己二酸生物合成的途徑改造以及發酵條件優化

支睿,李國輝*,毛銀,鄧禹*

1(江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

近些年來,隨著碳中和概念的提出和環境保護意識的逐漸增強,通過全生物法合成工業化學品原料得到了廣泛的關注。伴隨著近年來代謝工程和合成生物學的不斷發展,利用如大腸桿菌(Escherichiacoli)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)等模式微生物合成二元羧酸的研究取得了一定的進展[1-3]。己二酸是一種中長鏈二元羧酸,可應用于尼龍材料、食品添加劑以及生物可降解塑料等多種工業制品中[4-5]。

生物法生產己二酸主要有3種路徑:逆/順β-氧化途徑結合ω-氧化途徑、逆己二酸降解途徑以及α-酮庚二酸途徑。在逆/順β-氧化途徑結合ω-氧化途徑中,CLOMBURG等[6]通過在大腸桿菌中過表達硫解酶、3-羥基乙酰輔酶A脫氫酶/脫水酶、反式烯酰輔酶A還原酶、ω-羧化酶、醇脫氫酶以及醛脫氫酶編碼基因構建該途徑,通過敲除與己二酸合成途徑競爭碳流的部分基因,合成了170 mg/L己二酸。DENG等[7]發現一株嗜熱放線菌(Thermobifidafusca) B6可以通過逆己二酸降解途徑天然產己二酸,該途徑包括β-酮硫解酶、3-羥?；o酶A脫氫酶、3-羥基己二酰輔酶A脫氫酶、5-羧基-2-戊烯酰輔酶A還原酶以及己二酰輔酶A合成酶[2],在大腸桿菌中異源表達上述6個酶后,更換啟動子提高限速酶5-羰基-2-戊烯酰輔酶A還原酶的表達量,敲除ldhA、atoB和sucD基因減少乳酸以及乙酸積累,增加丁二酰輔酶A積累,使己二酸產量達到1.8 g/L。α-酮庚二酸途徑包括高檸檬酸合成酶、高檸檬酸脫水酶、順高烏頭酸脫水酶、蘇式異高檸檬酸脫氫酶、α-酮庚二酸脫羧酶以及轉氨酶,TURK等[8]以此構建了一條6-氨基己酸的合成路線,然而副產物己二酸的產量(0.32 g/L)遠遠高于目標產物6-氨基己酸(0.02 g/L),推測是大腸桿菌中內源的半醛脫氫酶催化己二酸半醛生成了己二酸?？偟膩砜?逆己二酸降解途徑是一種有效的己二酸合成代謝途徑[9],但存在反應途徑較長、外源基因表達不平衡等問題,導致難以對其進行改造調控。

在微生物中過表達外源基因往往會對菌體生長產生代謝負擔[10],在模式微生物中代謝途徑基因大多利用T7啟動子進行表達,而該啟動子的轉錄以及翻譯強度較強,對菌體造成的代謝負擔較大從而導致目標產物產量無法提高[11],LIU等[12]在3-羥基丙酸代謝途徑中利用T7啟動子分別表達一種丙二酰輔酶A還原酶的兩個表達模塊,3-羥基丙酸產量僅達到0.15 g/L。后續通過平衡兩個模塊的表達水平,3-羥基丙酸的產量達到3.72 g/L,較之前有了顯著提升。XU等[13]通過更換啟動子調節紫色桿菌素代謝途徑基因的表達水平,使該產物的產量較對照提升了3.2倍。同樣,LIU等[14]通過更換啟動子強度確定了玉米黃質合成途徑中SgcE10與SgcE表達水平的最優比例,高于或低于該比例都會導致玉米黃質產量顯著下降。此外,還可以通過更換、優化復制子、質粒結構等[15-17]方法對代謝途徑基因的表達水平進行優化。

為協調逆己二酸降解途徑基因表達,本研究將實驗室前期構建的逆己二酸降解途徑分為4個模塊,選取不同強度的啟動子構建相應質粒并進行組合,利用構建的己二酸生物傳感器開展高通量篩選驗證,最終最優組合產量達到120.60 mg/L。在此基礎上,開展發酵條件優化,己二酸產量達到240.49 mg/L,較對照提升了16.65倍。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、DH5α為構建質粒的宿主菌株;大腸桿菌K12 MG1655為己二酸傳感器宿主菌株以及擴增paaJ、paaH、paaF基因的菌株;大腸桿菌K12 MG1655 ΔatoBΔsucDΔpflBΔadhEΔarcAΔldhAΔpoxBΔpta為表達逆己二酸降解途徑的宿主菌株。

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L):NaCl 10,胰蛋白胨10,酵母粉5;

TB培養基(g/L):K2HPO4·3H2O 16.34,KH2PO42.31,胰蛋白胨 12,酵母粉 24;

Modified TB培養基(g/L):K2HPO4·3H2O 8.17,KH2PO42.31,胰蛋白胨12,酵母粉 24,NH4Cl 10.70,CuSO4·5H2O 2.5×10-6。

1.1.3 試劑

酵母提取物、胰蛋白胨,英國Oxoid公司;抗生素(卡那霉素以及鏈霉素),生工生物工程(上海)股份有限公司;其余所有試劑購自中國醫藥集團有限公司或北京伊諾凱科技有限公司。

1.1.4 儀器與設備

ETC811 PCR儀,德國Eppendorf公司;SYNERGY H1多功能酶標儀,美國Bio-Tek有限公司;ST 16R冷凍離心機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;1260 Infinity II高效液相色譜,美國安捷倫有限公司;Waters Acquity UPLC超高效液相色譜、BEH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm, 1.7 μm)、MALDI SYNAPT Q-TOF MS質譜,美國沃特世公司;HPX-87H色譜柱,美國伯樂公司;UV-1800紫外可見分光光度計,翱藝儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒構建

諾唯贊2×Rapid taq Master Mix以及2×Phanta Flash Mix (Dye Plus)被分別用于菌落PCR和基因/啟動子擴增。密碼子優化后的acot8、cat1、ter、benM基因由蘇州金唯智科技有限公司合成。paaJ、paaH以及paaF基因由大腸桿菌K12 MG1655(實驗室保藏)擴增而來。組成型啟動子PrpsU以及Pmdh源自ZHOU等[18]構建的組成型啟動子庫。組成型啟動子PPL818、PPL3230、PPL2536、PPL106、PPL729、PPL1937、PPL3206以及PPL2787源自ZHAO等[19]等構建的組成型啟動子庫?？蛰d質粒pCDFDuet-1以及pRSFDuet-1被作為載體表達逆己二酸降解途徑基因。

質粒pCDF-PPL729-cat1-paaF-PPL3206-ter的構建過程如下:首先,以pCDF- Pmdh-cat1-paaF-PrpsU-ter為模板,在需要更換啟動子的位點(Pmdh)設計響應引物進行PCR擴增并回收片段。其次,以組成型啟動子PPL729片段為載體,回收片段為插入片段進行同源重組構建pCDF- PPL729-cat1-paaF-PrpsU-ter質粒。隨后,以pCDF- PPL729-cat1-paaF-PrpsU-ter,在需要更換啟動子的位點(PrpsU)設計響應引物進行PCR擴增并回收片段,再以組成型啟動子PPL3206片段為載體,回收片段為插入片段進行同源重組構建pCDF-PPL729-cat1-paaF-PPL3206-ter質粒。其余質粒均按以上方法進行構建。

1.2.2 搖瓶及孔板發酵方法

搖瓶發酵:將保存在-80 ℃的菌液或平板上的單菌落接種于含有10 mL LB培養基的50 mL 三角瓶中,37 ℃, 250 r/min培養12～16 h后,以2%接種量轉接至含有50 mL新鮮培養基的250 mL三角瓶中,開始發酵,培養條件為37 ℃, 200 r/min。

孔板發酵:將平板上的單菌落接種至48孔板中,37 ℃, 250 r/min培養12～16 h后,以2%接種量轉接至24孔板中進行發酵,培養條件為37 ℃, 250 r/min。

1.2.3 高通量篩選

初篩:從平板上挑選的單菌落在24孔板發酵48 h后,將發酵液于12 000 r/min離心10 min,取上清液500 μL以1∶1的配比加入培養至對數生長期(OD600=0.6～0.8)的己二酸傳感器發酵液中,30 ℃, 250 r/min培養4 h后測定熒光。將熒光值高的菌種保藏于-80 ℃冰箱中。

復篩:將熒光值高的菌種接種于含有10 mL LB培養基的50 mL 三角瓶中,37 ℃, 250 r/min培養12～16 h后,以2%接種量轉接至含有50 mL新鮮培養基的250 mL三角瓶中,37 ℃, 200 r/min培養72 h,將發酵液處理后利用高效液相色譜測定己二酸產量以進一步篩選己二酸高產菌株。

1.3 分析方法

菌體OD600值由紫外可見分光光度計測定。

發酵樣品首先于12 000 r/min離心10 min,取500 μL上清液用10 mmol/L稀硫酸稀釋后,再于12 000 r/min離心10 min。隨后,用0.2 μm水系濾膜過濾。己二酸產量由高效液相色譜測定,檢測器為紫外檢測器(210 nm),流動相為5 mmol/L稀硫酸,流速為0.6 mL/min,測定溫度為35 ℃,進樣量為20 μL。

為對己二酸進行定性定量分析,本研究采用LC-MS進行檢測。液相部分,檢測器為光二級體檢測器(210 nm),溫度為45 ℃,流速為0.3 mL/min,進樣量為5 μL。流動相為0.1%(體積分數)甲酸以及純乙腈。梯度洗脫程序:在0～7.3 min,流動相配比為100% 0.1%甲酸;在7.3～8.2 min,流動相配比為70% 0.1%甲酸以及30%純乙腈;在8.2～9.1 min,流動相配比為20% 0.1%甲酸以及80%純乙腈;在9.1～10 min,流動相配比為100% 0.1%甲酸。質譜部分由Waters MALDI SYNAPT Q-TOF MS檢測器檢測[20]。

2 結果與分析

2.1 逆己二酸降解途徑的構建、驗證與優化

以實驗室保藏的八敲大腸桿菌K12 MG1655 (ΔatoBΔsucDΔpflBΔadhEΔarcAΔldhAΔpoxBΔpta)為底盤宿主,選擇源自大腸桿菌K12 MG1655的β-酮硫解酶、3-羥?；o酶A脫氫酶以及3-羥基己二酰輔酶A脫氫酶基因(paaJ、paaH、paaF)[21]、源自齒垢密螺旋體(Treponemadenticola)的5-羧基-2-戊烯酰輔酶A還原酶基因(ter)[22]以及源自小鼠(Musmusculus)的己二酰輔酶A合成酶基因(acot8)[23]構建逆己二酸降解途徑。另外,選擇源自克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)的輔酶A轉移酶基因(cat1)[24]合成丁二酰輔酶A以提高途徑前體供應量。通過吉布森組裝,首先構建質粒pRSF-Pmdh-paaJ-paaH以及pCDF-Pmdh-cat1-paaF,最后構建質粒pRSF-Pmdh-paaJ-paaH-PrpsU-acot8(pAD2)以及pCDF-Pmdh-cat1-paaF-PrpsU-ter(pAD4)。將質粒轉入八敲大腸桿菌中得到Δ8-pAD24并進行搖瓶發酵(圖1)。如圖1-b所示,72 h發酵樣品的LC-MS結果與己二酸標樣一致,產量達到14.44 mg/L。

為調控途徑基因在底盤細胞中的表達水平,本研究首先將途徑基因模塊化,進而更換各模塊啟動子以優化逆己二酸降解途徑,從而平衡途徑基因在宿主中的表達水平。首先,將逆己二酸降解途徑分為4個模塊(圖2-a);其次,從ZHAO等[19]構建的組成型啟動子庫選取8個組成型啟動子,其中每個模塊分別用高低兩種表達水平的啟動子啟動,以此構建相應質粒(圖2-b)。構建完成后采用全因子法[25]對質粒進行組合(圖2-a),因該啟動子庫中啟動子序列同源性較強,在構建過程中易發生同源重組導致構建失敗[26],最終成功構建除pRSF-PPL818-paaJ-paaH-PPL106-acot8以外的7種質粒,得到12種組合以進行下一步的研究。

2.2 結合己二酸生物傳感器篩選最優組合

為避免因基因異質性導致己二酸產量降低從而干擾實驗結果,使用實驗室構建的高通量方法對每種組合開展驗證。該高通量篩選方法分為3步:轉化、初篩和復篩。首先,從平板上挑出轉化子,菌落PCR驗證正確后進行24孔板發酵,以己二酸生物傳感器篩選熒光值較高的菌株,再轉入搖瓶中發酵以進行復篩,以高效液相色譜驗證己二酸產量。初篩過程中使用生物傳感器為轉錄因子型傳感器(抑制型),以BenM (TISNO-120)[27]為轉錄因子,由PPL1986啟動子控制。其工作原理與乳糖操縱子類似,當BenM未與己二酸結合時,其與BenO的結合方式會組織對RNA聚合酶的轉錄,而當BenM與己二酸結合時,該轉錄因子的構象會發生改變,RNA聚合酶從而能夠結合在BenO上,以激活下游綠色熒光蛋白表達。

將每種組合的轉化子各挑24個在孔板中進行發酵后測定熒光,結果如圖3-a所示,熒光值最高的為高表達模塊1(paaJ,paaH)和模塊2 (acot8)與低表達模塊3 (cat1,paaF)和模塊4(ter)的組合。搖瓶復篩驗證各組合的結果如圖3-b所示,各組合復篩的產量與初篩得到的結果能夠相互印證,高表達模塊1和2,低表達模塊3和模塊4的組合己二酸產量最高,達到120.60 mg/L,產量相較于Δ8-pAD24提高8.35倍。其次,可以發現過表達模塊1的組合己二酸產量較高,由此可以確定逆己二酸降解途徑的關鍵酶為β-酮硫解酶以及3-羥基酰輔酶A脫氫酶。最后,高表達4種基因的組合己二酸產量最低,僅達到52.39 mg/L,從該結果可以看出,在構建代謝途徑過程中,全部高表達途徑基因不是最優選擇,平衡各途徑基因的表達水平能顯著提高目標產物產量。以最優組合為基礎,本研究繼續開展發酵條件優化實驗。

都

2.3 發酵優化提高己二酸產量

2.3.1 接種量

接種量不同會在不同程度影響菌體的生長條件和產物合成水平[28],同時己二酸生物合成為生長偶聯型,需要菌體達到較好生長狀況才能更有效的合成己二酸,因此本研究以2%接種量為對照,選擇4種不同接種量作為實驗組,優化接種量以提高己二酸產量。結果如圖4所示,從圖4-b可以看出,在接種量為4%時,己二酸產量最高,達到而在該接種量下,菌體的生長情況在各組中也為最優。同時,當接種量大于4%后,己二酸產量是隨著接種量增加而減少的,由此可見過高的接種量對于產物合成有負面影響。綜上,選擇4%接種量進行下一步的研究。

2.3.2 銨鹽

無機氮源是大腸桿菌偏好吸收的氮源[29],為優化培養基成分改善菌體生長狀況,進一步提高己二酸產量,在TB培養基有機氮源(酵母粉以及胰蛋白胨)的基礎上,選擇不同濃度的NH4Cl作為無機氮源,對產己二酸培養基成分進行優化。從圖5-b可以看出,隨著NH4+濃度的增加,己二酸產量明顯減少,但添加了20 mmol/L NH4Cl后己二酸產量(157.74 mg/L)較對照組(120.59 mg/L)有明顯提升,因此選擇20 mmol/L NH4Cl作為無機氮源進行后續的實驗。

a-逆己二酸降解途徑的模塊化與不同質粒的組合方法; b-各模塊對應的組成型啟動子強度圖2 逆己二酸降解途徑模塊化優化Fig.2 The modularization optimization of the reverse adipate degradation pathway 注:熒光強度由sfGFP/OD600值表征(下同)。

a-初篩結果;b-復篩結果圖3 不同組合的高通量篩選結果Fig.3 The screening results of the high-throughput screening method of different combinations

a-菌體生長情況;b-己二酸產量圖4 接種量對己二酸合成的影響Fig.4 Effects of inoculation on the biosynthesis of adipic acid

a-菌體生長情況;b-己二酸產量圖5 銨鹽對己二酸合成的影響Fig.5 Effects of ammonium on the biosynthesis of adipic acid

2.3.3 磷酸氫鹽

磷酸氫鹽是一類緩沖物質,有助于在發酵過程中維持發酵環境的pH值,促進菌體的基礎代謝。因此,優化了TB培養基中磷酸氫鹽的用量,以7 mmol/L磷酸氫鹽為對照組,選擇不同濃度的磷酸氫鹽添加進培養基。結果如圖6所示,隨著磷酸氫鹽濃度的逐漸添加,己二酸的產量逐漸下降,當磷酸氫鹽濃度為3.5 mmol/L時,己二酸產量達到178.09 mg/L,因此選擇該濃度繼續進行實驗。

a-菌體生長情況;b-己二酸產量圖6 磷酸氫鹽對己二酸合成的影響Fig.6 Effects of hydrogen phosphate on the biosynthesis of adipic acid

2.3.4 金屬離子

金屬離子如Mn2+、Zn2+、Ca2+等是酶常見的輔因子,在培養基中添加金屬離子有助于增加代謝途徑酶的酶活性,提高目標產物產量[30]。同時,添加金屬離子也可以在一定程度上維持發酵環境的pH穩定。因此,選取Mn2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+分別添加進優化后的培養基中進行發酵。實驗結果如圖7所示,金屬離子的添加有效提高了己二酸的產量,其中添加了Cu2+的培養基己二酸產量最高,達到240.49 mg/L。

3 結論與討論

本研究首先將逆己二酸降解途徑模塊化,通過更換不同啟動子協調逆己二酸降解途徑各基因表達強度,最后通過高通量篩選方法對組合進行驗證,確定了途徑關鍵酶PaaJ以及PaaH,對逆己二酸降解途徑基因在底盤細胞中的表達水平實現了成功調控,使己二酸產量達到120.66 mg/L,產量有了明顯提高,為后續優化代謝途徑的研究提供了借鑒。同時,在最優結果基礎上進行了發酵工藝優化,己二酸產量提高了16.65倍,達到240.49 mg/L。在后續研究中,可以從挖掘途徑同工酶、基因元件選擇以及發酵過程參數等方面通過合成生物學以及代謝工程策略進行進一步探究,提高己二酸生物合成的水平。