耐高滲青春雙歧桿菌的篩選及發酵工藝優化

潘子怡,毛丙永,唐鑫,張秋香,趙建新,崔樹茂

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

青春雙歧桿菌廣泛分布于動物和人類腸道中[1],可以調節過氧化氫酶活性和宿主代謝,維持宿主健康[2-3],目前已經被廣泛應用到保健食品、日化用品及化妝品領域。

迄今為止,細胞周期培養[4]、透析培養[5]、細胞固定化培養[6]已被開發用于解決與雙歧桿菌傳統培養相關的問題。因此,恒pH分批培養法仍然是主流,但雙歧桿菌的培養密度小于1.0×109CFU/mL;初始底物濃度過高時,高濃度的代謝產物和副產物的積累可能導致發酵體系滲透壓增加引起的細胞停止生長,從而影響工業生產。此外,在真空冷凍干燥過程中,隨著降溫速度的變化,未冷凍部分溶液的電解質濃度增加也會產生滲透脅迫抑制雙歧桿菌增殖。我們前期研究發現,菌株發酵可達到的最高活菌濃度與其耐滲透壓的能力呈正相關[7]。但是目前青春雙歧桿菌的發酵濃度均不高,可能與其滲透壓耐受能力低有關[8],因此,篩選出能在高滲透壓環境下生存的青春雙歧桿菌對其生產和應用都具有重要意義。

本研究旨在篩選出能夠耐受高滲透壓的青春雙歧桿菌,同時還要保證其耐滲透壓能力的遺傳穩定性,在發酵生產中長期使用。結合培養基成分及培養工藝優化,進一步提高耐高滲青春雙歧桿菌在發酵液中的活菌數,解決青春雙歧桿菌商業應用中發酵密度低的難題,同時在實際生產中,也有更廣泛的發展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青春雙歧桿菌菌株(共94株)均由江南大學食品生物技術中心保藏。

MRS-L培養基(g/L):胰蛋白胨10,牛肉浸膏10,酵母浸粉5,葡萄糖20,CH3COONa 5,吐溫80 1 mL,K2HPO42.0,檸檬酸二銨2.0,MgSO4·7H2O 0.1,MnSO4·H2O 0.05,半胱氨酸磷酸鹽1,pH 6.2～6.4,115 ℃滅菌20 min。原料均購自中國醫藥集團有限公司。

半胱氨酸磷酸鹽緩沖液(CYS緩沖液,g/L):L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,Na2HPO46.0,KH2PO44.5,NaCl 4.0,吐溫80 0.6,pH 6.8～7.0,115 ℃滅菌20 min。原料均購自中國醫藥集團有限公司。

氮源利用偏好性分析培養基(g/L):氮源1,葡萄糖6,K2HPO410,Na2HPO410,MgSO4·7H2O 0.25、MnSO4·H2O 0.05,吐溫80 1 mL,pH 6.0,115 ℃滅菌20 min,其中氮源有:酵母浸粉FM528、安琪大豆蛋白胨FP410、胰蛋白胨、魚骨蛋白胨FP351、牛骨蛋白胨FP326、牛肉浸粉購自國藥集團,胰酪蛋白胨,上海創賽科技有限公司。

MRS-N培養基:在MRS-L液體培養基中添加NaCl調節其滲透壓,1 L MRS-L液體培養基中添加3 g NaCl滲透壓平均增長100 mOsm/kg。

1.2 儀器與設備

GRP-9080恒溫培養箱,上海森信實驗儀器有限公司;FE20 pH計、EL3002電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2450紫外分光光度計,日本島津公司;MS-3-basic渦旋振蕩器,德國IKA公司;MLS-3750高溫高壓滅菌鍋,日本SANYO公司;ZHJH-C1115B超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造有限公司;l?ser-om806 m冰點滲透壓測定儀,德國l?ser公司;LYOBETA-5PS真空冷凍干燥機,西班牙Telstar公司;RC-BIOS10落地式離心機,賽默飛世爾公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化與培養

將-80 ℃冰箱中凍藏的青春雙歧桿菌菌株在MRS固體板上用接種環劃線接種,在溫度為37 ℃的厭氧工作站生長36～48 h,挑取單菌落轉移至5 mL液體培養基中,37 ℃厭氧生長24 h,再以4%接種量傳代至新的液體培養基中,在37 ℃條件下厭氧生長24 h,連續活化3～5次作為種子培養液。

1.3.2 耐滲菌株篩選

將菌種連續活化兩代后的種子培養液,按4%接種量在MRS-L培養基37 ℃厭氧培養18～20 h;將上述步驟得到的培養液按5%的接種量接種到滲透壓為300、500、700、900、1 200、1 400 mOsm/kg的MRS-N液體培養基中,置于37 ℃厭氧工作站培養,測定菌株穩定期時OD600值。

1.3.3 耐滲透壓能力測定

將篩選得到的青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066按照4%的接種量分別在滲透壓為300～1 500 mOsm/kg的MRS-N培養基中厭氧培養24～36 h,每隔2 h取樣測定OD600值,根據生長曲線計算對數期代時。

代時是指菌株在生長過程中平均每分裂1次所需要的時間,能夠直接反映生長的快慢,代時越短表明生長的越快。代時計算方法為:取對數生長期的數據,以菌株生長時間為橫坐標,以log(OD600值,2)為縱坐標,繪制曲線,計算代時,線性斜率倒數即為代時。

1.3.4 耐滲透壓能力遺傳穩定性檢測

為進一步證實篩選得到的菌株性狀是否穩定遺傳,將青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066首先在較低滲透壓下(500 mOsm/kg)傳代3次,再分別置于對應的耐受滲透壓下進行6次連續傳代培養,繪制曲線,測定穩定期的OD600值。將凍存的菌株在-20 ℃保存3個月,取出后活化2～3代,置于對應的滲透壓培養基下培養,測定穩定期OD600值。

1.3.5 氮源利用的偏好性分析

使用氮源利用偏好性分析培養基[9],其中氮源分別為:微生物類氮源、乳基類氮源、植物類氮源和動物類氮源,對照組采用混合氮源(0.2 g/L酵母提取物、0.4 g/L牛肉膏、0.4 g/L胰蛋白胨)。培養基滅菌后按5%比例接種,37 ℃厭氧培養,測定不同氮源下的穩定期OD600值及對數期代時。

1.3.6 碳氮消耗比的測定

使用氮源偏好性培養基,氮源為最佳氮源。以5%接種量接種到各5 mL液體培養基中,在菌株發酵過程中每隔2 h測定OD600值和發酵液中葡萄糖剩余量,計算生長速率開始被抑制和完全抑制時的碳氮消耗比。

1.3.7 生長限制性微量元素(Mg、Mn)分析

參考氮源利用偏好性培養基配制4組不同微量元素的培養基,其中氮源為最佳氮源。A組:不添加;B組:MgSO4·7H2O 0.25 g/L;C組:MnSO4·H2O 0.05 g/L;D組:MgSO4·7H2O 0.25 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L。其余成分:最佳氮源1 g/L、葡萄糖6 g/L、K2HPO47 g/L、Na2HPO47 g/L、半胱氨酸1 g/L。調節pH 6.4,115 ℃滅菌20 min。按照5%的接種量接入4組培養基中,在厭氧工作站中37 ℃培養至穩定期,測定OD600值。

1.3.8 最適生長pH的測定

根據生長速率初始被抑制碳氮消耗比和菌株的耐滲透壓能力確定發酵培養基的初始碳氮源的最適添加量,115 ℃滅菌20 min后,調節轉速為100 r/min,溫度為37 ℃,分別設置pH值為5.0、5.5、6.0、6.5,以5%的接種量將種子液接種到5 L發酵罐培養(培養基為3.5 L),滅菌后N2保壓0.12 MPa,在穩定期取樣測定發酵液中的活菌數。

1.3.9 生長限制性微量元素的最適添加量

使用最佳氮源的氮源利用偏好性分析培養基,其中微量元素質量濃度設置為0.05、0.25、0.75、1.25 g/L,以5%接種量接入菌株至發酵罐,滅菌后通入N2并保壓0.1 MPa,于最適生長pH、37 ℃發酵。每隔2 h取樣測定OD600值,在穩定期測定發酵液中的活菌數。

1.3.10 數據統計與分析

所有實驗至少重復了3次,結果表示為平均值±標準差。使用SPSS 22.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)分析數據。并進行了單因素方差分析(ANOVA)和DUNCAN多重比較完成了差異顯著性分析,P<0.05值的差異被認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 耐滲菌株篩選及耐滲透壓能力遺傳穩定性檢測

2.1.1 耐滲菌株的篩選

通過測定94株青春雙歧桿菌在不同滲透壓條件下的MRS培養基的生長情況進行分析發現,大部分青春雙歧桿菌在滲透壓為900 mOsm/kg時,表現出較差的活力(OD600<0.3),而青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066在1 500 mOsm/kg時,生長才被完全抑制,因此選取此2株青春雙歧桿菌進行下一步研究(圖1)。

2.1.2 耐滲青春雙歧桿菌在不同耐滲透壓條件下的生長曲線

已有研究表明在中性條件下,雙歧桿菌代謝產生的醋酸和乳酸對細胞無明顯毒害作用,滲透壓升高是抑制其生長的限制性因素[10],所以青春雙歧桿菌培養困難與其滲透壓耐受性差有密切關系,因此通過測定耐滲青春雙歧桿菌在不同滲透壓下的生長情況,明確其耐滲透壓能力。如圖2所示,青春雙歧桿菌CCFM1302在滲透壓低于1 000 mOsm/kg時生長速率不受影響,且滲透壓繼續增高的情況下雖然生長受到一定程度抑制但沒有被完全抑制,菌株依然可以得到生長;在1 500 mOsm/kg時,生長曲線斜率趨于0,青春雙歧桿菌CCFM1302生長完全被抑制。在發酵過程中,菌株消耗葡萄糖積累酸根,即滲透壓增加,但發酵前期生物量較少,底物消耗和滲透壓增加亦比較慢,所以培養基濃度控制在不影響菌株生長的濃度,發酵前期對菌株生長的影響不大;待菌達到一定數量且進入對數生長期后期,糖的消耗和滲透壓的積累是個較快的增加過程,此時發酵體系的滲透壓有可能影響菌的生長,但如果尚未達到完全抑制滲透壓,對最高生物量的影響較小。根據前期研究成果[11-12],該菌要達到高生物量,需使其發酵終點滲透壓達到或略低于1 500 mOsm/kg(生長速率被抑制時的滲透壓)。對于青春雙歧桿菌CCFM1066,在滲透壓低于900 mOsm/kg時,生長速率不受影響。而在1 500 mOsm/kg時,生長曲線斜率趨于0,青春雙歧桿菌CCFM1066生長完全被抑制,因此,為達到最高生物量,將其培養基的滲透壓提高至使發酵終點滲透壓達到或略低于1 500 mOsm/kg。

圖1 青春雙歧桿菌在不同滲透壓下穩定期的最大生物量Fig.1 Maximum biomass in stable period of Bifidobacterium adolensentis with different osmolarity

a-CCFM1302生長曲線;b-CCFM1302生長代時;c-CCFM1066生長曲線;d-CCFM1066生長代時圖2 青春雙歧桿菌滲透壓生長曲線和不同滲透壓下生長代時Fig.2 The osmotic stress curve and the generation time of B. adolensentis under different osmotic stress conditions 注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.1.3 耐滲菌株耐滲透壓能力遺傳穩定性

遺傳穩定性的間接證據是不同世代菌株生長行為的重復性。在本實驗中,青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的遺傳穩定性均較好,在6次傳代之后,仍表現出相似的生長行為(圖3-a),表明在馴化之后的菌株具有良好的遺傳穩定性。從圖3-b可以看出,在-20 ℃凍存3個月,活化后在高滲濃度下的生長OD600值依然能達到2.0以上。綜上得出結論:青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的耐滲透壓能力可以穩定遺傳。

a-菌株在初始抑制滲透壓下連續傳代培養生長情況; b-凍存菌株在初始抑制滲透壓下生長情況圖3 菌株耐滲透壓能力遺傳穩定性Fig.3 Stability of strain for osmolarity tolerance

2.1.4 氮源偏好性分析

傳統培養基中的氮源通常過剩,當菌株因培養基中的碳源不足或者滲透壓抑制停止生長時,就會導致氮源無法得到充分利用[11]。因此,不能準確判定可以有效利用的最佳氮源。因此本實驗采用氮源利用偏好性分析培養基[12],通過提高培養基的碳氮比,同時確保菌株停止生長時,培養基中仍有充足的碳源和適宜的pH不會抑制菌株正常的生長水平,分析哪種氮源可以被高效利用。

本實驗選取了4大類氮源,使用氮源利用偏好性分析培養基比較青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066對不同氮源的利用率,結果如表1所示,除胰酪蛋白胨外,各單一氮源對青春雙歧桿菌的增殖作用均弱于對照組,其原因可能是進口的胰酪蛋白胨以酪蛋白為基礎進行消化,具有較國內其他乳基氮源更好的成分和更優的工藝。

表1 不同氮源培養基對青春雙歧桿菌增殖的影響Table 1 Effects of different nitrogen sources on the proliferation of B.adolensentis

酵母粉中含雙歧桿菌所需的維生素、氨基酸和多肽[13],而胰蛋白胨、牛肉膏只含較多的氨基酸,因此考慮將酵母提取物和胰酪蛋白胨以質量比1∶1復配,比較兩者疊加是否大于單一氮源。如圖4所示,酵母浸粉FM528的添加提高了胰酪蛋白胨的利用效率,雖然在代時上的差異不顯著,但是菌株生長至穩定期時OD600值變化明顯;此外,胰酪蛋白胨與酵母提取物復配氮源與胰酪蛋白胨作為單一氮源相比更具成本效益,因此本實驗使用胰酪蛋白胨與酵母浸粉FM528復合物作為青春雙歧桿菌的最佳氮源。

a-菌株CCFM1066在復合氮源中生長曲線;b-菌株CCFM1066在復合氮源中生長代時; c-菌株CCFM1302在復合氮源中生長曲線;d-菌株CCFM1302在復合氮源中生長代時圖4 菌株在不同類別氮源下的生長曲線及對數期代時Fig.4 Growth curve and logarithmic generation time of strain with different types of nitrogen sources

2.1.5 生長限制性微量元素分析

微量元素是雙歧桿菌中某些酶的重要成分或催化劑,其中大部分是金屬離子,對酶的活性有關鍵作用;此外還作為結構穩定劑以及信號轉導因子發揮作用[14-15]。已有研究表明Mn2+和Mg2+相較于Fe2+、Zn2+、Ca2+和Cu2+在菌株增殖方面更重要[16];此外,不同于乳桿菌,雙歧桿菌有自己獨特的雙歧代謝途徑[17]。雙歧桿菌通過果糖-6-磷酸鹽酮糖酶途徑代謝葡萄糖,產生乳酸和乙酸作為主要終產物。果糖-6-磷酸鹽酮糖酶是該途徑的特征酶,Mg2+、Ca2+或Mn2+等離子作為輔助因子促進其活性發揮。此外,雙歧桿菌葡萄糖代謝途徑中的乙酸激酶、葡糖激酶、磷酸甘油酸激酶以及轉酮醇酶等關鍵酶發揮作用都需要Mg2+作為酶促因子[18],因此本研究挑選Mn2+和Mg2+研究其濃度對菌株增殖的影響。

由圖5可知,相對于空白對照組,只添加MgSO4對生物量有顯著提升,Mg元素是青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的限制性微量元素,添加

a-菌株CCFM1302;b-菌株CCFM1066圖5 不同微量元素含量對菌株生長的影響Fig.5 The effect of different trace element contents on the growth of strain

MgSO4與添加MgSO4+MnSO4菌體的生長濃度相似,而單獨添加Mn2+生物量沒有顯著提升,幾乎沒有生長。因此本實驗在培養青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066時只添加MgSO4作為微量元素。

2.2 發酵工藝優化

2.2.1 碳氮消耗比

通過以上試驗,明確了菌株生長所需的最佳碳源和氮源及微量元素。此外,還必須考慮碳氮比對增殖效率的影響。培養基中碳氮質量比一直是高密度培養的重中之重,碳氮比不當不僅會造成底物的浪費,甚至會影響菌株的生長和代謝[19]。王玉林等[20]和高欣偉等[10]的研究已證實,在雙歧桿菌的發酵培養中,當初始發酵培養基中碳源和氮源的比例為生長速率被抑制時的碳氮消耗比時增殖效率最高。

結果顯示,使用優化后的培養基,青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066在生長速率被抑制時的碳氮消耗比分別為(2.71±0.23)∶1和(2.53±0.11)∶1。

2.2.2 最適生長pH

雙歧桿菌胞內涉及碳水化合物和氨基酸代謝的酶在一定的pH范圍內活性較高,但有機酸以未解離分子形式存在是雙歧桿菌分批培養的主要抑制因素[7]。因此調節pH,找到最適生長的pH恒定培養,從而最大程度滿足細菌的生長繁殖。

張瑩[21]和高欣偉等[10]的研究表明,菌株培養要達到最高增殖效率,以生長速率被抑制時的碳氮消耗比及生長速率被完全抑制時的滲透壓作為發酵終點時的滲透壓倒推得到青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066培養基中碳氮源的最適添加量分別為:復合氮源17 g/L,葡萄糖49 g/L;復合氮源19 g/L,葡萄糖51 g/L,此外添加MgSO4·7H2O 0.25 g/L,半胱氨酸1 g/L、吐溫80 1 mL/L,然后在37 ℃條件下控制不同pH培養,研究pH對發酵液活菌數的影響。

圖6的結果顯示了青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066在pH 5.5的條件下,其發酵液活菌數最高,分別達到了(1.58±0.03)×1010CFU/mL和(1.35±0.05)×1010CFU/mL。另分析了培養過程中發酵體系滲透壓的變化,在發酵前期滲透壓未達到各自的生長速率抑制滲透壓,菌株生長不受影響;在發酵后期,發酵體系的滲透壓得到較高的增幅,菌株發酵終點時青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的發酵體系滲透壓分別為(1 416±12) mOsm/kg和(1 413±17) mOsm/kg,雖對菌株生長速率有影響,但未完全抑制其生長。測定了發酵終點時殘糖的含量,分別為(2.42±0.21) g/L和(1.53±0.53) g/L,說明培養基的營養成分得到了高效利用。

a-菌株CCFM1302;b-菌株CCFM1066圖6 菌株CCFM1302和CCFM1066在不同 pH下發酵活菌數Fig.6 The number of viable strains at different pH for CCFM1302 and CCFM1066

2.2.3 最適微量元素添加量

Mg是青春雙歧桿菌的限制性微量元素,而高密度發酵中微生物濃度會不斷增加,所以有必要確定是否需要更高濃度的鎂來確保關鍵酶持續活性。本研究通過添加不同濃度的MgSO4·7H2O,探究其濃度與活菌數的關系。由于在氮源利用偏好性分析培養基中MgSO4·7H2O質量濃度為0.25 g/L,以此為參照,設置4個梯度,進行分批發酵罐培養,由圖7可知,隨著Mg2+濃度升高,其生長趨勢逐漸增加。因此,Mg是青春雙歧桿菌培養環境中的關鍵微量元素,當MgSO4·7H2O質量濃度為0.25 g/L時,青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066發酵液活菌數最高,分別達到了(1.82±0.08)×1010CFU/mL和(1.70±0.03)×1010CFU/mL。因此,在青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的培養基中添加0.25 g/L的MgSO4·7H2O較為合適。

a-菌株CCFM1302;b-菌株CCFM1066圖7 菌株CCFM1302和CCFM1066在不同微量元素 濃度下發酵活菌數Fig.7 The number of viable strains at different concentration of trace element for CCFM1302 and CCFM1066

3 結論

大部分青春雙歧桿菌在滲透壓為900 mOsm/kg時,表現出較差的活力(OD600<0.3),而本文篩選得到的青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066最高可耐受1 400 mOsm/kg;其對不同氮源的利用程度不同,單一氮源中胰酪蛋白胨增殖效果最佳,若將胰酪蛋白胨與富含生長因子的酵母浸粉FM528復配可以得到最高的利用效率;此外,菌株最大生物量與Mg2+濃度有關;青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的最佳生長pH值均為5.5;青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的生長速率被抑制時的碳氮消耗比分別為(2.71±0.23)∶1、(2.53±0.11)∶1。

因此,通過菌株生長速率被完全抑制時滲透壓及生長速率被抑制時的碳氮消耗比倒推得到的青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的最適底物濃度為分別為:復合氮源21.0 g/L,葡萄糖57.0 g/L;復合氮源22.4 g/L,葡萄糖56.5 g/L,此外添加MgSO4·7H2O 0.25 g/L,半胱氨酸1 g/L、吐溫80 1 mL/L。在該濃度下的底物發酵結束時代謝產生的酸根積累引起的滲透壓升高達到菌株完全抑制滲透壓(1 500 mOsm/kg)。若底物含量高于該濃度,菌株停止生長時尚有底物未利用,不僅浪費且初始濃度的底物也會引起滲透壓升高不利于菌株生長;若底物含量低于該濃度,菌株停止生長時是因為底物不夠,因此活菌濃度達不到最高。在優化后的發酵條件下,發酵液活菌數可達到(1.82±0.08)×1010CFU/mL和(1.70±0.03)×1010CFU/mL。