大豆肽和豌豆肽對胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝及其相關機制的研究

劉婧,任瑋,程改平,李可,徐淼,閆九明,李明亮,秦修遠*

1(四川大學 華西醫院,四川 成都,610041)2(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京,100015) 3(北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京,100015)4(江南大學 糧食發酵與食品生物制造 國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)

大豆肽和豌豆肽是大豆分離蛋白或豌豆蛋白經現代生物酶解等生物技術制得的小分子低聚肽,通過酶解技術釋放出蛋白質氨基酸序列中存在的多種活性肽段,因而具有多種生物活性功能。除增強免疫力[1]、緩解體力疲勞[2]等以外,大豆肽還被證實具有多種生理功能。YIMIT等[3]證明了大豆肽能夠調節志愿者的細胞免疫系統,提高血漿多巴胺水平來調節神經遞質,從而促進大腦功能。RAYAPROLU等[4]發現了大豆肽能夠抑制包括血液CCRF-CEM和Kasami-3細胞、乳腺癌細胞MCF-7、前列腺癌細胞PC-3細胞等多種癌細胞生長,有望作為替代癌癥治療的食品配料或營養補充劑。AMAKYE等[5]通過D-半乳糖誘導的衰老小鼠灌胃不同來源生物活性肽,發現大豆肽也具有良好的抗衰老、抗氧化活性。ISHIHARA等[6]給予高脂飲食誘導的II型糖尿病小鼠大豆肽,結果顯示大豆肽能夠抑制II型糖尿病小鼠吸收膳食中的脂類,增加碳水化合物氧化,增加餐后能量消耗。

ZHU等[7]和WEI等[8]在豌豆肽中發現了4種具有調節糖代謝通路的肽段,并通過高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導的II型糖尿病小鼠實驗證明了豌豆肽能夠預防胰島素抵抗,可能具有開發糖尿病人使用的功能食品的基礎。崔欣悅等[9]在HepG2細胞的胰島素抵抗模型中發現,豌豆肽干預后細胞的葡萄糖消耗量提高了1.31～1.68倍,胰島素受體的表達提高率1.19～1.34倍,凋亡蛋白Caspase-3陽性表達率增加。張敏佳等[10]也通過環磷酰胺致免疫抑制小鼠證實了豌豆肽能夠改善小鼠免疫臟器質量及形態,提高白細胞、脾臟T淋巴細胞、免疫球蛋白含量等的含量。秦修遠等[11]以DPPH自由基、羥自由基及Fe3+為判斷指標,研究了豌豆肽的抗氧化作用。

盡管已有研究證明大豆肽和豌豆肽均具有開發II型糖尿病人營養膳食功能的基礎,但對于二者的作用分子通路及二者復合的增效作用卻鮮有研究。本研究建立胰島素抵抗模型,探究不同比例的大豆肽與豌豆肽的復合物對HepG2細胞葡萄糖消耗、葡萄糖吸收的影響作用,并通過葡萄糖轉運蛋白2(glucose transporter 2,GLUT2)、葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)及胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)/蛋白激酶B(Akt)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細胞HepG2,中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心;DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)高糖培養基,美國Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS, 美國Gibco公司;雙抗、CCK-8檢測試劑盒,碧云天生物技術有限公司;人胰島素,索萊寶科技有限公司;2-(N-(7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑-4-氨基)-2-脫氧葡萄糖(2-NBDG),美國Sigma公司;葡萄糖檢測試劑盒、糖原檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;IRS-1、磷酸化胰島素受體底物-1(p-IRS-1)、Akt、磷酸化蛋白激酶(p-Akt)、GLUT2、GLUT4抗體,美國Proteintech公司;大豆肽、豌豆肽,北京中食海氏生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

生物安全柜,新加坡ESCO公司;細胞培養箱,美國Thermo Fisher Scientific;熒光酶標儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;C6流式細胞儀,美國BD公司;SDS-PAGE系統,美國Bio-Rad公司 ;熒光及化學發光成像系統,上海勤翔科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肽的基礎理化成分分析

參照GB 5009.3—2010《食品安全國家標準 食品中水分的測定》、GB 5009.4—2010《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》、GB 5009.5—2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》,分別對大豆肽和豌豆肽中水分含量、灰分含量和總氮(粗蛋白)的含量進行試驗測定。參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》,測定大豆肽和豌豆肽的氨基酸組成。采用文獻[12]所述高效凝膠過濾色譜法測定大豆肽和豌豆肽分子質量及分布情況。

1.3.2 細胞培養

HepG2細胞培養在含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中,培養基采用含10% FBS和1%雙抗(均為體積分數)的DMEM高糖培養基。細胞融合達80%左右時用0.25%(體積分數)胰酶進行消化傳代,平均2～3 d傳代1次。

1.3.3 實驗分組

對數期生長的HepG2細胞的實驗分組情況如下:對照組,僅用2% FBS的DMEM高糖培養基處理;模型組,含10-6mol/L胰島素[13-14]的2% FBS的DMEM高糖培養基;實驗組用含肽的2% FBS的DMEM高糖培養基處理,分為大豆肽組、豌豆肽組、大豆肽∶豌豆肽=1∶1組、大豆肽∶豌豆肽=1∶2組、大豆肽∶豌豆肽=1∶3組、大豆肽∶豌豆肽=3∶1組、大豆肽∶豌豆肽=2∶1組,共9組,以上均為質量比。

1.3.4 細胞活力檢測

將1.3.2節所述各實驗組設置質量濃度梯度為0、100、200、400、600、800 μg/mL,CCK-8法檢測細胞存活率,根據細胞存活率選擇最佳處理濃度。

1.3.5 葡萄糖消耗檢測

收集細胞,接種于96孔板(1×105細胞/mL,200 μL/孔),培養24 h,然后,用含10-6mol/L胰島素和2% FBS的DMEM高糖培養基培養24 h。按照分組各自加入不同樣品,繼續培養48 h,每24 h更換新鮮培養基。收集最后24 h的細胞培養上清液,用葡萄糖檢測試劑盒檢測培養基中剩余葡萄糖含量。

1.3.6 葡萄糖吸收檢測

細胞按照1×105/mL的密度接種在6孔板中(2 mL/孔)培養24 h。然后,用含10-6mol/L胰島素和2%FBS的DMEM高糖培養基培養24 h。按照分組各自加入不同樣品,繼續培養48 h,每24 h更換新鮮培養基。將細胞用PBS洗滌后,以50 μmol/L的終濃度加入2-NBDG,在37 ℃下孵育30 min后,將細胞用PBS洗滌2次,以去除殘留的2-NBDG。消化細胞,將細胞全部收集在黑色96孔板中,并立即在485 nm/530 nm的激發/發射波長下使用熒光酶標儀檢測細胞的熒光強度。熒光強度代表細胞對2-NBDG的攝取,以反映細胞對葡萄糖的吸收能力。

1.3.7 細胞糖原含量測定

按1.3.6節方法培養后。收集細胞,按照糖原檢測試劑盒檢測細胞糖原含量。

1.3.8 Western Blot實驗

按1.3.6節方法培養后。收集細胞蛋白用于Western Blot。分別檢測細胞中以下蛋白的相對表達量:IRS-1、p-IRS-1、Akt、p-Akt、GLUT2、GLUT4。

1.3.9 數據處理

采用Origin 2022對數據進行處理,實驗結果以均值±標準誤差表示。采用Tukey法進行數據分析,各項試驗設置3～6次重復,*#P<0.05表示具有顯著性差異。#與對照組相比具有顯著性差異,*與模型組相比具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 大豆肽和豌豆肽的基礎理化檢測結果分析

大豆肽中水分含量為4.73%,灰分含量為5.08%,蛋白質含量(以干基計)為86.98%,豌豆肽中水分含量為4.46%,灰分含量為5.04%,蛋白質含量(以干基計)為88.30%。2種肽的氨基酸組成及分子質量分布如表1和表2所示。

2.2 細胞存活率檢測

用CCK-8法檢測大豆肽和豌豆肽對HepG2細胞的存活率影響,以確定安全劑量范圍。由圖1可以看出,在肽質量濃度為100 μg/mL和200 μg/mL時,各處理組對細胞存活率均無顯著影響,當肽質量濃度達到400、600、800 μg/mL時,肽對細胞毒性的作用逐漸增強,細胞存活率顯著性降低(#P<0.05),因此,大豆肽和豌豆肽100、200 μg/mL對HepG2細胞無顯著細胞毒性,本實驗后續采取肽的安全劑量為200 μg/mL。

表2 分子質量分布Table 2 Molecular weight distribution of selenium-chelating oligopeptides

a-肽質量濃度100 μg/mL;b-肽質量濃度200 μg/mL;c-肽質量濃度400 μg/mL;d-肽質量濃度600 μg/mL;e-肽質量濃度800 μg/mL圖1 CCK-8法檢測細胞存活率Fig.1 Cell survival rate measured by CCK-8 assay

2.3 葡萄糖消耗檢測

HepG2細胞在含有10-6mol/L的胰島素和2%FBS的DMEM高糖培養基中處理24 h建立胰島素抵抗模型。從圖2可知,模型組的葡萄糖消耗相比于對照組顯著降低,說明HepG2細胞胰島素抵抗模型建立成功,經大豆肽和豌豆肽及其各比例配比處理后,細胞對葡萄糖的消耗量都顯著升高,其中,大豆肽∶豌豆肽=2∶1組在各處理組中相比于模型組差距最為顯著。

圖2 HepG2細胞24 h的葡萄糖消耗量Fig.2 Glucose consumption of HepG2 in 24 h

2.4 葡萄糖吸收檢測

2-NBDG的熒光強度可以反映細胞對葡萄糖的吸收能力。由圖3可知,經造模處理后,模型組的熒光強度相比于對照組顯著降低,經大豆肽和豌豆肽及其各比例配比處理后,細胞中的熒光強度相比于模型組有了不同程度的升高,其中,豌豆肽組、大豆肽∶豌豆肽=1∶3和2∶1相比于模型組具有顯著性差異,尤其是大豆肽∶豌豆肽=2∶1處理組中細胞的熒光強度相比于模型組差距最為顯著,表明該組細胞的葡萄糖吸收能力升高最為顯著。

2.5 細胞糖原含量檢測

由圖4可知,經過造模處理后,模型組細胞中糖原含量相比于對照組顯著降低,經大豆肽和豌豆肽及其各比例配比處理后,各處理組中細胞糖原含量相比于模型組出現了不同程度的升高,其中,大豆肽∶豌豆肽=2∶1處理組中細胞糖原含量相比于模型組升高具有顯著性差異。

圖3 HepG2細胞中2-NBDG的熒光強度Fig.3 Fluorescence intensity of 2-NBDG in HepG2

圖4 HepG2細胞糖原含量Fig.4 Glycogen content in HepG2

2.6 葡萄糖轉運蛋白表達分析

GLUT2和GLUT4,同屬促葡萄糖轉運蛋白,分別以非胰島素方式和胰島素依賴性方式調節葡萄糖跨細胞膜轉運[15-16]。圖5模型組中,細胞的GLUT2和GLUT4蛋白的表達量相比于對照組都出現了一定程度的降低,在大豆肽和豌豆肽以及其不同配比下,細胞中GLUT2和GLUT4蛋白的表達量相比于模型組出現了不同程度的升高,其中,大豆肽∶豌豆肽=2∶1處理組的細胞中上述2個蛋白的表達量相比于模型組升高最為顯著。

a-葡萄糖轉運蛋白GLUT2和GLUT4灰度圖;b-葡萄糖轉運蛋白GLUT2相對灰度值;c-葡萄糖轉運蛋白GLUT2相對灰度值圖5 GLUT2和GLUT4蛋白的相對表達水平Fig.5 Relative expression levels of GLUT2 and GLUT4 preoteins

2.7 IRS-1/Akt通路磷酸化水平分析

磷酸化的IRS-1可以導致Akt產生磷酸化效應,引起Akt通路活化。Akt是胰島素受體信號傳導途徑中的關鍵蛋白激酶,在細胞生長與凋亡、糖類代謝過程中起重要作用?；罨腁kt抑制可以GSK-3β的磷酸化作用,引起GSK-3β下游底物糖原合成酶活性升高,從而促進糖原合成,抑制糖原分解,提高葡萄糖代謝,降低血糖,改善胰島素抵抗狀況。由圖6可以看出,模型組中細胞IRS-1和Akt磷酸化水平相比于對照組顯著降低,在處理組中,大豆肽∶豌豆肽=2∶1組的細胞中上述2種蛋白的磷酸化水平相比于模型組提高較為顯著。

a-IRS-1、Akt及其磷酸化產物灰度圖;b-IRS-1磷酸化水平;c-Akt磷酸化水平圖6 IRS-1和Akt蛋白的磷酸化水平Fig.6 Phosphorylation levels of IRS-1 and Akt

3 結論

胰島素抵抗是組織對胰島素作用的敏感性下降,通常的臨床上指的是機體對胰島素促進葡萄糖提取的作用發生抵抗[17]。肝臟是胰島素作用的中藥靶組織之一,而HepG2細胞是一種體外研究肝細胞的常用細胞株,也是建立胰島素抵抗模型研究的常用模型[18]。

GLUT2和GLUT4是調節葡萄糖跨細胞膜轉運的蛋白成員,分別以非胰島素和胰島素依賴性方式調節葡萄糖跨細胞膜轉運。IRS-1/P13K/AKT信號通路已被證實是GLUT4調控通路的上游。IRS-1促進P13K的磷酸化,磷酸化的P13K進一步將絲氨酸/蘇氨酸Akt磷酸化為p-Akt,進一步促進GLU4從內囊泡轉位到細胞膜,最后激發葡萄糖攝取。GLUT2易位能夠介導葡萄糖在肝細胞膜中的擴散,并維持細胞內外葡萄糖的平衡[19]。因此,胰島素刺激的葡萄糖攝取減少與胰島素抵抗狀態下p-IRS-1減少有關。

本研究中建立的胰島素抵抗模型,表明HepG2細胞在模型刺激下的葡萄糖消耗、葡萄糖吸收、糖原含量的減少,GLUT2和GLUT4蛋白表達水平均降低,磷酸化的IRS-1及Akt均下降,而大豆肽及豌豆肽通過進入細胞膜作用,顯著改善了葡萄糖代謝水平,這表明大豆肽和豌豆肽可能通過增加IRS和Akt的磷酸化水平來促進葡萄糖攝取和提高細胞中葡萄糖轉運蛋白GLUT2和GLUT4的表達量,從而激活胰島素信號通路,進一步改善葡萄糖跨膜代謝障礙,提高細胞對葡萄糖的吸收和消耗能力以及糖原合成能力。當大豆肽與豌豆肽以2∶1的比例時效果最佳。