代謝工程改造熱帶假絲酵母生產鼠尾草酸

霍達,陳獻忠,楊海泉,曹鈺

(江南大學 生物工程學院, 工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

鼠尾草酸(carnosic acid, CA),一種易溶于油脂,不溶于水,耐高溫的油溶性酚類二萜化合物,在自然界中廣泛存在于牛至、鼠尾草、迷迭香、百里香等唇形科植物中[1]。CA表現出不同的生物學功能和化學性質,比如抗氧化[2]、抗炎[3]、抗腫瘤[4]以及抗微生物等特性被建議作為預防劑和治療神經退行性疾病,還可將其用于增香的食品添加劑[5-6]等,這使其在醫藥衛生、食品工業等行業中具有廣泛的應用價值[7-10],其需求量也是逐年提高。對于萜類生產,相較于目前已經廣泛用于萜類合成的釀酒酵母而言,熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)具有耐高溫、魯棒性強[11]、產油脂[12]、具有豐富的膜結構[13-15]等特點。伴隨著代謝工程、合成生物學等生物技術的飛速發展,針對于萜類化合物的生物合成,常見的代謝工程改造策略有“推拉”策略、模塊化工程、亞細胞區室化、蛋白質工程等。2015年,IGNEA等[16]報道了一個模塊化的萜烯生產平臺,同時挖掘和鑒定鼠尾草和迷迭香中抗氧化劑CA和相關二萜的生物合成途徑中的酶系。在代謝工程改造方面,WEI等[17]通過融合蛋白共表達和不同過氧化氫酶的過表達以及內質網工程等代謝工程和合成生物策略在釀酒酵母中構建CA的生物合成途徑異源生產CA,其搖瓶發酵和5 L補料分批發酵產量分別為24.65 mg/L和75.18 mg/L。

本研究以實驗室前期構建生產次丹參酮二烯并帶CRISPR Cas9編輯系統的尿嘧啶缺陷型熱帶假絲酵母1C2PM04作為出發菌株。進行如下代謝改造:利用模塊化工程與酵母不同亞細胞區室的空間組合,將來源于鼠尾草的鐵銹醇合酶基因(CYP76AH24)、鼠尾草酸合酶基因(CYP76AK6)和來源于擬南芥的細胞色素還原酶基因(ATR1)以模塊化的方式導入胞質和過氧化物酶體中進行過表達構建下游鼠尾草酸合成途徑(圖1)并探究C.tropicalis在細胞質、過氧化物酶體中分別進行CA合成的潛力;通過融合基因表達策略,進一步消耗前體增加CA池;過表達ATR1,增加電子供體數目提高CA產量;敲除ERG9并通過CRISPR dCas9系統下調另一個拷貝的ERG9,這使得代謝通量導向合成CA前體GGPP的萜類合成途徑。

圖1 熱帶假絲酵母中鼠尾草酸的參考代謝途徑Fig.1 Reference metabolic pathway of carnosic acid in C.tropicalis

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和引物

本實驗中所用的基因克隆載體pMD19-T Simple,大連TaKaRa公司;用于載體構建的大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109,江南大學工業微生物資源與管理中心保藏;質粒PBRP01、Ts-GRE-gda-URA3、Ts-gEi-PGAP1-dCas9-TENO1,本實驗室保藏;菌株1C2PM04為生產CA前體次丹參酮二烯的尿嘧啶(URA3)缺陷型菌株;本研究中構建菌株見電子版增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035384,下同);本研究所用PCR引物見電子版增強出版附表2,引物合成、密碼子優化后的基因合成以及基因測序,蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.1.2 培養基、試劑和儀器

LB培養基(g/L):NaCl 10,酵母粉5,蛋白胨10。

YPD培養基(g/L):葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨20。

2×YPD培養基(g/L):葡萄糖40,酵母粉20,蛋白胨50。

MM培養基(g/L):葡萄糖20,酵母基礎氮源培養基(yeast nitrogen base, YNB)6.7,(NH4)2SO4Cl10。

SM培養基:在MM培養基基礎上添加0.06 g/L尿嘧啶。

5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid,5-FOA)培養基:在SM培養基基礎上添加2 g/L的5-FOA;對應的固體培養基在原培養基上加入20 g/L瓊脂粉。

發酵培養基(g/L):葡萄糖60,酵母粉10,蛋白胨20。

CA標準品、正十二烷(色譜純)、正己烷(色譜純)等,阿拉丁試劑公司;5-FOA、YNB、酵母RNA提取試劑盒等,生工生物工程(上海)股份有限公司;一步克隆試劑盒、熒光定量PCR試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;高速臺式離心機,上海聯邁生物工程有限公司;WD-9403B 瓊脂糖凝膠電泳儀,北京市六一儀器廠;UV2000110紫外可見分光光度計,上海尤尼科有限公司;PCR擴增儀,杭州米歐儀器有限公司;質粒提取試劑盒、PCR產物清潔試劑盒、瓊脂糖電泳凝膠回收試劑盒,康寧生命科學(吳江)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 整合框的構建

以PUC57-CYP76AH24為模板,AH24-F和AH24-R為引物,PCR擴增全長的鐵銹醇合酶基因CYP76AH24并對其進行試劑盒純化后備用;對質粒PBRP01進行NheI和SalI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收8.2 kb片段并進行試劑盒純化;將上述兩純化后的DNA片段通過一步克隆試劑盒進行連接得到質粒Ts-CYP76AH24-CarB。以PUC57-CYP76AK6為模板,AK6-F和AK6-R為引物,PCR擴增全長的鼠尾草酸合酶基因CYP76AK6并對其進行試劑盒純化后備用;使用SpeI和XbaI對質粒Ts-CYP76AH24-CarB雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收8.0 kb片段并進行試劑盒純化;將上述兩純化后的DNA片段通過一步克隆試劑盒進行連接得到質粒Ts- PGAP1-CYP76AH24-TENO1-TPGK1-CYP76AK6-PFBA1。以FCPRA為模板,以CPR-F和CPR-R為引物,PCR擴增4.0 kb片段PFBA1-ATR1-TADH2并對其進行試劑盒純化后備用;對質粒Ts-PGAP1-CYP76AH24-TENO1-TPGK1-CYP76AK6-PFBA1進行NotI單酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收后備用;將上述兩純化后的DNA片段通過一步克隆試劑盒進行連接得到質粒Ts-ATR-C(電子版增強出版附圖1-a,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035384,下同)。對質粒Ts-GRE3-gda324-URA3-GRE3(電子版增強出版附圖2)進行EcoRI單酶切,并對酶切產物進行PCR清潔試劑盒純化,同時用MluI酶切質粒Ts-ATR-C后進行瓊脂糖凝膠電泳回收,將上述兩純化后的DNA片段通過一步克隆試劑盒進行連接,獲得重組質粒Ts-GRE3-gda324-URA3-C(電子版增強出版附圖1-b);使用MluI酶切質粒Ts-GRE3-gda324-URA3-C得到片段GRE3-gda324-URA3-PGAP1-CYP76AH24-TENO1-TPGK1-CYP76AK6-PFBA1-PFBA1-ATR1-TADH2,對所得片段進行純化。

1.2.2C.tropicalis的氯化鋰轉化

熱帶假絲酵母氯化鋰轉化參考文獻[18],以尿嘧啶缺陷型菌株1C2PM04為出發菌株,以URA3基因為篩選標記,將純化后的DNA片段轉入宿主內涂布于MM固體培養基后,在30 ℃恒溫培養箱培養3 d。

1.2.3C.tropicalis轉化子的篩選與URA3的重復使用

挑取1.2.2節MM固體培養基上的轉化子提取基因組進行PCR驗證,將鑒別正確的轉化子涂布于5-FOA固體培養基上,對篩選標記基因URA3進行彈出,經PCR驗證標記彈出后將純化后的PCR產物送公司測序,挑取鑒定正確的菌株進行甘油管保藏。在上述基礎上重復使用篩選基因URA3[19],并對GRE3和XKS基因進行敲除以及表達盒的整合。

1.2.4 基因轉錄水平的測定

通過軟件Beacon Designer 7.9,設計熒光定量PCR所需引物QAH-F和QAH-R等。參考文獻[20]測定CYP76AH24、ATR1、ERG9等基因的轉錄水平。

1.2.5 搖瓶發酵實驗

將重組菌株于YPD固體平板上劃線培養2 d后,在平板上挑取單菌落轉接于20 mL YPD液體培養基中,置于200 r/min,30 ℃搖床過夜培養1 d至OD600值達到8.0～10.0,后轉接于30 mL發酵培養基中,令其初始OD600值為0.1,將其置于30 ℃,200 r/min搖床培養,間隔12 h檢測OD600值,發酵96 h后取發酵液檢測。

1.2.6 發酵產物中CA的提取及檢測

CA的提取:取1 mL發酵液于1.5 mL離心管中轉速12 000 r/min離心3 min,離心結束后吸去上清液后用無菌水洗滌2次。向沉淀中加入1 mL 3 mol/L的HCl溶液,置于沸水浴3 min后冰浴1 min快速冷卻,12 000 r/min離心3 min后棄去上清液,用1 mL無菌水再次洗滌沉淀。向沉淀加入1 mL甲醇,渦旋振蕩10 min后12 000 r/min離心5 min,取上清液500 μL置于干凈離心管中待檢測。

CA的檢測:采用LC-MS檢測分析。LC檢測條件為BEH C18液相色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×150 mm),流動相為100%甲酸-40 min;30%乙腈70%甲酸-45 min;80%乙腈20%甲酸-50 min;100%乙腈-55 min;100%甲酸,檢測波長285 nm,柱溫45 ℃,流速0.3 mL/min,進樣量為5 μL。

2 結果與分析

2.1 CA的生物合成

為構建下游CA模塊,根據文獻報道選擇了可以承擔兩步酶促反應的雙功能酶CYP76AH24以及CYP76AK6,前者可以將次丹參酮二烯經兩步酶催化轉化為11-羥基鐵銹醇,而后者將催化合成的11-羥基鐵銹醇轉化為CA。根據熱帶假絲酵母密碼子偏好性以及特殊性對CYP76AH24、CYP76AK6以及ATR1進行全序列密碼子優化以及基因合成,以1C2CM02為出發菌株,通過CRISPR Cas9系統在C.tropicalis基因組中的GRE3位點上分別整合了上述3條外源基因。其中整合框質粒Ts-GRE3-gda324-URA3-C用MluⅠ單酶切(圖2-a),凝膠電泳回收并純化13.5 kb片段用于轉化,使用GRE3同源臂外側引物UGRE3-F和GRE3同源臂內側引物UGRE3-R驗證重組菌株基因組,正確轉化子條帶大小為1.0 kb(圖2-b),得到單拷貝菌株M02-CS。提取產物后經LC-MS檢測鑒定,CA標準品出峰時間為5.55 min,而處理后的發酵液在該時間處測得對應特征峰并對比標品質譜峰形完全一致(圖2)。結果顯示,在C.tropicalis中成功表達關于CA生物合成的外源基因。

2.2 下游途徑模塊化、區室化對CA生物合成的影響

外源基因區室化是將某些特定的代謝途徑定位在不同的亞細胞結構或區室內,比如胞質、過氧化物酶體、內質網、線粒體等。在本研究中,在C.tropicalis胞內不同細胞區室獨有的理化環境來構建生產二萜類化合物的平臺,選取實驗室前期篩選所得的過氧化物酶體信號肽(ICL、PTS1、ePTS1、POS4-A、BnICL)中較為優秀的ePTS1作為本實驗中用于將CA模塊定位在過氧化物酶體的信號肽[21]。因此,在CYP76AH24、CYP76AK6以及ATR1蛋白質C端添加過氧化物酶體定位信號肽并將其過表達構建重組質粒以獲得更優秀的產CA菌株。通過此策略,成功構建了單拷貝菌株M04-CS和M04-PS以及雙拷貝菌株M04-CD和M04-PD。隨后將上述重組菌株進行搖瓶發酵,通過LC-MS檢測發酵產物,CA產量見圖3-a,菌株M04-PS、M04-PD、M04-CS和M04-CD的CA產量分別為1.21、2.85、4.64、10.25 mg/L。當在外源基因C端后添加過氧化物酶體定位信號肽時,能夠在M04-PD和M04-PS的發酵液中檢測到CA。這表明CA前體物質次丹參酮二烯可以穿過C.tropicalis的亞細胞器過氧化物酶體,以及上述外源基因可以在C.tropicalis過氧化物酶體中正常表達。根據圖3-b生長曲線顯示,相對于單拷貝菌株,雙拷貝菌株的生長情況明顯受到抑制,推測過表達下游CA模塊會加重細胞代謝負擔以及過量的CA可能對細胞膜具有損傷作用,影響生長[22]。

a-重組菌株的CA產量測定;b-重組菌株的生長情況圖3 重組熱帶假絲酵母鼠尾草酸產量以及生長曲線Fig.3 Production of carnosic acid and growth curve in recombinant C.tropicalis

以肌動蛋白基因(ACT)為內參基因,通過熒光定量PCR檢測出發菌株ATCC 20336、M04-CS、M04-CD、M04-PS和M04-PD中的外源基因CYP76AH24、CYP76AK6及ATR1的轉錄水平。根據結果顯示,由于ATCC 20336基因組中未整合外源基因,因此在對照組中無法檢測到對應基因轉錄信號;而M04-CD和M04-PD均過表達相關基因,其mRNA相對豐度遠高于單拷貝菌株M04-CS和M04-PS(圖4)。結果表明,成功在M04-CD中過表達CA途徑外源基因,其搖瓶發酵產量相對較高,將在此基礎上進一步進行代謝工程改造。

圖4 外源基因在不同重組菌株中的表達水平Fig.4 Gene expression levels of exogenous gene in different yeast strains

2.3 下調ERG9對CA合成的影響

在熱帶假絲酵母中,法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate, FPP)是生物合成CA途徑的關鍵節點,其有2個分支代謝途徑:麥角固醇合成途徑和二萜類合成途徑。C.tropicalis作為二倍體酵母其角鯊烯合酶為一對等位基因,為使得FPP池代謝通量盡可能地流向二萜類合成途徑,因此選擇先敲除掉其中一條等位基因以此構建GE0,再通過CRSPR-dCas9系統靶向ERG9不同區域下調另一條等位基因構建GEA、GEB等菌株,構建過程參考1.2.1節。將重組菌株M04-CD、GE0、GEB、GEC等分別接種于30 mL發酵培養基中,相對于對照菌株M04-CD,下調ERG9的重組菌株的生長均受到不同程度的抑制,與預期相符(圖5-a)。利用LC-MS分別測量了對照菌株及重組菌株CA生產情況,如圖5-b所示,在重組熱帶假絲酵母GEA、GEB等菌株中成功調控了內源基因ERG9,相對于對照組轉錄水平,C.tropicalisGEB中ERG9轉錄水平顯著降低,并且該菌株中CA產量相對應提高到對照菌株產量的2.6倍(圖5-c)。實驗結果表明,CA的產量和ERG9的表達水平是負相關的,即對內源基因ERG9轉錄的抑制促使熱帶假絲酵母中CA的積累。

a-重組菌株GE0～GEF的生長情況;b-重組菌株GE0～GEF的ERG9轉錄水平測定;c-重組菌株GE0～GEF的CA產量測定圖5 GE0～GEF菌株CA產量、相對轉錄水平以及生長曲線Fig.5 Production of carnosic acid, relative transcription level and growth curve in recombinant C.tropicalis GE0-GEF

2.4 CYP76AH24和ATR1融合表達對CA合成的影響

有研究表明,將細胞色素P450基因(CYP450)與細胞色素還原酶基因與已編碼“Ser-Thr”的堿基密碼linker連接,設計引物提高A/T相對含量,這會使細胞色素P450和CPR活性得到提高,進而影響下游萜類合成與修飾[23]。因此,將ATR1通過連接肽的形式連接在CYP76AH24的C端進行融合表達,進一步提高下游模塊的催化效率以更好地合成CA。為測試柔性linker(G4S, G4S×2, G4S×3)和剛性linker(E3AK, E3AK×2, E3AK×3)哪種類型的linker更適合細胞色素和細胞色素還原酶的融合表達,以1C2PM04為出發菌株,以強啟動子PGAP1,分別使用剛性和柔性類型linker構建并表達關鍵酶融合蛋白,得到重組菌株HD01～HD06,構建過程參考1.2.1節。實驗結果見圖6,CYP76AH24和ATR1融合表達不會對細胞生長造成影響(圖6-a),剛性linker可以提高CA的產量,其中以E3AK×2融合表達CYP76AH24和ATR1的重組菌株HD05的CA產量達到15.75 mg/L,是對照菌株M04-CD的1.54倍(圖6-b)。結果表明,通過剛性linker融合表達CYP76AH24和ATR1可以提高CA產量,推測可能是兩種蛋白以復合體形式表達可以提高其中一種酶的活性進而提高催化效率。對重組熱帶假絲酵母菌株HD05進行ERG9敲除和下調構建HD07,其CA產量為40.75 mg/L,構建過程參考1.2.1節,后續會在此菌株上繼續進行代謝改造。

a-重組菌株HD01～HD06的CA產量測定; b-重組菌株HD01～HD06的生長情況圖6 HD01～HD06菌株的CA產量以及生長曲線Fig.6 Production of carnosic acid and growth curve in recombinant C.tropicalis HD01-HD06

2.5 增加細胞色素還原酶拷貝數提高CA產量

細胞色素P450是一種血紅蛋白類酶,廣泛存在于動物、植物、微生物中。由于其具有脫烷基化、脫氨、氧化、羥基化等多種催化活性,CYP450在許多代謝途徑中發揮重要作用,如萜類、固醇類的生物合成途徑等。作為一種含鐵氧化酶,底物與CYP450的結合位點和其蛋白中血紅素-Fe3+復合物十分接近,催化反應方程式為NADPH+H++RH+O2→NADP++H2O+ROH。細胞色素氧化還原伴侶細胞色素還原酶的作用為從上述方程中NADPH中傳遞一個電子將Fe3+還原為Fe2+使CYP450發揮功能,因此CPR傳遞電子這一步驟極有可能為CYP450氧化還原酶反應的限速步驟。為研究細胞色素還原酶和細胞色素P450拷貝數比值對CA合成的影響,以HD07作為出發菌株,在熱帶假絲酵母基因組DPP3位點整合ATR1基因,進一步過表達細胞色素還原酶,得到重構組菌株HD08和HD09,構建過程參考1.2.1節。將對照菌株HD07以及重組菌株HD08和HD09進行搖瓶發酵。如圖7所示,細胞色素還原酶基因ATR1的過表達使CA產量顯著提高,單拷貝菌株HD08較HD07提高1.21倍,雙拷貝菌株HD09較HD07提高1.92倍,產量達到78.24 mg/L。結果顯示,細胞色素還原酶基因ATR1拷貝數的增加使得胞內氧化還原反應電子供體數量增加,可以有效提高CA的產量。

圖7 重組熱帶假絲酵母HD08和HD09菌株CA產量Fig.7 Production of carnosic acid in recombinant C.tropicalis HD08 and HD09

3 結論

本研究以熱帶假絲酵母1C2PM04出發,鑒定表達了來源于鼠尾草的外源基因SfCYP76AH24和SfCYP76AK6以及來源于擬南芥的AtATR1,在熱帶假絲酵母胞質中實現了CA的合成。通過將ATR1以連接linker的形式連接在SfCYP76AH24的C端,提高復合體CYP76AH24-ATR1催化CA前體次丹參酮二烯的催化效率,使得CA積累。敲除了內源角鯊烯合酶基因ERG9,減少二萜類前體FPP的消耗,使更多的碳通量流向CA合成途徑。增加細胞色素還原酶拷貝數,提高電子供體數量,進而提高CA生物合成能力。經過上述代謝改造后,最終獲得了一株以葡萄糖為底物生產CA的熱帶假絲酵母重組菌株HD09,經發酵后其CA產量較初始菌株M04-CD提高7.6倍。但目前還存在一些問題,比如將CA導向過氧化物酶體中后產量較胞內產量更低,具體的代謝機理還未曾得知;過表達下游CA模塊和敲除或下調內源基因ERG9都會對菌體生長產生不同程度的抑制以及CA產量還有進一步提升空間等。本研究構建了以熱帶假絲酵母利用底物葡萄糖生產二萜類化合物CA的生物合成平臺,得到了一株CA搖瓶發酵產量78.24 mg/L的重組菌株,為針對假絲酵母利用葡萄糖生產二萜類化合物的代謝改造和進一步研究提供了參考。