光動力技術對副溶血性弧菌的滅活作用

王曉迪,鄭雙芝,龐一,朱軍莉,陸海霞

(浙江工商大學 食品與生物工程學院,浙江 杭州,310018)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus, Vp)廣泛存在于魚、蝦、蟹和牡蠣等水產品中,是重要的水產品源致病菌[1-3]。傳統熱殺菌方式殺菌力強,但高溫有時會對食品特別是水產品的營養、感官等方面產生不良影響。光動力技術(photodynamic technology, PDT)是一種新型的非熱殺菌方法[4],當光敏劑被特定波長的光源激發后產生活性氧(reactive oxygen species, ROS)[5],ROS可以通過3種途徑(生物膜破壞、蛋白質損傷、DNA損傷)導致細胞死亡[6]。姜黃素是從姜黃根莖中提取的葉黃素,在酸性至中性條件下較穩定,具有天然的光敏活性、高靶向性及分子識別功能,在藍光(420～480 nm)下可被激活,因在人體中生物利用度低、安全無毒性被批準為食品添加劑[7-8]。由姜黃素介導的PDT綠色、安全、高效、殺菌譜廣,可以殺滅單核增生李斯特菌[9]、腐敗希瓦氏菌[10]、黃曲霉[11]、假單胞菌[12]、志賀氏菌[7]和諾如病毒[13]。

檸檬酸(citric acid, CA)是存在于柑橘類水果中的可食用酸,是食品、醫藥等領域應用最廣泛的有機酸之一。檸檬酸本身抗菌活性較弱,常與其他技術結合達到協同抗菌作用[14]。檸檬酸結合藍光光照對大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌均可造成顯著的損傷,但是需要光照處理7.5 h,pH值低至4.5[15],此方法盡管可以殺滅食品表面致病菌,但所需時間長,而且添加量高會對食品口感造成影響。

姜黃素PDT協同低濃度檸檬酸處理的優勢在于檸檬酸進入細菌細胞后分解生成酸根離子(ROO-)和質子(H+),降低細胞內的pH值,影響細胞膜的滲透性和代謝機制,從而增加光敏劑對細胞的滲透率和細菌對姜黃素的敏感性,可以在更短時間(光照時間≤10 min)內達到更好的殺菌效果,同時不會過多降低食品pH值(pH 5.6),也可以降低姜黃素染色效應帶來的的不良影響,而且姜黃素和檸檬酸都是安全的食品添加劑。因此本研究采用姜黃素介導的光動力殺菌協同檸檬酸處理滅活Vp,研究其滅菌機理,為其在食品領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

1.1.1 菌株

副溶血弧菌 ATCC 17802(Vp17802)購于上海保藏生物技術中心:http://www.shbcc.org.cn/。

1.1.2 試劑

食品級姜黃素(純度>95%),陜西省寶雞市扶風慈緣生物科技有限公司;檸檬酸(99.5%),阿拉丁試劑公司;LB肉湯、胰酪大豆胨瓊脂(tryptose soya agar,TSA)、3% TSA、Baird-Parker瓊脂、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(thiosulfate-citrate-bilesalts-sucroseagarmedium,TCBS)瓊脂,杭州微生物試劑有限公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)、ROS熒光探針(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA,1 mmol/L),北京索萊寶生物技術有限公司;超微量腺苷三磷酸酶(ATPase)測試盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)測定試劑盒、總蛋白測定試劑盒,南京建成生物工程公司;細菌基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

LED藍光燈(波長429.5 nm,輻照度18.34 mW/cm2,燈管長度1.2 m),華宸照明;SpectraMax iD3 多功能酶標儀,杭州寶誠生物技術有限公司;SIGMA3-30K 高速冷凍離心機,美國Sigma公司;BIO-RAD 核酸電泳儀,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;JS-680D全自動凝膠成像分析儀,上海培清科技有限公司;Nano Pro 2020超微量紫外可見分光光度計,北京鼎昊源科技有限公司,Hitachi SU-8010 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM),日立公司。

1.2 菌懸液、光敏劑及檸檬酸母液的制備

1.2.1 菌懸液的制備

將Vp劃線于TCBS和Baird-Parker平板上,37 ℃培養24 h后挑取單菌落到含3 g/100 mL NaCl的LB肉湯中,37 ℃,180 r/min搖床振蕩培養16 h至穩定期。取1.5 mL菌液10 000 r/min,4 ℃離心5 min棄上清液,沉淀用無菌生理鹽水洗滌3次后加生理鹽水重懸至1 mL,使菌懸液對數濃度為8～9 lg CFU/mL。

1.2.2 姜黃素及檸檬酸母液的配制

按照檀利軍等[16]的方法制備4 000 μmol/L的姜黃素母液和1 000 μmol/L的姜黃素儲備液。母液與儲備液均4 ℃避光保存。檸檬酸母液:稱取1 g檸檬酸用10 mL無菌水配制成0.1 g/mL的母液。

1.3 姜黃素PDT協同檸檬酸處理對Vp的殺菌效果

取100 μL菌懸液加入無菌生理鹽水中,使菌液濃度為7～8 lg CFU/mL。在24孔板中加入姜黃素、100 μL菌液、檸檬酸溶液以及PBS/LB肉湯使孔板中溶液總體積為1 mL。在室溫、黑暗條件下孵育10 min后,用LED藍光燈照射,然后將菌液梯度稀釋涂布于30 g/L NaCl TSA平板上,培養24 h后計數。

設置空白對照組(L-M-C-)、PDT組(L+M-C-)、酸處理組(L-M-C+)、姜黃素處理組(L-M+C-)、姜黃素加酸處理組(L-M+C+)和姜黃素PDT協同酸處理組(L+M+C+)。為考察介質及pH值對殺菌效果的影響分別在PBS緩沖液和30 g/L NaCl肉湯培養基中進行處理,具體如下:

PBS中:姜黃素摩爾濃度為0.5、2 μmol/L,光照時間為0.5、1、2 min。

LB肉湯(30 g/L NaCl)中:姜黃素摩爾濃度為2、4 μmol/L,光照時間為1、5、10 min。

CA處理組:添加CA至其質量濃度為0.5 mg/mL。

1.4 ROS的測定

取100 μL Vp菌懸液與姜黃素溶液(最終摩爾濃度分別為0、2、4、20 μmol/L)、檸檬酸溶液(終質量濃度為0或0.5 mg/mL)混合,加PBS使24孔板中溶液總體積為1 mL,黑暗條件下孵育10 min,分別光照0、5、10 min后,4 ℃、10 000 r/min離心5 min棄上清液,用PBS重懸,加入10 μL熒光探針DCFH-DA(終摩爾濃度為10 μmol/L),顛倒混勻使探針和細胞充分接觸,37 ℃培養 20 min。用PBS洗滌3次后立即在485 nm激發波長、525 nm發射波長下測定熒光強度[17]。設置3組試驗:L-M-C-、L-M+C+和L+M+C+。

1.5 姜黃素PDT協同檸檬酸處理對細胞中抗氧化酶的影響

過夜活化的菌液振蕩均勻后,取100 μL菌懸液加入30 g/L NaCl的LB肉湯中,使菌體濃度為8 lg CFU/mL。設置4組試驗:L-M-C-、L-M+C+、L-M-C+和L+M+C+,藍光照射時間10 min。

1.5.1 CAT活性測定

樣品分組處理后,加入鉬酸銨迅速終止CAT分解H2O2的反應,剩余的H2O2與鉬酸銨作用產生一種淡黃色的絡合物,在405 nm處測定其生成量,可計算出CAT的活力。同時測定各樣品中蛋白質含量。定義反應體系中每毫升菌液每秒催化1 μmol H2O2為1個酶活力單位(U/mL)。

1.5.2 SOD活性測定

樣品分組處理后,用WST-1法[18]測定細菌SOD活力(U/mg prot)。單位定義:在本反應體系中SOD抑制率達50%時所對應的酶量為一個SOD活力單位(U)。

1.6 姜黃素PDT協同檸檬酸處理對細菌細胞壁、膜結構和通透性的影響

1.6.1 ATPase活力測定

樣品處理同1.5節,處理后的菌懸液用PBS洗滌重懸,超聲細胞破碎儀破碎后測定ATPase活力。用超微量ATPase試劑盒測定各細胞破碎液中的ATPase活性,同時用考馬斯亮藍試劑測定各組樣品中蛋白質含量[19]。

1.6.2 AKP活力測定

樣品處理同1.5節,處理后的菌懸液2 500 r/min離心10 min,取上清液用超微量AKP試劑盒測定各樣品AKP活性,同時測定各組樣品中蛋白質含量。AKP活性用King unit/100 mL表示,定義為100 mL菌液與基質作用15 min產生1 mg酚為1金氏單位(King unit)。

1.6.3 SEM觀察細菌形態變化

菌液經處理后移取至1.5 mL EP管中,10 000 r/min離心4 min,棄上清液,迅速用固定液(2.5%戊二醛)充分固定后在4 ℃冰箱放置過夜。經梯度體積分數(30%,50%,70%,80%,90%,95%和100%)乙醇連續脫水、臨界點干燥、鍍膜后SEM觀察。

1.7 姜黃素PDT協同檸檬酸處理對細菌DNA的影響

將過夜活化的菌液振蕩均勻后,取100 μL加入30 g/L NaCl LB肉湯中,使菌體濃度達到8 lg CFU/mL,設置5組試驗:L-M-C-、L+M-C-、L-M-C+、L-M+C+和L+M+C+。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌的總DNA,進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 數據處理與統計分析

每組樣品均設置3個平行,所得數據為3次平行試驗結果的平均值。采用Origin 2019b軟件作圖并分析,通過SPSS Statistics 26軟件進行單因素方差分析,P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 姜黃素PDT協同檸檬酸處理對Vp的殺菌效果

a-PBS;b-3 g/100 mL NaCl LB肉湯圖1 姜黃素介導的PDT協同檸檬酸處理對PBS和 30 g/L NaCl LB肉湯中Vp的殺菌效果Fig.1 The inactivation effect of curcumin- mediated PDT combined with citric acid on V.parahaemolyticus in PBS and 30 g/mL NaCl LB 注:“-”的表示無相應處理,“+”表示進行相應處理; 不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

姜黃素PDT協同檸檬酸處理對PBS/LB兩種介質中Vp的影響如圖1所示。菌懸液加檸檬酸后,PBS和30 g/L NaCl LB肉湯中的pH值分別從7.4、7.0下降至5.6、4.8。結果表明,L+M-C-,L-M-C+,L-M+C-3組單一因素和姜黃素協同檸檬酸(L-M+C+)處理后 Vp菌落總數與空白對照組(L-M-C-)無顯著差異(P<0.05);姜黃素介導PDT(L+M+C-)殺菌效果增強,且隨姜黃素濃度增加而增強;姜黃素介導PDT協同檸檬酸(L+M+C+)處理組顯著殺滅Vp(P<0.05),殺菌效果隨姜黃素濃度的增加和光照時間延長而增強,同時與檸檬酸表現出協同作用,在PBS中Vp下降了7.43 lg CFU/mL。在LB肉湯中要達到與在PBS中類似的殺菌效果則需提高姜黃素的濃度并延長光照時間,添加檸檬酸同樣有顯著協同效應,但是在LB肉湯中Vp耐受性更強,主要是因為LB培養基中的營養物質干擾姜黃素對藍光的吸收,降低了光動力的殺菌效率。但同時LB肉湯緩沖pH的作用沒有PBS強,而Vp對酸較敏感,有研究表明檸檬酸飲料對弧菌有強烈的抑制作用,一是pH值的影響,二是其陰離子具有獨特的殺菌功能[20]。因此添加檸檬酸對LB肉湯中Vp的協同殺菌效果極為顯著。由此可見,延長光照時間、增加光敏劑濃度、協同檸檬酸處理均可以增強PDT滅活效果。本研究中檸檬酸對PDT殺菌的增強作用可能來自兩方面:1)增加細菌對光敏劑姜黃素的敏感性;2)提高姜黃素本身的光活性。檸檬酸降低細胞內pH值并影響細胞質環境[21],增強姜黃素的滲透以及細菌對姜黃素光活性的敏感性,產生更強的抗菌光活性。而且從另一個角度來看,酸性環境還可以提高姜黃素在水中的穩定性和溶解度,直接增強了姜黃素的抗菌光活性[22]。LI等[23]研究了姜黃素殼聚糖對金黃色葡萄球菌及其在不銹鋼表面生物膜的光動力學殺菌效果,結果也表明,姜黃素濃度、孵育和光照時間是影響細菌光動力失活的主要因素。DE OLIVEIRA等[24]用姜黃素結合長波黑斑效應紫外線(ultraviolet radiation A)滅活大腸桿菌O157∶H7和李斯特菌,通過添加檸檬酸來增強殺菌效果,使姜黃素溶液pH值從6降到2.5,再經UV-A光照5 min后,大腸桿菌O157∶H7和單增李斯特菌都減少了5 lg CFU/mL,說明酸性環境有利于姜黃素的殺菌。另有研究表明,沒食子酸和乳酸也能影響大腸桿菌O157∶H7的細胞膜滲透性和代謝機制,與UV-A光結合,可以導致細菌失活[25]。

2.2 姜黃素PDT協同檸檬酸處理誘導產生ROS及對細菌抗氧化酶活性的影響

光敏劑吸收光子被激發后到達三重態的激發態,通過Ⅰ型和Ⅱ型光動力反應生成超氧陰離子(·O2-)、H2O2、羥自由基(·OH)等ROS和單線態氧(1O2),使細胞死亡[6],如圖2-a所示。L-M+C+組與空白對照組相比ROS水平沒有顯著提升,說明姜黃素必須被藍光激發才能產生ROS。提高姜黃素的濃度(2、4 μmol/L)、延長光照時間(5、10 min)、加檸檬酸(0.5 mg/mL)等都會導致體系中 ROS的水平顯著提高(P<0.05)。FREITAS等[26]用姜黃素光動力處理金黃色葡萄球菌,發現姜黃素濃度不變時,隨光照時間的延長,ROS生成量增加。ROS量與菌落計數結果呈負相關,即隨姜黃素濃度增加、光照時間延長及檸檬酸的添加,菌體內ROS水平不斷升高,菌落總數不斷降低。

CAT和SOD都是細菌體內重要的抗氧化酶,這些抗氧化酶共同作用,防止細胞內ROS水平過高[27]。Vp的CAT活力如圖2-b所示。是否協同檸檬酸處理對CAT活力影響更大,高濃度姜黃素PDT協同檸檬酸處理后,Vp的CAT完全失活(P<0.05)。Vp的SOD活力如圖2-c所示。SOD活力受姜黃素濃度影響更顯著,SOD活力與姜黃素濃度呈劑量依賴性。低濃度姜黃素PDT處理Vp使SOD活力略微增加,這是SOD對少量ROS的應激響應[28],但隨著姜黃素濃度的升高SOD活力最高下降了89.75%。由此可知:PDT處理時,提高姜黃素濃度及添加檸檬酸會使SOD和CAT活力下降,高濃度姜黃素協同檸檬酸處理時酶活力下降更顯著(P<0.05)。

KHAN等[29]用核黃素作為光敏劑光動力處理大腸桿菌時也發現類似現象,與只核黃素處理和單光照處理的樣品相比,暴露于光照下核黃素處理的樣品中SOD和CAT顯著降低。韓啟明等[30]研究發現低濃度姜黃素光動力處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌會導致兩種菌SOD活力略微上升,但隨著光敏劑濃度上升酶活力又會下降,這是酶對適量ROS的應激響應及因氧化爆發超過細菌抗氧化能力,最終破壞酶的空間結構,與本文結果一致。

a-ROS量;b-CAT活力;c-SOD活力圖2 姜黃素介導的PDT協同檸檬酸處理對Vp細胞中產生的ROS量、體內CAT活力、SOD活力的影響Fig.2 Effects of curcumin- mediated PDT combined with citric acid on concentration of ROS and activities of CAT or, SOD in V.parahaemolyticus

2.3 姜黃素PDT協同檸檬酸處理對細胞壁、膜通透性的影響

2.3.1 對細胞壁、膜通透性的影響

ATPase是生物膜上的一種極其重要的蛋白酶,對維持細胞的正常生理功能起著必不可少的作用。當細胞受損或死亡時,ATP含量迅速下降,可通過測定細胞中ATPase活性來反映細胞膜的損傷[31]。由圖3-a可以看出,PDT處理后Vp的ATPase活性均顯著降低(P<0.05)。PDT處理時,提高姜黃素濃度和添加檸檬酸會使ATPase活力下降,在高濃度姜黃素PDT協同檸檬酸處理時ATPase活性下降最多,細胞膜損傷更嚴重。L+M+C+處理組與空白對照組相比Vp的Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性分別下降了97.98%和97.34%。細菌中的AKP通常位于細胞膜和細胞壁中間,只有當細胞壁受損時,才會泄漏到胞外。因此,可通過測定上清液中AKP含量反映細菌細胞壁的完整性。由圖3-b可知,與空白對照組相比,添加檸檬酸的處理都可以顯著增加Vp細胞壁通透性(P<0.05)。不光照僅姜黃素聯合檸檬酸處理后,與對照組相比兩種菌的AKP活性都有上升,甚至高于姜黃素光動力處理組,但仍比姜黃素PDT協同檸檬酸處理組的AKP活性低(P<0.05),表明這些處理均對細胞壁造成損傷。經高濃度姜黃素PDT協同檸檬酸處理10 min后,與空白對照組相比AKP活性上升了0.28 King unit/100 mL。由此可知,PDT處理時,提高姜黃素濃度和添加檸檬酸會使上清液中AKP活力上升,在高濃度姜黃素PDT協同檸檬酸處理時,上清液中AKP活性上升最多,細胞壁損傷最嚴重。

a-姜黃素介導的PDT復合檸檬酸處理后對Vp ATPase活性的影響; b-姜黃素介導的PDT復合檸檬酸處理后對Vp上清液中 AKP活性的影響圖3 姜黃素介導的PDT協同檸檬酸處理后對 Vp細胞中ATPase和上清液中AKP活性的影響Fig.3 Effects of curcumin-mediated PDT combined with citric acid on ATPase activity in V.parahaemolyticus and AKP activity in supernatant

2.3.2 SEM觀察細胞微觀結構

為進一步探究PDT各處理對Vp的作用機理,通過SEM對細菌形態進行觀察,結果如圖4所示。與空白對照組相比,經姜黃素PDT處理后,Vp發生形變,出現更深的凹槽和褶皺(圖4-b)。再協同檸檬酸處理,由于細胞膜被破壞導致內容物流失嚴重,Vp呈現扁平破損狀態(圖4-c)。

a-L-M-C-;b-L+M+C-;c-L+M+C+圖4 姜黃素介導的PDT協同檸檬酸處理對Vp 細胞形態的影響Fig.4 Effects of curcumin-mediated PDT combined with citric acid on cell morphology of V.parahaemolyticus 注:光照時間均為10 min(圖5同)。

2.4 姜黃素PDT協同檸檬酸處理對細菌DNA的損傷

光動力處理后 Vp基因組 DNA 瓊脂糖凝膠電泳如圖5所示。與對照組相比,低濃度姜黃素PDT組的 DNA條帶稍微變暗,高濃度姜黃素PDT組的DNA條帶變暗更明顯,從總體水平來看,Vp經過姜黃素PDT處理后,DNA均有損傷(圖5)。高濃度姜黃素PDT協同檸檬酸處理后A3泳道已經沒有條帶出現說明Vp已完全受損,與計數結果相吻合。有研究發現,PDT會導致某些細菌DNA的嚴重損傷,包括Vp、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和單核細胞增生李斯特氏菌等[32]。

A1-2 μmol/L姜黃素;A2-4 μmol/L姜黃素; A3-4 μmol/L姜黃素+0.5 mg/mL CA圖5 姜黃素介導的PDT協同檸檬酸處理前后 Vp DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.5 DNA agarose gel electrophoresis map of V.parahaemolyticus before and after treatment by curcumin-mediated PDT combined with citric acid

3 結論

姜黃素介導的PDT殺菌效果具有姜黃素濃度和光照時間依賴性,同時姜黃素介導的PDT協同檸檬酸處理表現出更好的殺菌效果,當姜黃素PDT協同低濃度檸檬酸共同處理時,既避免了在實際應用到食品中時高濃度的姜黃素對食品的顏色造成影響,也解決了姜黃素在食品基質中的溶解度低影響殺菌效果的問題,還不會因添加過高的檸檬酸使食品的pH值降低太多。PDI協同CA處理對Vp的滅活機理主要是姜黃素吸收430 nm的藍光被激發到更高的能量狀態,通過電子轉移和能量轉移產生具有強氧化性ROS,進而破壞細胞壁、膜、DNA,改變酶活力(ATPase、抗氧化酶CAT、SOD活力下降,AKP活力上升等),擾亂細胞的正常生理功能,并最終導致細胞壁、膜破損進而裂解死亡。同時PDT協同檸檬酸處理可以有效清除Vp生物被膜。

本研究為姜黃素介導的PDT協同CA處理應用于控制不適合或不進行熱殺菌的食品中Vp的污染提供了理論依據。