化平后板單菌落接種到裝有100 mL YPD液體培養基的500 mL錐形瓶中,30 ℃、200 r/min 搖瓶培養,培養4 d后收集菌體,用無菌水洗滌兩次收集菌體后以三氯甲烷為溶劑提取色素,N2吹干為粉末狀,送往無錫瑞峰檢測技術有限公司檢測。

1.8 發酵罐發酵

工程菌在YPD板上劃線活化獲得單個菌落,將該單菌落置于含有100 mL YPD的500 mL搖瓶中,220 r/min,30 ℃,培養16～18 h。將2.5 L的YPD培養基置于5 L發酵罐中,0.5 mol/L硫酸和5 mol/L氨水的自動加入使pH值恒定在6.5,氣流為2 vvm,發酵溫度為30 ℃,轉速500 r/min。

2 結果與分析

2.1 β-胡蘿卜素生產菌株的構建

在釀酒酵母中利用誘導型GAL啟動子表達外源類胡蘿卜素合成酶效果更好[14]。本文利用含有GAL啟動子的質粒Ts-BY(GAL1prGAL10pr)和Ts-BR(GAL1prGAL10pr)通過SmaⅠ和Hind Ⅲ 酶切線性化,如圖1-a所示,醋酸鋰轉化法轉入實驗室已有的釀酒酵母LFD18得到工程菌ZS19,涂布YPD平板發現平板上出現兩種顏色菌落,一種顏色偏紅命名為ZS19 reddish,一種橘紅色較淺命名為ZS19,如圖1-b所示。經核磁共振定性檢測兩株菌落產物都是β-胡蘿卜素。將ZS19 reddish和ZS19分別挑取到裝有50 mL YPD培養基的250 mL錐形瓶中發酵96 h,結果偏紅菌株ZS19 reddish在84 h產量更高為160.4 mg/L,如圖1-c所示。

a-質粒TS-BY(GAL1prGAL10pr)和TS-BR(GAL1prGAL10pr)通過Sma Ⅰ和Hind Ⅲ酶切電泳圖; b-ZS19 reddish和ZS19發酵84 h對比圖;c-ZS19 reddish和ZS19發酵產物產量圖1 構建轉化片段的驗證,ZS19 reddish和ZS19發酵84 h對比及發酵產量對比圖Fig.1 Build validation of the transformation fragment, Comparison of ZS19 reddish and ZS19 fermentation at 84 h and production concentration

2.2 轉錄組結果分析

為了進一步研究菌株ZS19 reddish和ZS19表現型差異的原因,分別挑取單菌落到裝有50 mL YPD培養基的250 mL錐形瓶中,搖瓶培養72 h后收集5 mL菌體送樣進行轉錄組測定。結果表明,ZS19 reddish對比ZS19共有84個基因發生下調,12個基因上調,如圖2-a所示。對上述差異基因進行GO功能富集分析,結果如圖3所示。轉錄水平變化的基因主要與各種生物過程有關,如:生物調控(biological process)、細胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)等。此外,與大分子復合體(macromolecular complex)、膜組分(membrane part)、催化活性(catalytic activity)等也密切相關。

根據上述結果,選取與葡萄糖代謝、能量代謝和脂質代謝有關的hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2等6個基因,進行定量PCR驗證。結果表明,上述基因均發生顯著上調,特別是hxk1上調125.2倍,hmg2上調31.3倍,結果如表3所示。

a-ZS19 reddish和ZS19顯著性差異比較圖;b-ZS19 reddish和ZS19差異情況火山圖圖2 ZS19 reddish和ZS19顯著性差異比較圖和差異情況火山圖Fig.2 Comparison of ZS19 reddish and ZS19 significant differences and volcanic map

圖3 ZS19 reddish和ZS19比較基因分類圖Fig.3 Comparison of ZS19 reddish and ZS19 gene ontology classification

表3 qPCR驗證轉錄結果Table 3 qPCR verify transcription results

2.3 β-胡蘿卜素生產菌的改造

將hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2基因分別過量表達,結果表明相比突變株ZS19 reddish β-胡蘿卜素產量有所下降,但菌株ZS19-DPP1、ZS19-LPP1、ZS19-HXK1、ZS19-FDH1細胞干重有明顯提高。并且上述4株菌生產性狀相比ZS19 reddish更為穩定,平板傳代5次后,菌落仍然全部一致呈現橙紅色,而ZS19 reddish傳代5次后出現大量白色菌落。根據圖4的結果,hxk1、dpp1、lpp1和fdh1基因的發酵產量相對較高,而且細胞干重也有所提高,因此將這4個基因進行聯合過表達得到的新菌株命名為ZS20。搖瓶發酵結果表明β-胡蘿卜素的產量在84 h達到194.3 mg/L,此時ZS19 reddish產量為154.7 mg/L,提高約26%;相比出發菌株ZS19提高約110%。后續可以嘗試將hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2基因進行聯合過表達得到新的改造菌株,或者可以進一步提高重組菌β-胡蘿卜素的產量。

a-各過表達菌株發酵產量;b-各過表達菌株發酵細胞干重圖4 過表達基因轉化菌株搖瓶發酵產量及干重Fig.4 Strain fermentation concentration and dry cell weight

2.4 發酵罐發酵培養

使用上海迪必爾公司的5 L發酵罐,對重組菌ZS20進行發酵。發酵條件為:溫度30 ℃,轉速500 r/min,pH 6.5。2.5 L培養基高壓滅菌后降溫至30 ℃加入種子液,發酵總時長為96 h,發酵28 h時溶氧降至最低,此時開始以F1(0)為0.006進行指數流加500 g/L葡萄糖至48 h(發酵罐體積因素),β-胡蘿卜素在84 h達到最高為259.8 mg/L,細胞干重在84 h為7.9 mg,單位產量為32.9 mg/g CDW。

對ZS20菌株進行補加氨基酸發酵優化,本研究以釀酒酵母YthmgⅠ菌株作為出發菌株構建代謝改造重組菌,Ythmg1菌株中組氨酸、賴氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶被改造破壞,因此對ZS20菌株補加氨基酸培養。2.5 L培養基高壓滅菌后降溫至30 ℃,加入種子液并添加氨基酸補足液,發酵24.5 h時溶氧降至最低,此時以F1(0)為0.006進行指數流加500 g/L葡萄糖到48 h,繼續發酵培養至96 h,發酵圖片如圖5-a所示;每12 h取樣后處理樣品提取β-胡蘿卜素后測產量在84 h達到最高為314.3 mg/L,相比優化之前產量提高約21%,單位產量為38.8 mg/g CDW,結果如圖5-b所示;對胞外代謝產物進行液相測定,葡萄糖和乙醇、乙酸、甘油等發酵副產物含量如圖5-c所示。

a-ZS20菌株發酵96 h發酵圖;b-ZS20菌株發酵產量及干重;c-ZS20菌株發酵液中葡萄糖、乙醇、乙酸和甘油質量濃度圖5 葡萄糖指數流加發酵ZS20菌株的β-胡蘿卜素產物、干重及副產物測定Fig.5 Determination of dry weight and byproducts of β-carotene in ZS20 strain fermentation by glucose exponential flow

3 結論與討論

釀酒酵母是生產類胡蘿卜素的常用底盤微生物之一,研究重點主要集中在代謝中心節點乙酰CoA的合成、前體甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑的優化以及下游異源途徑的優化等,但類胡蘿卜素作為一種外源產物其代謝調控方式仍有待進一步研究。本研究通過同時過量表達hxk1、dpp1、lpp1和fdh1使β-胡蘿卜素產量提高26%。本論文過量表達的己糖激酶1(hxk1),可以磷酸化葡萄糖、果糖和甘露糖,在微生物利用葡萄糖生長方面是不可缺少的,調控糖代謝在細胞生長過程中起著重要作用[15]。甲基乙二醛還原酶由gre2(yol151w)編碼[16]。hmg2編碼酵母中羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的兩個同工酶之一,HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA轉化為甲戊酸[17],與MVA途徑緊密相關,這種酶的抑制會導致甲羥戊酸下游所有產物的合成減少,包括膽固醇[18]。dpp1(二?；视徒沽姿崃姿崦?基因編碼DGPP磷酸酶,在釀酒酵母中轉化含有dpp1基因的多拷貝質粒使DGPP磷酸酶活性提高10倍,DGPP磷酸酶是釀酒酵母中的一種膜相關的34-kDa酶,它催化DGPP去磷酸化生成磷酸酯(phosphate ester,PA),再催化PA去磷酸化生成二?；视蚚19]。lpp1編碼的脂質磷酸酶產物是一種膜相關酶,可催化Mg2+PA、二?；视徒沽姿?diazanium,[[(2R)-2,3-di(octanoyloxy)propoxy]-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate,DGPP)和溶血磷酸酯(lysophosphatidic acids,LPA)的獨立去磷酸化[12],與脂質載體的合成有關。以上基因或與底物代謝有關,或與MVA途徑和脂質載體的合成緊密相關,因此對β-胡蘿卜素合成具有重要影響。

值得一提的是雖然分別過量表達hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2后β-胡蘿卜素產量反而下降,但其菌體量相比ZS19有顯著提高。對hxk1、dpp1、lpp1和fdh1進行同時過量表達β-胡蘿卜素產量顯著提高,有可能與dpp1、lpp1的過量表達增加了細胞脂質體含量,可以降低產物毒性,提高了細胞干重有關。酵母代謝調控系統龐大復雜,長期以來大量的代謝途徑調控依賴過量表達和基因敲除,難以實現代謝網絡的精準調控[20],后續可以利用啟動子調控、反義RNA調控和基于CRISPR-Cas9的代謝途徑精準調控等策略,精準調控hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2等基因的表達,并進一步優化培養基和培養方法等使β-胡蘿卜素產量繼續提高。接下來可以把hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2同時過表達,或許都可以使β-胡蘿卜素產量繼續提高,之后進行發酵培養基優化,分批補料優化等策略;同時可以通過進一步PATHWAY分析,研究與產物合成相關的代謝途徑及其調控,進一步提高重組菌β-胡蘿卜素的產量。