四種過氧化物酶體同工酶在畢赤酵母甲醇代謝中的作用研究

鄒瀟毅,王世杰,楊艷坤,3,白仲虎,3*

1(江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院, 江蘇 無錫,214122)3(江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心,江蘇 無錫,214122)

隨著化石燃料的日益減少和CO2的大量排放,世界各國都在尋求并開發低污染、可再生的原料。甲醇是煤炭以及天然氣的副產品[1],價格便宜,到2017年為止,年產量超過1億t[2]。同時,隨著科技的進步,甲醇可以通過電催化[3]或者光催化[4]等綠色的方式獲得。因此,利用甲醇作為底物完成生物轉化成為專家學者關注的方向。研究人員在改造現有的模式生物為甲基營養微生物中取得進展[5],但合成甲基微生物距離工業化應用尚存在技術難題,所以天然甲基微生物成為最佳研究對象。其中,嗜甲醇巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris,即Komagataellaphaffii)憑借其自身優勢在一眾天然甲基微生物中脫穎而出。2009年,人們完成了畢赤酵母的全基因組測序[6],為該酵母的代謝工程研究奠定了基礎。因其完善的翻譯后修飾系統[7-8]以及生物安全性[9],畢赤酵母已被廣泛應用于一系列重組蛋白的生產[10]。此外,畢赤酵母是Crabtree陰性酵母,適用于高密度發酵[11]。

盡管畢赤酵母已經成功應用于多種蛋白質及化合物的工業化生產,但以甲醇為唯一碳源進行工業化生產還面臨著甲醇生物轉化率低下的問題,僅有30%～50%的甲醇被同化為生物量[12-13],這意味著需要通過兩步發酵法(先利用甘油等碳源迅速積累生物量,再用甲醇誘導目的基因表達)的方式來完成工業生產,這種發酵方式極大地增加了生產的時間成本以及物力成本[14]。因此,深入了解甲醇代謝機理,確定關鍵酶基因對后續甲醇利用途徑的改造與優化有重大意義。

在最近的研究中,有團隊發現畢赤酵母的同化途徑發生在過氧化物酶體中(圖1),并從過氧化物酶體中分離出與細胞質中D-核酮糖-5-磷酸-3-表異構酶1(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-1),核糖-5-磷酸異構酶1(ribose-5-phosphate isomerase,Rki1-1),轉醛醇酶1(transaldolase,Tal1-1),果糖-1,6-二磷酸醛縮酶1(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,Fba1-1)等酶對應的同工酶:Rpe1-2,Rki1-2,Tal1-2,Fba1-2[15]。這些酶主要參與木酮糖-5-磷酸(xylulose 5-phosphate,XU5P)的再生,而XU5P作為甲醛受體,對于甲醇同化至關重要。因此本研究對這些過氧化物酶體同工酶進行詳細分析,期望能從中找到甲醇同化的關鍵酶基因,以期為后續甲醇利用途徑的改造優化提供靶標。

圖1 甲醇利用途徑示意圖Fig.1 The diagram of methanol utilization pathway

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗中所用的菌株及質粒見表1。文中所需的引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,并在電子版增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035425)中展示。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids

續表1

1.2 主要培養基及培養條件

大腸桿菌使用LLB培養基(g/L)(蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 5)培養,抗生素使用博來霉素,工作濃度為25 μg/mL,在37 ℃,220 r/min的搖床中培養。畢赤酵母在30 ℃,200 r/min搖床中培養,使用YPD培養基(g/L)(酵母提取物10,蛋白胨20,葡萄糖20)擴大培養,使用YPM培養基(g/L)[酵母提取物10,蛋白胨20,甲醇1.5%(體積分數)]進行熒光定位實驗?？股厥褂貌﹣砻顾?工作濃度為75 μg/mL;當測定生長曲線時,使用MMH培養基(g/L)(無氨基酵母氮源13.4,甲醇1.5%,組氨酸0.004),并且每24 h 補加0.5%(體積分數)甲醇。

1.3 質粒的構建

1.3.1 sgRNA質粒的構建

共構建sgRNA-RPE1-2、sgRNA-RKI1-2、sgRNA-TAL1-2、sgRNA-FBA1-2、sgRNA-SHB175個sgRNA質粒。以sgRNA-RPE1-2質粒的構建為例構建其他4個質粒sgRNA-RPE1-2的構建:通過CHOPCHOP網站(http://chop-chop.cbu.uib.no/)在線設計sgRNA序列,將RPE1-2基因的DNA序列輸入網站并選擇菌種為Pichiapastoris,挑選打分較高的sgRNA序列用于構建質粒。根據對應的sgRNA序列設計部分互補的引物對,退火粘合,通過Golden Gate assembly連接至sgRNA-Cas9骨架質粒的BsaI位點,隨后轉化至E.coliXL10-Gold感受態,通過sg-verify-F/R引物進行菌落PCR驗證并挑選陽性克隆擴大培養,提取質粒進行下步操作。

1.3.2 回補質粒的構建

1.3.2.1 過氧化物酶體同工酶回補質粒的構建

通過PCR從GS115菌株的基因組擴增得到RPE1-2、RKI1-2、TAL1-2、FBA1-2等基因的完整表達框,然后通過Gibson assembly分別將各個基因的表達框組裝至ZH01質粒(圖2)的位點1,得到回補質粒hb-RPE1-2、hb-RKI1-2、hb-TAL1-2、hb-FBA1-2。

圖2 ZH01質粒示意圖Fig.2 The diagram of ZH01 plasmid

1.3.2.2 細胞質同工酶回補質粒的構建

通過PCR從GS115菌株的基因組擴增得到RPE1-1、RKI1-1、TAL1-1、FBA1-1等基因的完整表達框,然后通過Gibson assembly將RPE1-1表達框組裝至ZH01質粒的位點1,RKI1-1表達框組裝至位點2,TAL1-1表達框組裝至位點3,FBA1-1表達框組裝至位點4,得到hb-C4回補質粒。

在hb-C4質粒的基礎上,通過Gibson assembly在各個細胞質同工酶基因的3’端添加過氧化物酶體定位信號1(peroxisome targeting signal type 1,PTS1)序列,即得到定位至過氧化物酶體的細胞質同工酶回補質粒hb-C4P。

1.4 菌株的構建

1.4.1 基因編輯菌株的構建

銀行作為整個供應鏈條的金主，對于整個供應鏈的作用是至關重大的。銀行可以以自身的地位，結合鏈上企業之間的差異，設立一些相關的激勵措施。供應鏈中的企業信息明確，責任明確。加強企業之間的有效合作，建立信任。在激勵機制下表現的更加的真實。

使用實驗室現有的CRISPR-Cas9基因編輯系統(實驗結果未發表)完成KO-RPE1-2,KO-RKI1-2,KO-TAL1-2,KO-FBA1-2,KO-4、KO-SHB17等菌株的構建。KO-RKI1-2、KO-TAL1-2、KO-FBA1-2、KO-4、KO-SHB17等菌株的構建方法請參考KO-RPE1-2的構建。

KO-RPE1-2菌株的構建:首先利用RPE1-2-HAUP-F/ RPE1-2-HAUP-R引物對和RPE1-2-HADN-F/RPE1-2-HADN-R引物對分別擴增RPE1-2基因上下游各1 000 bp的同源臂片段,然后利用RPE1-2-HAUP-F/RPE1-2-HADN-R引物對將上下游同源臂片段進行融合PCR,獲得2 000 bp的上下游同源臂融合片段。最后將1 μg上下游同源臂片段與1 μg sgRNA-RPE1-2質?；旌限D化至GS115感受態細胞,待轉化板形成單克隆菌株后隨機挑取菌株進行基因組PCR驗證,選擇驗證正確的菌株供后續實驗使用。

1.4.2 回補菌株的構建

1.4.2.1 過氧化物酶體同工酶回補菌株的構建

利用BspE I限制性內切酶線性化1.3.2.1節構建的hb-RPE1-2、hb-RKI1-2、hb-TAL1-2、hb-FBA1-2等質粒上的HIS4基因,分別電轉化至KO-4菌株的感受態細胞,得到HB-RPE1-2、HB-RKI1-2、HB-TAL1-2、HB-FBA1-2等回補菌株。

1.4.2.2 細胞質同工酶回補菌株的構建

利用BspE I限制性內切酶線性化1.3.2.2節構建的hb-C4及hb-C4P質粒上的HIS4基因,分別電轉化至KO-4菌株的感受態細胞,得到在KO-4菌株細胞質中過表達4個細胞質同工酶的HB-C4菌株以及在過氧化物酶體中回補4個細胞質同工酶的HB-C4P菌株。

1.5 同工酶亞細胞定位驗證

為了區分過氧化物酶體定位與細胞質定位的不同,將表達GFP蛋白和表達GFP-PTS1(在GFP的C-端融合表達PTS1)蛋白的兩株畢赤酵母細胞分別在YPM培養基中培養18 h,并用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌兩次并重懸。取10 μL制片,用共聚焦激光掃描顯微鏡(TCS SP8,德國徠卡)在488 nm的波長下觀察GFP蛋白細胞質定位及過氧化物酶體定位的表型變化。隨后,將GFP蛋白分別融合到Rpe1-2、Rki1-2、Tal1-2、Fba1-2、Rpe1-1、Rki1-1、Tal1-1、Fba1-1等蛋白的N-端并在畢赤酵母中表達,觀察熒光表型以確定同工酶的亞細胞定位。

1.6 畢赤酵母總RNA的提取和cDNA的合成

使用購自北京康為世紀科技有限公司的超純RNA提取試劑盒提取畢赤酵母總RNA,隨后定量至1 μg并使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒完成逆轉錄,獲得cDNA片段。RNA提取步驟及cDNA合成步驟請參照相應試劑公司的官方說明書。

1.7 實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)引物設計

使用NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)的Prime-BLAST功能設計各基因的RT-qPCR引物。將待測基因的開放閱讀框輸入網頁中的“PCR Template”框,Tm值設為58～62 ℃,PCR產物長度設為80～120 bp,將“Organism”選項切換為“KomagataellapastorisGS115”,“Database”選項設置為“Refseq mRNA”,點擊“Get Primers”即可獲得合適的RT-qPCR引物片段。

1.8 甲醇含量的測定

將樣品在12 000 r/min下離心10 min,吸取上清液進行HPLC測定。使用Aminex HPX-87H色譜柱(9 μm,1 300 mm×7.8 mm,美國伯樂)進行分析。以5 mmol/L H2SO4溶液為流動相,流速設置為0.6 mL/min,柱溫設置為50 ℃運行30 min,運行期間HPLC信號采集使用示差檢測器(RID-10A, 日本島津)。

2 結果與分析

2.1 同工酶定位驗證

通過觀察細胞內無定位信號的GFP蛋白與定位在過氧化物酶體的GFP-PTS1蛋白的熒光分布,可以發現,無定位信號的GFP蛋白熒光彌散在整個胞質中,而加有PTS1定位信號的GFP蛋白呈點狀聚集在過氧化物酶體中(圖3)。隨后將GFP-Rpe1-1、GFP-Rki1-1、GFP-Tal1-1、GFP-Fba1-1、GFP-Rpe1-2、GFP-Rki1-2、GFP-Tal1-2、GFP-Fba1-2等融合蛋白在畢赤酵母中表達。如圖3所示,GFP-Rpe1-1、GFP-Rki1-1、GFP-Tal1-1、GFP-Fba1-1等蛋白的熒光分布在整個細胞質中,而GFP-Rpe1-2、GFP-Rki1-2、GFP-Tal1-2、GFP-Fba1-2等蛋白的熒光呈點狀聚集在過氧化物酶體中。因此,Rpe1-1、Rki1-1、Tal1-1、Fba1-1屬于細胞質同工酶,而Rpe1-2、Rki1-2、Tal1-2、Fba1-2屬于過氧化物酶體同工酶。

圖3 同工酶的定位觀察Fig.3 Observation of isozymes location 注:“+”表示相應蛋白所定位的細胞器,“-”表示相應 蛋白未定位的細胞器。

2.2 過氧化物酶體同工酶參與甲醇代謝的驗證

為了驗證過氧化物酶體同工酶參與甲醇代謝,分別測定RPE1-1、RKI1-1、TAL1-1、FBA1-1、RPE1-2、RKI1-2、TAL1-2、FBA1-2在YPD及YPM培養基下的轉錄水平變化,如圖4所示,4個細胞質同工酶基因在YPD培養基和YPM培養基中轉錄水平均無顯著性變化,而過氧化物酶體同工酶基因在YPM培養基中的轉錄水平顯著高于其在YPD培養基中的轉錄水平,該結果說明過氧化物酶體同工酶響應甲醇并參與甲醇代謝。值得注意的是,FBA1-2基因在甲醇培養基中的轉錄水平提升最為顯著,這意味著Fba1-2可能在甲醇代謝過程中發揮重要作用。

圖4 同工酶基因在YPD及YPM培養基中的轉錄水平變化Fig.4 Transcriptional changes of isozyme genes in YPD and YPM medium 注:**表示差異顯著(0.000 1≤P<0.001),***表示差異 極顯著(P<0.000 1)

2.3 過氧化物酶體同工酶的敲除與回補對甲醇代謝的影響

將1.4.1節構建的5株過氧化物酶體同工酶敲除菌在MMH培養基中培養。如圖5-a,圖5-b所示,RPE1-2、RKI1-2、TAL1-2等基因的敲除對畢赤酵母在甲醇培養基中的生長幾乎沒有影響,而FBA1-2的敲除會造成輕微的生長抑制,并且其甲醇利用速率也略有減緩,這可能是由于Fba1-2參與了同化途徑的兩步反應(圖1),因此它在整個甲醇代謝過程中發揮重要作用。值得注意的是,雖然4個過氧化物酶體同工酶的單獨敲除對畢赤酵母的甲醇生長影響不大,但將4個同工酶同時敲除會造成細胞在甲醇培養基中的生物量急劇下降(圖5-a),該結果進一步反映了同化途徑的過氧化物酶體區室化對于甲醇代謝的重要性。

為了明確4個過氧化物酶體同工酶中的關鍵酶,將Rpe1-2、Rki1-2、Tal1-2、Fba1-2單獨回補到KO-4菌株中,如圖5-c,圖5-d所示,Fba1-2的回補能夠最大程度恢復四敲菌株在甲醇培養基中的生物量以及甲醇利用速率,該結果說明Fba1-2屬于甲醇代謝過程中的關鍵酶,它可以成為后續酶改造等優化的靶標。

a-過氧化物酶體同工酶敲除對生長的影響;b-過氧化物酶體同工酶敲除對甲醇利用的影響;c-四敲除菌中回補過氧化物酶體 同工酶敲除對生長的影響;d-四敲除菌中回補過氧化物酶體同工酶敲除對甲醇利用的影響圖5 過氧化物酶體同工酶的敲除及回補對表型的影響Fig.5 Effects of peroxisomal isoenzyme knockout and complement on phenotype

2.4 XU5P主要再生途徑的確認

Tal1-2是XU5P再生途徑中非氧化磷酸戊糖途徑支路的關鍵酶,其缺失應對甲醇利用造成較大影響。但在結果2.3節中,Tal1-2的缺失和回補對于畢赤酵母的甲醇生長幾乎沒有影響。該結果表明非氧化磷酸戊糖途徑可能不是XU5P再生的主要途徑。為了驗證這一猜測,本研究又敲除了另一條推測的XU5P再生途徑中的關鍵酶基因,即更改的卡爾文循環中的SHB17基因。如圖6所示,SHB17的敲除會造成較嚴重的生物量下降以及甲醇利用率減緩。這意味著在畢赤酵母中,非氧化磷酸戊糖途徑和更改的卡爾文循環是兩條互補的XU5P再生途徑,其中更改的卡爾文循環為主要途徑。

a-TAL1-2或SHB17缺失對生長的影響; b-TAL1-2或SHB17缺失對甲醇利用的影響圖6 TAL1-2或SHB17缺失對表型的影響Fig.6 Effects of TAL1-2 or SHB17 deletion on phenotype

2.5 四敲除菌中細胞質同工酶的回補

由于同時敲除4個過氧化物酶體同工酶后,畢赤酵母仍然能在甲醇培養基中生長,根據該結果可推測細胞質同工酶可能在過氧化物酶體同工酶缺失后替代其作用。于是,分別在4敲除菌的細胞質及過氧化物酶體中過表達4個細胞質同工酶,得HB-C4和HB-C4P菌株,如圖7-a所示,HB-C4菌株的4個細胞質同工酶均定位在細胞質,而HB-C4P菌株中4個加有PTS1定位信號的細胞質同工酶呈點狀聚集在過氧化物酶體。隨后測定這些菌株在MMH培養基中的生長情況,發現細胞質同工酶無論定位在細胞質還是定位在過氧化物酶體,均無法改善四敲除菌的生長缺陷(圖7-b)。該結果說明細胞質同工酶在甲醇代謝過程中起到的作用有限,不能完全替代過氧化物酶體同工酶的功能。上述結果也進一步反映了過氧化物酶體同工酶在進化過程中的獨特性以及同化途徑的過氧化物酶體區室化對甲醇代謝的重要性。

a-同工酶定位驗證;b-細胞質同工酶的過表達 對四敲除菌生長的影響圖7 細胞質同工酶的過表達Fig.7 Overexpression of cytoplasmic isoenzymes

3 結論與討論

與RU?MAYER等[15]研究一致,本研究發現Rpe1-2、Rki1-2、Tal1-2、Fba1-2等同工酶存在于過氧化物酶體,且參與甲醇代謝。為了進一步明確甲醇代謝機理以及甲醇同化途徑的關鍵酶基因,本研究對4個過氧化物酶體同工酶進行了系統性的研究。

通過對4個過氧化物酶體同工酶進行單敲除、多敲除以及回補實驗發現:RPE1-2、RKI1-2、TAL1-2等基因的缺失對畢赤酵母的甲醇代謝幾乎沒有影響。而與之前的研究結果一致[16],FBA1-2基因的敲除會對菌株的生長與甲醇利用率產生輕微的影響,這意味著FBA1-2可能是重要的同化基因。在之后的過氧化物酶體同工酶回補實驗中,這一猜測得到驗證。本研究還發現,雖然各個過氧化物酶體同工酶的單敲除對畢赤酵母在甲醇中的生長影響都不大,但如果這4個同工酶同時缺失將會對其生長產生巨大的抑制作用,這一結果反映了同化途徑的過氧化物酶體區室化對畢赤酵母甲醇利用的重要性。先前的研究推測,Tal1-2酶所在的非氧化磷酸戊糖途徑對XU5P的再生只起到了補充作用[17]。本研究通過比較KO-TAL1-2菌株與KO-SHB17菌株的生長水平發現,Tal1-2的缺失對菌株的生長不會產生可見的影響,而Shb17的缺失卻會造成嚴重的生長缺陷,該結果表明Shb17酶所在的更改的卡爾文循環是同化過程中甲醛受體(XU5P)的主要再生途徑。最后,本研究根據在4敲除菌株中過表達細胞質同工酶的結果得出結論:畢赤酵母在長久的進化過程中獲得的過氧化物酶體同工酶具有其獨特性,對于甲醇代謝扮演著舉足輕重的作用。

綜上所述,本研究通過對過氧化物酶體同工酶的系統性研究,進一步明確了同化途徑過氧化物酶體區室化的重要性,確定了甲醇同化過程中的關鍵酶基因FBA1-2以及XU5P的主要再生途徑為更改的卡爾文循環。菌株的優化是發酵工業的重要一環,本研究可為后續優化天然/非天然甲基微生物甲醇利用效率提供理論依據,有助于合成生物學與發酵工業的進一步發展。