大腸桿菌發酵低廉生物質產乙醇酸及其分離純化研究

胡成杰,毛銀,李國輝*,鄧禹*

1(江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

乙醇酸(HOCH2COOH)又稱羥基乙酸,作為最簡單的α-羥基酸,同時具有酸和醇的優良性質[1],使其在醫藥、化妝品、紡織、食品等領域應用廣泛。乙醇酸具有出色的水溶性、中強酸度等特性,使其很容易被皮膚吸收,從而達到去角質、保濕、清潔、肌膚抗氧化的功效。在材料包裝領域,乙醇酸聚合生成的可降解聚合物聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)[2]以及乙醇酸和乳酸聚合生成的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA][3]都具有良好生物降解性、緩釋性和生物相容性,被美國食品和藥品管理局批準用于多種治療用途,如:手術縫合,皮膚移植等。此外,乙醇酸還因為具有極強的水溶性,可以通過化學反應清除設備中的鈣鹽、鎂鹽、鐵垢等以達到除垢的目的,且乙醇酸腐蝕性較小,所以常用70%的乙醇酸水溶液作為清洗劑,廣泛應用于金屬設備及管道清洗去除污垢。

目前國內主要采取化學法大規模合成乙醇酸,如氯乙酸法、甲醛氰化法、甲醛氫羧基化法、草酸酯加氫水解法等[4]。但上述方法多少存在反應條件苛刻、催化劑成本高,產物分離精制要求高等缺點,且化學法制備乙醇酸主要為70%水溶液,其濃縮生產晶體級乙醇酸時,會有較大損耗,以至于醫藥行業的乙醇酸原料必須從強生等外國公司進口。近年來,通過改造工程菌株代謝生產生物基乙醇酸得到廣泛關注,DENG等[5]在大腸桿菌中過表達乙醇酸合成途徑關鍵酶(例如乙醛酸還原酶、檸檬酸合酶和異檸檬酸裂合酶)以及敲除競爭途徑,使得乙醇酸產量可達到65.5 g/L。YU等[6]構建NADPH和碳流量協同體系將乙醇酸產量提高至73.3 g/L。不過目前全生物法合成乙醇酸依舊存在發酵成本較高等問題,限制了其工業化生產應用,尤其缺乏對下游分離純化技術的相關報道。

本研究中,利用重組大腸桿菌Mgly71(MG1655 DE3,harboring PJUN-5 and PJUN-YA),在搖瓶水平上對乙醇酸發酵培養基成分進行優化,通過響應面法獲得最優營養組合,重點考察玉米芯水解液(corncobs hydrolysate, CCH)等低廉生物質成分,開展5 L發酵罐水平初步放大驗證,并進行下游生物分離純化初步研究,以期為生物基乙醇酸的規?；a應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌Mgly71(MG1655 DE3,ΔldhAΔglcBΔaceBΔaldAΔglcDEFΔicdΔglcC,harboring PJUN-5 and PJUN-YA),本實驗室保存。

1.1.2 培養基

LB種子培養基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。

M9發酵培養基(g/L):Na2HPO46.78,KH2PO43,NH4Cl 1,NaCl 0.5,MgSO40.24(單獨滅菌),CaCl20.01,蛋白胨8,酵母粉2,葡萄糖8。

優化培養基(g/L):CaCl26.66×10-3,MgS04·7H2O 1.2×10-2,ZnCl20.13×10-3,MnCl2·4H2O 0.04×10-3,KH2PO44.5,玉米芯水解液13,NH3·H2O 0.78,酵母粉1.5,胰蛋白胨8.5,NaCl 0.5,Na2HPO425.45。

1.1.3 儀器與設備

UV-1800紫外可見分光光度計,翱藝儀器(上海)有限公司;1260 Ⅱ高效液相色譜系統,美國安捷倫有限公司;HYL-C3組合式搖床,太倉市強樂實驗設備有限公司;5424臺式高速離心機,德國Eppendorf(艾本德)公司;G154DWS立式壓力蒸汽滅菌鍋,美國致微有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液的檢測

取1 mL發酵液,10 000 r/min離心2 min后取上清液過0.22 μm濾膜。利用高效液相色譜定量檢測葡萄糖、乙醇酸、乙醛酸、乳酸和乙酸。其中葡萄糖檢測器為示差檢測器,其余有機酸物質的檢測用紫外檢測器(210 nm)。檢測參數為:柱溫35 ℃,流動相5 mmol/L稀硫酸,流速0.6 mL/min,進樣量20 μL。

1.2.2 熒光檢測

將培養的菌液取50 μL置于底透壁黑的96孔板,并用PBS稀釋3倍進行單細胞熒光檢測。綠色熒光激發波長為485 nm,發射波長為528 nm,吸收波長為600 nm。

1.3 培養方法

1.3.1 菌株篩選

將電轉得到的Mgly71菌株在37 ℃搖床孵育培養1 h后,涂布于含有鏈霉素、氨芐青霉素的瓊脂平板上。挑取較大的存活單菌落(菌落直徑>1 mm),在48孔板中培養發酵24 h后,細胞以4 000 r/min離心5 min。將上清液、對數期的MglyC-GP6細胞培養液以1∶10的比例轉移到96孔深孔板中,以誘導傳感器pGBS-PffS-sfgfp中sfGFP的表達。在30 ℃繼續培養6 h后,測量混合物的熒光。

1.3.2 種子培養

將保存于-80 ℃冰箱的菌種在固體LB培養基進行劃線,在37 ℃恒溫培養箱培養14～16 h;挑取單菌落于裝有10 mL LB培養基的50 mL錐形瓶中,37 ℃培養12～13 h作為一級種子液;按2%接種量接種于裝有50 mL LB培養基的250 mL錐形瓶中,培養9 h作為二級種子液。

1.3.3 發酵培養

將事先培養好的種子液以2%的接種量接種于裝有50 mL M9發酵培養基的250 mL錐形瓶中,并添加相應的抗生素,37 ℃,250 r/min條件下培養。

1.4 培養基優化

1.4.1 單因素試驗

以乙醇酸(glycolic acid,GA)產量為響應值,依次對碳源種類、無機氮源種類、有機氮源比例、金屬離子種類等影響因素進行單因素試驗。

1.4.2 Plackett-Burman(PB)實驗

根據單因素試驗結果,確定乙醇酸發酵培養基的關鍵影響因素的添加量,采用Design Expert 11軟件進行實驗設計、數據分析,每組實驗重復3次,結果取平均值。

1.4.3 中心組合設計(central composite design, CCD)和響應面分析(response surface methodology, RSM)

根據PB實驗,確定3個對乙醇酸產量顯著影響因素。借助Design Expert 11軟件進行CCD實驗設計、模型建立,每組實驗重復3次,結果取平均值。

1.5 5 L發酵罐驗證

在優化培養基的基礎上,選擇初始裝液量2.5 L,接種量為5%,轉速為380 r/min,發酵溫度37 ℃,加入一定氨芐青霉素和鏈霉素使其終質量濃度分別為100、50 mg/L。發酵期間以氨水調控pH為7.0,調節通氣量和轉速控制溶氧為30%。

1.6 乙醇酸分離純化

1.6.1 發酵液預處理

發酵結束后,將發酵液121 ℃滅菌20 min,10 000 r/min離心20 min,收集上清液,按照1.2.1節中方法測定乙醇酸濃度。

1.6.2 活性炭脫色發酵液條件優化

發酵液中色素成分復雜,一般通過對發酵液進行全波長掃描,以其中最大吸收峰的位置對應波長的吸光值變化作為脫色效果的參考依據;以液相檢測來確認分離純化各個步驟溶液中乙醇酸的濃度[7]。脫色率和乙醇酸損失率的計算如公式(1)和公式(2)所示:

式中:D,脫色率,%;A0,脫色前吸光值;Ae,脫色后吸光值;R,乙醇酸損失率,%;C0,脫色前乙醇酸濃度,g/L;Ce,脫色后乙醇酸濃度,g/L;V0,脫色前發酵液體積,mL;Ve,脫色后發酵液體積,mL。

在預處理后的發酵上清液中,加入6 g/100 mL的活性炭,在40 ℃、1 000 r/min條件下反應60 min,真空抽濾后測定濾液的吸光度和乙醇酸濃度,計算脫色率和乙醇酸損失率。在此基礎上,依次探究活性炭添加量(1、2、3、4、5、7、9、11 g/100 mL)、脫色溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)、脫色時間(0.5、1、2、3、4 h)對脫色率、乙醇酸損失率的影響。

1.6.3 脫色液的脫鹽和提純

取50 mL乙醇酸發酵液加入4 mL氨水,室溫攪拌2 h。加入1.97 g Ca(OH)2(30%,質量分數),40 ℃反應6 h,取沉淀加入14 mL硫酸(1.84 mol/L)進行酸化,55 ℃攪拌2 h,離心取50 mL酸化上清液加入濃氨水至上清液為中性,加入乙醇酸體積3倍的無水異丙醇,于室溫下攪拌0.5 h后進行抽濾,將濾液進行常壓脫醇,至料溫40～75 ℃后進行高真空(2～8 kPa)回收醇,料溫在40～75 ℃時停止回收。

1.6.4 乙醇酸的結晶和檢測

將獲得的料液以1 ℃/min開始降溫析晶,當溫度降到0～20 ℃時停止降溫,在此溫度下恒溫保持1 h,隨后進行恒溫抽濾,所得濾餅用少許冰水淋洗,即為乙醇酸濕品,進而在低溫高真空條件下獲得高純度的固體乙醇酸。

2 結果與分析

2.1 工程菌株的確定

本實驗室前期成功在大腸桿菌體內構建了乙醇酸生產途徑[5],本研究從已構建的Mgly71菌株出發,利用乙醇酸生物傳感器pGBS-PffS-sfgfp[8],篩選1株生產乙醇酸性能較好的Mgly71菌株,作為本研究工程菌株。結果如圖1所示。生物傳感器pGBS-PffS-sfgfp擬合性驗證結果顯示熒光強度與乙醇酸濃度呈正比趨勢,相關系數高達0.90,證明該方法能較為快速準確檢測乙醇酸。驗證成功后通過轉化Mgly7菌株進行篩選,根據單細胞熒光值進行搖瓶復篩。最后,在復篩得到的25株菌株中存在3株乙醇酸產量大于1.3 g/L的Mgly71菌株,其中最高產量為1.33 g/L,故選擇該菌株為出發菌株。

a-生物傳感器pGBS-PffS-sfgfp篩選下熒光和 乙醇酸濃度之間的相關性驗證;b-Mgly71工程菌株篩選圖1 生物傳感器pGBS-PffS-sfgfp篩選下熒光和 乙醇酸濃度之間的相關性驗證和Mgly71工程菌株篩選Fig.1 Validation of the fit of the biosensor pGBS-PffS-sfgfp and screening of the engineered strain Mgly7

2.2 培養基優化

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 培養基碳源的優化

在微生物發酵過程中,碳源為微生物生長代謝提供了細胞的碳架以及細胞生命活動所需的能量。本實驗以相同碳摩爾濃度的果糖、半乳糖、木糖、玉米芯水解液、麥芽糖、乳糖替換M9發酵培養基中的葡萄糖,搖瓶發酵24 h后測定菌體濃度與乙醇酸產量,不同碳源對菌體的生長和乙醇酸產量影響情況如圖2-a所示,葡萄糖作為常見的速效碳源,最適合菌體生長,但在乙醇酸產量方面,果糖、半乳糖、玉米芯水解液、木糖作為碳源的效果均明顯更好,產量分別可達2.14、1.94、1.8、1.75 g/L,這可能是因為葡萄糖的高效代謝速率超出乙醛酸還原酶的酶催化能力導致產生大量副產物乙酸,抑制了乙醇酸產物的形成。酶解玉米芯水解液中除主要碳源外還含有多種營養物質[9],有利于乙醇酸產量的提高。從成本考慮,半乳糖和果糖價格約為葡萄糖的25倍,木糖價格約為葡萄糖的10倍,而玉米芯水解液來源于農業廢棄物玉米芯[10],價格低廉。因此選擇玉米芯水解液作為最終碳源,碳源濃度對乙醇酸產量的影響如圖2-b所示,隨著碳源濃度的增加,菌體的乙醇酸產量呈現先增后降的趨勢,當玉米芯水解液添加量為10 g/L時,乙醇酸產量最高,達到2.02 g/L。因此選擇10 g/L的玉米芯水解液作為碳源。

a-碳源種類;b-玉米芯水解液(CCH)添加量圖2 碳源對工程大腸桿菌發酵乙醇酸的影響Fig.2 Effect of carbon source on fermentation of glycolic acid by engineering Escherichia coli

2.2.1.2 培養基氮源的優化

氮源是微生物生長的必需物質,對于生長偶聯型菌株的影響巨大[11]。本實驗室前期發現混合氮源更有利于菌體生長和乙醇酸產量的提高[12]。本研究在此基礎上分別探究無機氮源種類和有機氮源比例對菌株的影響。以相同摩爾質量的磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、硫酸銨、氨水替換M9發酵培養基中的氯化銨,搖瓶發酵24 h后測定菌體濃度與乙醇酸產量,結果如圖3-a所示,不同無機氮源對菌體生長影響較小,因為無機氮源作為速效氮源,可以滿足微生物前期生長需求,而有機氮源則滿足菌體中后期生長需要[11]。以氨水作為無機氮源時,乙醇酸產量最高,達到2.1 g/L,雖然添加氨水導致培養基初始pH提高,在前期明顯抑制了菌體的生長,但在后期菌體濃度差距不大,因此選擇0.66 g/L氨水作為無機氮源。

a-氮源種類;b-酵母粉濃度圖3 氮源對工程大腸桿菌發酵乙醇酸的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on fermentation of glycolic acid by engineering E. coli

以酵母粉和蛋白胨組成的混合有機氮源不僅能夠提供氮源,還含有豐富的礦物質、維生素以及氨基酸等菌體生長所需營養物質。固定有機氮源的濃度為10 g/L,以不同酵母粉占總氮比例的混合氮源開展研究。結果如圖3-b所示,酵母粉占總氮比例為15%時,乙醇酸產量最高,可達1.47 g/L。因此選擇0.66 g/L氨水、8.5 g/L蛋白胨和1.5 g/L酵母粉作為最佳混合氮源。

2.2.1.3 培養基金屬離子的優化

在M9發酵培養基中分別添加0.43 mg/L CuCl2·2H2O、0.1 mg/L MnCl2·4H2O、0.14 g/L FeCl2·4H2O、1.64 mg/L ZnCl2來探究金屬離子對菌體的影響,搖瓶發酵24 h后測定菌體濃度與乙醇酸產量。結果如圖4-a所示,從菌體的整體生長情況而言,除了CuCl2·2H2O以外其他金屬離子的加入都明顯的有利于菌體的生長,有研究表明,細胞內游離的銅離子可通過破壞蛋白質、脂質等物質導致細胞死亡[13]。在乙醇酸產量上,MnCl2·4H2O的添加對乙醇酸的產量稍有提高,達到1.4 g/L。因M9發酵培養基中本身含有MgSO4·7H2O、CaCl2,且研究表明[14-18],金屬離子如Mg2+、Mn2+、Zn2+是常見酶的輔因子,Mg2+是細胞壁形成的重要金屬離子;Ca2+是菌體生長和產酶所必需的物質;Mn2+在一定濃度下可以促進大腸桿菌的生長,故對ZnCl2、MgSO4·7H2O、CaCl2、MnCl2·4H2O 4種金屬離子進行濃度優化,結果如圖4-b～圖4-e所示,ZnCl2、MgSO4·7H2O、CaCl2、MnCl2·4H2O 4種金屬離子分別在0.16、12.3、5.5、0.05 mg/L下對乙醇酸的產量提高最明顯,分別達到1.4、1.39、1.47、1.43 g/L,且金屬離子濃度大于上述濃度時,乙醇酸產量有明顯下降,所以確定上述濃度為各金屬離子最佳濃度。

a-金屬離子種類;b-CaCl2質量濃度;c-MgSO4·7H2O質量濃度;d-MnCl2·4H2O質量濃度;e-ZnCl2質量濃度圖4 金屬離子對工程大腸桿菌發酵乙醇酸的影響Fig.4 Effect of metal ions on fermentation of glycolic acid by engineering E. coli

2.2.2 Plackett-Burman實驗

PB實驗的實驗設計和結果如表1所示,方差分析結果如表2所示,模型達到顯著水平(P<0.05),篩選出實驗條件下對乙醇酸產量影響顯著的因素依次為X1(Na2HPO4),X2(玉米芯水解液)。

表1 PB實驗結果Table 1 PB experimental results

表2 PB實驗方差分析Table 2 PB analysis of variance

2.2.3 Central Composite Design實驗

CCD實驗的設計和結果、方差分析如表3和表4所示,P模型<0.01,P失擬項>0.05,說明該模型有較高擬合度。對表3數據進行回歸分析可得二次多項式方程:GA=3.73+0.23A+0.87B-0.01C-(3.00E-03)AB+0.02AC+0.04BC-0.03A2-0.03B2+0.04C2。該方程的相關系數R2=0.958 1,說明此模型選擇正確。

表3 CCD實驗結果Table 3 CCD experimental results

根據回歸方程,交互影響的等高線圖和三維響應面圖分析結果,得到3種成分最佳配比為:玉米芯水解液13 g/L,NH3·H2O 0.78 g/L,Na2HPO425.45 g/L,乙醇酸產量預測值為4.85 g/L。結合預測實驗條件進行3次平行試驗,結果如圖5-a所示,乙醇酸產量可達(4.77±0.12) g/L,接近預測值,說明模型與實際情況擬合較好。

表4 CCD實驗方差分析Table 4 CCD experimental variance analysis

2.3 5 L發酵罐發酵驗證

篩選的Mgly71工程菌株在M9發酵培養基和優化培養基中的發酵結果如圖5-b和圖5-c所示,乙醇酸產量和菌體濃度基本呈生長偶聯趨勢。培養基優化前后乙醇酸的最高產量分別為30、42 g/L,乙醇酸產量提高了40%;菌體濃度(OD600)最高分別為15.8、22,得到了大幅提升。其主要原因可能在于根據蛋白胨中總氮含量更高但氨態氮含量稍低的特點,找到了合適的氮源比例能,讓兩者在乙醇酸生產過程中發揮更好的作用,顯著提高了菌體濃度。同時,優化后培養基中額外添加的的玉米芯水解液、金屬離子在菌體細胞生長、酶合成等方面提供了必要元素[15-18],最終乙醇酸產量得到明顯的提高。

2.4 乙醇酸的分離純化

2.4.1 活性炭純化乙醇酸

發酵結束后,采用高溫滅菌和離心對發酵液進行預處理,玉米芯水解液,酵母粉和蛋白胨本身的顏色在經過高溫滅菌后有所加深,故需要進行脫色處理便于后續乙醇酸的分離純化?；钚蕴烤哂泻芎玫奈锢砗突瘜W吸附作用,常作為發酵液脫色劑,可以對乙醇酸發酵液進行脫色、脫蛋白。據文獻報道[19],粉末狀活性炭脫色效果明顯優于顆粒狀活性炭,故本研究采用粉末狀活性炭對預處理后的發酵液進行研究,同時探究不同活性炭添加量、脫色溫度、脫色時間對脫色率和乙醇酸損失率的影響,結果如圖6所示。

a-活性炭添加量;b-脫色溫度;c-脫色時間圖6 不同脫色條件對脫色率、乙醇酸損失率的影響Fig.6 Effect of different conditions on decolorization rate and glycolic acid loss ratio

如圖6-a所示,隨著活性炭添加量的增加,脫色率和乙醇酸損失率均呈上升趨勢。當活性炭添加量為9 g/100 mL時,脫色率達最高96.7%;活性炭添加量至11 g/100 mL時,脫色率不再增加(96.2%),反而乙醇酸損失率提高至10.8%;當活性炭添加量為5 g/100 mL時,乙醇酸損失率(6.7%)較低,而脫色率可達到78.3%。這是因為單位體積與色素分子碰撞的活性炭增多使色素被吸附的可能性增大,即“范德瓦爾斯力”效應[20]?？紤]到活性炭對乙醇酸有一定吸附作用與工業應用成本,確認最佳活性炭添加量為5 g/100 mL。

如圖6-b所示,隨著溫度的升高,脫色率基本呈先升后降的趨勢,當脫色溫度為50 ℃時,脫色率最高達88.5%,當溫度繼續升高,脫色率反而呈下降趨勢,這主要因為在低溫范圍內,隨著溫度升高,發酵液的流動性增大,色素分子的熱運動加快,與活性炭接觸碰撞的幾率增大,且此時活性炭吸附作用大于解析作用,有利于吸附脫色;當溫度繼續增大時,分子熱運動繼續加快,被活性炭吸附上的色素又被解析下來,解析作用占優勢地位,造成脫色率下降[21]。此外在整個實驗溫度范圍內,乙醇酸損失率變化極小,穩定在7%以下,綜合考慮,確認50 ℃為最佳脫色溫度。

如圖6-c所示,隨著脫色時間的增長,脫色率逐漸升高。當脫色時間為2 h時,脫色率為94%,且2 h之后脫色率趨于平穩。這是由于隨著脫色時間的增長,當體系中固定量的活性炭吸附逐漸達到飽和狀態后,吸附和解析過程處于動態平衡狀態,脫色率也趨于穩定[22]。同時在脫色時間大于2 h之后,乙醇酸損失率逐漸從6.7%提高至8.6%。故綜合考慮,確認2 h為最佳脫色時間。

2.4.2 沉淀法純化乙醇酸

在活性炭添加量為5 g/100 mL,脫色溫度為50 ℃,脫色時間為2 h的條件下對預處理過的發酵上清液進行初步純化分離,得到脫色液。采用沉淀酸化法和減壓蒸發對脫色液純化、濃縮得到酸化溶液、脫鹽溶液、濃縮料液,經過不同處理后的乙醇酸含量和得率見表5。

由表5可知,經過活性炭預處理純化后,乙醇酸得率為95.32%;經過硫酸酸化后的酸化溶液中乙醇酸得率為89.5%;最終真空濃縮得到乙醇酸濃縮液的得率為72.15%。將得到的濃縮乙醇酸料液進行結晶,經HPLC測定結果如圖7所示,所得乙醇酸樣品純度為99.3%。本研究初步探索發酵液中提取乙醇酸的條件,在后續研究中仍需要進一步優化。

表5 不同處理后乙醇酸含量和得率Table 5 Contents and yield of glycolate after different treatments

a-乙醇酸標樣;b-乙醇酸晶體圖7 乙醇酸標樣和Mgly71菌株發酵液純化 乙醇酸晶體的HPLC譜圖Fig.7 HPLC spectrum of glycolate and glycolate purified from fermentation liquid of recombinant E.coli Mgly71

3 結論

隨著發酵工業的不斷發展,降低發酵成本、提高生產效率成為了現代發酵領域的研究熱點。本研究采用統計學方法,首先對碳源、氮源、金屬離子等單因素進行優化,再通過Plackett-Burman實驗、響應面實驗獲得了最佳培養基組成。實驗表明采用最佳培養基:6.66 mg/L CaCl2,12 mg/L MgSO4·7H2O,0.13 mg/L ZnCl2,0.04 mg/L MnCl2·4H2O,4.5 g/L KH2PO4,13 g/L 玉米芯水解液,0.78 g/L NH3·H2O,1.5 g/L 酵母粉,8.5 g/L 胰蛋白胨,0.5 g/L NaCl,25.45 g/L Na2HPO4,搖瓶乙醇酸的產量提高至優化前的3.58倍,5 L罐產量達到42 g/L。此外本研究以活性炭為脫色劑對乙醇酸發酵液進行脫色,最適處理條件為活性炭添加量5 g/100 mL,脫色溫度50 ℃,脫色時間2 h,此時的脫色率為97.6%。經沉淀法和減壓回收進一步純化后,最終乙醇酸晶體純度達到99.3%,本研究為后續生物基乙醇酸的工業化生產提供了思路和實驗基礎。