基于JAK2/STAT3信號通路的烏雞肽營養素配方治療貧血功效研究

張卓然,廖群,馮志遠,劉丹,李明亮,李詒光,任杰, 許錦珍,劉文穎,谷瑞增*,劉文君*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京,100015) 2(江中藥業股份有限公司, 江西 南昌,330096)

貧血是常見的血液疾病,其特征是當血液缺乏足夠健康的紅細胞、血紅蛋白濃度降低以及紅細胞比積低于正常水平,導致攜氧能力降低[1]從而引發的癥狀。貧血會損害一些身體功能(如精神和身體疲勞等[2])。貧血的3個主要原因來自于紅細胞損傷增加、紅細胞生成減少以及失血[3],在實驗模型中經常使用乙酰苯肼(acetylphenylhydrazine,APH)和環磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)聯合誘導來建立貧血模型[4]。乙酰苯肼是一種強氧化劑,可以針對性地破壞紅細胞,通過氧化血紅蛋白從而對紅細胞產生損害[5],使得血液中紅細胞數明顯減少,出現溶血性貧血現象。環磷酰胺作為一種常規化療藥物經常應用在腫瘤患者的治療中,具有較強的免疫抑制作用,通過骨髓功能障礙造成造血干細胞的減少,導致再生性貧血癥狀[6];二者聯合使用從雙重環節上建立小鼠貧血模型。

烏雞是我國的一種特有雞種,主產于江西泰和地區,不僅在外形上十分搶眼,而且具有極高營養價值和藥用價值。烏雞的氨基酸種類齊全,含量遠高于白雞,具有豐富的必需氨基酸,此外還含有多種微量元素和常量元素,其中鐵元素含量也比普通雞高,是營養價值極高的滋補品[7-8]。烏雞作為傳統中藥,具有補氣血、益脾腎的作用,其治療貧血的功能早已得到證實。為了更好地利用烏雞的補血功能開發新的補血產品,本試驗利用酶解法制備出烏雞肽,并配以營養素(EDTAFeNa和維生素),探究烏雞肽營養素配方對造血功能的恢復影響和造血作用機制,為開發貧血治療產品提供重要的理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

烏雞肽營養素配方樣品(泰和烏雞通過酶解工藝,生產為烏雞肽,并調配以微量的EDTAFeNa和維生素得到),中國食品發酵工業研究院;CTX,上海華聯制藥有限公司; APH,北京索萊寶科技有限公司;復方阿膠漿,山東東阿阿膠股份有限公司;40 g/L多聚甲醛組織固定液,武漢塞維爾生物科技有限公司;小鼠EPO酶聯免疫試劑盒、小鼠GM-CSF酶聯免疫試劑盒,美國proteintech公司;小鼠IL-3酶聯免疫試劑盒,南京森貝伽生物技術有限公司;ATP酶試劑盒、總膽紅素試劑盒、直接膽紅素試劑盒,南京建成生物工程研究所; STAT3、Bcl-2、Bcl-XL抗體,美國proteintech公司; p-JAK2、p-STAT3抗體,美國Cell signaling公司;JAK2抗體,上海Santa Cruz Biotechnology有限公司;蛋白分子質量標準,中國碧云天生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

TJ12-H絞肉機,廣東恒聯食品機械有限公司;RE5220旋轉蒸發器,上海亞榮生化儀器廠;YC-L00U噴霧制粒包衣機,上海雅程儀器設備有限公司;R500小鼠麻醉機,深圳瑞沃德生命科技有限公司;Multiskan FC酶標儀,美國Thermo Scientific公司;恒溫干燥箱,北京陸?？萍加邢薰?3K15離心機,德國sigma公司; BC-2800Vet自動血液分析儀,深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司; JXFSTPRP-YLS勻漿機,上海凈信實業發展有限公司。

1.2 動物實驗

選取6周齡SD雌性小鼠60只,體重約30 g,北京斯貝福生物技術有限公司[SCXK(京)2019-0010]。適應性喂養5 d,飼養條件:動物房溫度(20±2) ℃,濕度(45±5)%,12 h日光燈明暗交替循環,自由進食和飲水。正式實驗開始前將小鼠隨機分配為5組,空白組、模型組、陽性對照組組(FEJ)、烏雞肽配方低劑量組(L-WJ)和烏雞肽配方高劑量組(H-WJ),每組12只。根據人體動物劑量換算公式換算[9],陽性對照組每天灌喂8 mL/kg的復方阿膠漿,低劑量實驗組每天灌喂822 mg/kg烏雞肽配方產品,高劑量實驗組每天灌喂1 644 mg/kg烏雞肽配方產品,空白組和模型組每天灌喂等量去離子水,持續灌喂21 d。實驗分為干預期、造模期和恢復期,共計21 d?？瞻捉M小鼠腹腔注射0.1 mL的生理鹽水,其余組小鼠于第8天、第11天腹腔注射20、40 mg/kg APH(配制于0.1 mL生理鹽水中);從第11天到第14天,每日腹腔注射CTX 40 mg/kg(配制于0.1 mL生理鹽水中),連續4 d。共造模7 d來制備小鼠貧血模型。實驗第21天灌喂結束后將小鼠禁食過夜,在第22天稱重,使用麻醉劑麻醉小鼠,眼球采血收集全血后處死,解剖收集脾臟置于液氮速凍,收集股骨置于40 g/L多聚甲醛組織固定液中。所有動物實驗嚴格遵守實驗倫理原則和要求。

1.2.1 體重及臟器指數測定

對小鼠體重進行記錄,實驗共稱取4次體重,分別在第1天開始實驗時,第7天干預試驗結束后、第14天造模結束后和第21天實驗結束后,記錄體重的變化情況。

各組小鼠解剖后,立即取出脾臟和腎臟組織,用生理鹽水沖去臟器表面殘留的血液并修剪多余脂肪,濾紙吸干,稱重并按公式(1)計算各臟器指數。

臟器指數=臟器質量(mg)/小鼠體重(g)

(1)

1.2.2 外周血象檢測

小鼠取全血后放入肝素抗凝管中,立刻通過全自動血細胞分析儀對血液進行外周血分析,測定紅細胞(red blood cell,RBC)、血紅蛋白(hemoglobin,HGB)、紅細胞比容(hematocrit value,HCT)、白細胞(white blood cell,WBC)和血小板(platelet,PLT)的含量。

1.2.3 骨髓病理學觀察

用40 g/L多聚甲醛溶液將小鼠股骨固定,之后用甲酸-檸檬酸鈉對股骨進行脫鈣處理,脫鈣完成后,包埋在石蠟中,切成切片,根據蘇木精染色試劑盒說明染色,并使用倒置熒光顯微鏡進行顯微鏡檢查。

1.2.4 ATP酶活力測定

各組小鼠取肝素抗凝全血,加4倍生理鹽水,使用冷凍離心機1 500 r/min、4 ℃離心10 min,棄去上清液,在沉淀的紅細胞中加入1.5 mL雙蒸水,渦旋30 s,放置15 min,再渦旋30 s,再放置15 min,使其充分溶血直至溶質透亮。嚴格按ATP酶試劑盒(定磷法)操作說明測定紅細胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.2.5 間接膽紅素測定

將小鼠血樣以3 000 r/min、4 ℃離心10 min獲得血清。通過試劑盒測定血清中總膽紅素和直接膽紅素含量,根據公式(2)計算間接膽紅素。

間接膽紅素含量=總膽紅素含量-直接膽紅素含量

(2)

1.2.6 造血調控因子測定

將小鼠血樣以3 000 r/min、4 ℃離心10 min獲得血清。用酶聯免疫測定試劑盒測定血清中造血功能因子紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)、重組巨噬細胞粒細胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)和白細胞介素-3(interleukin-3, IL-3)的含量。按照制造商的說明進行操作。

1.2.7 蛋白免疫印跡檢測

通過蛋白免疫印跡方法測定脾臟中p-JAK、JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白含量。首先提取脾臟細胞蛋白質,通過BCA法檢測蛋白質濃度,然后蛋白質上樣、電泳和轉膜。轉膜完畢加入50 g/L脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗,4 ℃搖床孵育過夜,用TBST溶液在室溫下搖床洗膜3次,加入二抗,室溫孵育2 h,TBST溶液清洗3次,避光加入ECL顯影、定影試劑進行顯影和定影。磷酸化蛋白與其非磷酸化通過灰度比值表示蛋白的相對表達量;其他目的蛋白與β-actin灰度比值表示蛋白的相對表達量。

1.3 數據處理

所有數據均以平均值±標準差表示。使用SPSS 25.0進行統計分析。*表示模型組與空白組相比存在差異(P<0.05);#表示治療組與模型組相比存在差異(P<0.05)。Origin Lab Pro軟件作圖,Image J軟件對蛋白條帶定量分析。

2 結果與分析

2.1 體重變化及臟器指數

根據圖1結果顯示,模型組與治療組體重在造模后的7～21 d體重急劇下降,由體重始末差值(表1)結果發現模型組體重減少的最多,H-WJ組體重減少最少。

圖1 小鼠體重變化Fig.1 Body weight changes in mice

臟器指數結果見表1,與空白組相比,模型組的腎臟指數有顯著性差異地增大(P<0.05),治療組與模型組相比無顯著性差異(P>0.05);模型組與治療組脾臟指數差異顯著(P<0.05),表明脾臟異常腫大,這是因為CTX和APH聯合使用導致貧血而產生的原因。脾臟是貧血中最常見和最早期受影響的器官之一[10],造血功能缺乏和溶血破壞紅細胞會導致紅細胞在脾臟中的積聚[11-12],因此,紅細胞的減少和貧血都可能與脾臟腫大相關。FEJ組和H-WJ組的脾臟指數顯著低于模型組(P<0.05),說明烏雞營養素配方通過劑量依賴的方式保護脾臟,減輕貧血損傷的副作用。

表1 臟器指數及體重始末差值Table 1 Visceral index and weight start-end difference

2.2 外周血象

測定小鼠外周血中RBC、HGB、HCT、PLT、WBC的量(表2)。與空白組相比,模型組RBC、HGB、HCT、PLT、WBC水平顯著降低(P<0.05),說明貧血模型建立成功。與模型組比較顯示,FEJ組和H-WJ配方組治療小鼠的HGB、HCT、PLT和WBC水平顯著升高(P<0.05)。同時,H-WJ和L-WJ均顯著提高了RBC和WBC水平(P<0.05),但用L-WJ治療小鼠的HGB和HCT水平沒有顯著增加。

表2 小鼠外周血象比較Table 2 Comparison of peripheral blood picture in mice

2.3 骨髓病理學觀察

骨髓是最重要的造血器官,由不同時期的造血細胞組成,包括紅細胞、白細胞和血小板。骨髓造血組織在細胞分裂中非?；钴S,它對化學藥劑非常敏感[13],很容易造成損傷,CTX就會引起骨髓抑制作用。由圖2可知,空白組小鼠骨髓組織顏色均勻,骨髓細胞含量豐富,結構清晰;而與正常組相比,模型組骨髓出現退化,含有大量空泡,造血細胞數量減少。在FEJ組和WJ治療組中發現,骨髓中的細胞密度增加,造血細胞豐富,而空泡明顯減少。同時,在不同劑量的WJ治療組中觀察到,隨著劑量的增加對骨髓恢復效果就越好。圖中的結果顯示烏雞肽營養素配方對骨髓抑制有改善作用。

a-空白組;b-模型組;c-FEJ組;d-H-WJ組;e-L-WJ組圖2 骨髓病理學觀察Fig.2 Histopathology of the bone marrow

2.4 ATP酶活力水平

細胞膜上的Na+-K+-ATP保持膜內高鉀和膜外高鈉的平衡,可將ATP分解為ADP并產生能量,對維持紅細胞的形態和功能具有重要作用,在貧血狀態下其活力明顯降低;Ca2+-Mg2+-ATP維持細胞外高鈣和細胞內高鎂的水平,亦可分解ADP以獲得能量。ATP酶活力水平是紅細胞能量代謝及功能有無受損的重要指標。

由圖3可知,模型組的ATP酶活力顯著低于空白組(P<0.05),說明能量代謝酶活力可以作為評價的有效指標。FEJ組和WJ組與模型組對比發現,貧血小鼠降低的紅細胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活力均有顯著升高作用(P<0.05),說明WJ配方可能通過增加小鼠紅細胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力來發揮補血作用。其中H-WJ組對ATP的保護作用相比FEJ組和L-WJ組藥效趨勢更強。

a-Na+-K+-ATP酶活力;b-Ca2+-Mg2+ATP酶活力圖3 小鼠紅細胞ATP酶活力比較Fig.3 ATPase activity in mouse erythrocytes

2.5 間接膽紅素水平

間接膽紅素和直接膽紅素組成總膽紅素。血清中間接膽紅素升高主要與溶血情況有關。大量的紅細胞破壞后,大量血紅蛋白被轉變成間接膽紅素,超過了肝臟的處理能力,不能將其全部轉變成直接膽紅素,使血液中的間接膽紅素升高。其濃度可反映紅細胞被破壞產生溶血的情況。由圖4可知,模型組的間接膽紅素含量最高,說明模型組溶血效果最嚴重,與空白組有顯著性差距(P<0.05)。FEJ組和H-WJ組與模型組相比間接膽紅素含量顯著下降(P<0.05),但L-WJ組與模型組相比無顯著差異(P>0.05),這說明WJ配方會以劑量依賴的趨勢保護紅細胞不被破壞,減少間接膽紅素的含量。

圖4 小鼠血清中間接膽紅素含量比較Fig.4 Indirect bilirubin levels in mouse serum

2.6 造血因子水平

造血是血細胞形成的過程,造血干細胞受到造血微環境中的各種細胞因子(主要包括 EPO、GM-CSF、IL-6等細胞因子)的刺激,隨后增殖和分化產生成熟的血細胞的過程[14]。EPO是一種糖蛋白激素,是產生 WBC 的主要激動劑[15],EPO的生長因子由腎臟釋放并抑制祖細胞凋亡,還可以促進紅細胞快速生成。另一個重要的造血因子是GM-CSF,主要作用于骨髓基質細胞或成纖維細胞,在調節造血和白細胞形成中起重要作用[16]。IL-3作為造血因子,可以在造血干細胞發育成血細胞時,促進造血干細胞增殖和分化。

由圖5-a結果表明,模型組小鼠血清中的EPO含量遠高于空白組(P<0.05),這符合貧血模型現象,環磷酰胺會抑制脾臟中紅細胞前體的生成,從而導致EPO含量增加。FEJ組和H、L-WJ實驗組與模型組相比都有顯著性地(P<0.05)促進EPO的產生,從而提高造血能力。由圖5-b和圖5-c可知,FEJ組和H-WJ組與模型組相比會顯著提高了GM-CSF含量;但對于IL-3的含量只有H-WJ配方與模型組相比存在顯著性差異。同時,L-WJ與模型組在這2個造血因子上沒有顯著差異,以上結果可能說明WJ配方通過劑量依賴的方式增加GM-CSF和IL-3水平。

a-EPO;b-GM-CSF;c-IL-3圖5 小鼠血清中各造血因子水平比較Fig.5 Comparison of serum levels of various haematopoietic factors in mice

2.7 信號通路

JAK2/STAT3信號通路被證明是參與造血、免疫調節和炎癥的細胞因子信號轉導的關鍵通路之一,表達并參與細胞增殖、分化和凋亡[17],并在其中起重要作用[18-20]。EPO與其受體EPOR的結合可迅速激活JAK-STAT信號通路,通過上調轉錄因子和凋亡蛋白促進造血干細胞的存活、增殖和分化,在該通路中,JAK2、STAT3是治療貧血癥狀的主要靶點。細胞凋亡是 JAK2/STAT3 通路的下游生物學過程。Bcl-2和Bcl-XL為其下游的細胞因子,Bcl-2和Bcl-XL是一種抗凋亡調節蛋白。

如圖6和表3所示,與空白組相比,模型組p-JAK2/JAK2水平有顯著性降低(P<0.05),說明CTX和APH會降低信號通路中JAK2蛋白的磷酸化水平,從而影響JAK2/STAT3信號通路;與模型組相比,H-WJ和L-WJ組顯著性提高了p-JAK2/JAK2 和p-STAT3/STAT3水平(P<0.05),并呈現劑量依賴的效果。

圖6 小鼠脾細胞JAK2/STAT3信號通路蛋白表達Fig.6 Expression of JAK2/STAT3 signaling pathway protein in mouse splenocytes

如圖7和表3所示,與空白組相比,模型組 Bcl-2和Bcl-XL的水平顯著降低(P<0.05),表明 CTX和APH 可以致使脾臟中的細胞凋亡。與模型組相比,FEJ組和H-WJ組Bcl-2水平顯著升高(P<0.05),FEJ組、H-WJ和L-WJ組Bcl-XL水平顯著升高(P<0.05),說明烏雞肽營養素配方可以抑制脾臟細胞凋亡。上述研究結果表明,烏雞肽營養素配方可以通過激活JAK2/STAT3通路的磷酸化水平及其下游的細胞凋亡蛋白來保護貧血小鼠的脾臟,促進造血細胞的增殖分化,從而恢復造血功能。

圖7 小鼠脾細胞Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達Fig.7 Bcl-2 and Bcl-XL protein expression in mouse splenocytes

表3 通過蛋白質印跡預測的各蛋白灰度值比Table 3 Gray value ratio of predicted target proteins by Western blot

3 結論與討論

本論文研究了烏雞肽營養素配方在小鼠貧血模型中補血能力的恢復功效,在外周血象、骨髓病理學觀察、ATP酶活力、間接膽紅素含量和造血因子方面進行了探究,并深入探究了JAK2/STAT3信號通路在造血方面受到的影響。實驗結果表明烏雞肽逆轉了外周血細胞的減少,對恢復造血能力和保護紅細胞免受損害有顯著功效。APH作為一種強氧化劑會使紅細胞受到氧化性攻擊而發生破裂,當紅細胞被破壞過速、過多時會出現溶血現象,間接膽紅素水平會增多,通過間接膽紅素結果驗證發現烏雞肽減輕了紅細胞的氧化損傷情況。貧血癥小鼠的紅細胞能量水平下降,紅細胞膜蛋白的磷酸化受阻,細胞膜網架結構改變,會影響紅細胞的形態和變形能力,烏雞肽可以有效地提高紅細胞膜上ATP酶活性,恢復紅細胞的正常形態和功能。烏雞肽通過促進造血因子EPO、GM-CSF和IL-3的產生,加快造血干細胞的分化和成熟,恢復骨髓中造血細胞的總量。烏雞肽配方通過增強JAK2/STAT3信號通路中JAK2和STAT3磷酸化水平的表達來激活信號通路,并且提高下游細胞抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL,從而影響造血細胞周期,使受損細胞在貧血環境中獲得更好的生存條件。本研究的結果為烏雞肽的開發和利用提供了指導。