硫酸軟骨素納米硒的結構表征及其對Hela細胞遷移和侵襲的影響

陳雪花,陳建平,2*,羅寶湞,李佳睿,李瑞,2,劉曉菲,2,宋兵兵,2,鐘賽意,2

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋生物制品工程實驗室, 廣東省海洋食品工程技術研究中心,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東省亞熱帶果蔬加工科技創新中心, 廣東 湛江,524088)2(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心(大連工業大學),遼寧 大連,116034)

在全球范圍內,宮頸癌是所有腫瘤疾病中導致女性死亡的第一或第二大誘因[1]。眾所周知,腫瘤的轉移是一個涉及細胞遷移和侵襲的復雜過程[2]?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)被認為是與腫瘤侵襲和遷移相關的重要蛋白酶,其中,基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)在腫瘤轉移中起著非常關鍵的作用,它們參與破壞I型和IV型膠原蛋白細胞外基質(extracellular matrix, ECM),從而促進癌癥的轉移[3-4]。因此,下調MMP-2和MMP-9蛋白的表達可能是抑制細胞遷移和侵襲的有效策略。

作為公認的微量元素,硒被發現在納米尺度下,其理化性質會發生巨大變化,具有高效、低毒、吸收利用率高等獨特的生物學效應[5-6]。但是,納米硒(selenium nanoparticles, SeNPs)因具有較高的表面能,在水溶液中容易聚集成灰色和黑色元素硒,導致其生物活性和生物利用度降低,從而限制了它的應用[7]。因此,為了獲得穩定的SeNPs,在制備過程中通常會加入穩定劑,不僅可以防止納米硒聚沉,還能提高其生物活性。目前,常用的穩定劑有多糖[8]、蛋白質[9]、多肽[10]和多酚等[11]。其中,多糖因其復雜的支鏈結構和豐富的羥基被認為是天然、安全、方便和環保的分散劑[12]。此外,多糖也具有良好的水溶性和抗腫瘤等生物活性[13]。硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)是一種硫酸化的線性黏多糖。研究發現,CS無毒性且生物相容性良好,骨架中含有大量活潑基團,易于實現疏水性化學修飾和聚合物接枝,具有抗氧化、抗腫瘤、抗血栓等多種生理活性[14-17]。

基于上述的優點,本文選擇CS作為穩定劑對納米硒進行修飾制備硫酸軟骨素納米硒(selenium-chondroitin sulfate nanoparticles, SeCS),希望實現CS和SeNPs協同抗腫瘤的效果。同時,還未見SeCS抑制人宮頸癌HeLa細胞遷移和侵襲的相關報道。故本文以Hela細胞為研究對象,進一步考察SeCS對Hela細胞遷移和侵襲的影響,為SeCS作為一種新型的腫瘤轉移抑制劑提供理論依據和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫酸軟骨素納米硒,實驗室自制;硫酸軟骨素(95%純度,貨號C107703),阿拉丁試劑(上海)有限公司;胎牛血清、PBS、DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶溶液和雙抗溶液,美國Gibco公司;Hela人宮頸癌細胞,美國ATCC公司;Matrigel基質膠含酚紅和草酸銨結晶紫染色液(0.1%),北京索萊寶公司;4%多聚甲醛,廣州碩譜生物科技有限公司;PVDF膜浸潤活化液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(強)、SDS-PAGE電泳液(Tris-Gly,Powder)、TBSTw(TBS+Tween-20)、Western轉膜液、Western一抗稀釋液、Western二抗稀釋液、QuickBlockTMWestern封閉液、BeyoGelTMPlus PAGE預制膠(Tris-Gly,8%,15孔)、ECL化學發光試劑盒和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L),上海碧云天生物技術公司;GAPDH抗體、MMP-2抗體和MMP-9抗體,維百奧(北京)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AUW120電子天平,日本島津公司;HL-6數顯恒溫水浴鍋,常州奧華儀器有限公司;FD8508真空冷凍干燥機,韓國ilshin公司;JEM-1400plus透射電子顯微鏡,日本JEOL公司;K-Alpha X射線光電子能譜儀,美國Thermo Scientific公司;傅立葉紅外光譜儀,德國BRUKER公司;CKX41倒置顯微鏡,日本OLYMPUS公司;Tanon 5200全自動化學發光圖像分析系統,廣州譽維生物科技儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SeCS的制備

參考CHEN等[18]的方法,略作修改。將摩爾質量比為1∶8的Na2SeO3和抗壞血酸(維生素C)溶于30 mL 0.1 mg/mL的CS溶液中,在25 ℃下攪拌3 h。經透析袋(分子質量為3 500 kDa)透析48 h后,冷凍干燥得到所需的樣品SeCS。SeNPs的制備過程同SeCS,只是不添加CS。

1.3.2 SeCS的結構表征

1.3.2.1 透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察

運用TEM觀察樣品的微觀形態。具體操作過程如下:將銅膜網格浸入樣品中,然后用醋酸雙氧鈾染色90 s,待干燥后,觀察樣品的微觀形態。

1.3.2.2 掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察

將少量樣品均勻地分散在導電雙面膠上進行固定,隨后放入離子濺射鍍膜儀中,在真空環境下對樣品進行表面噴金處理,鍍金條件為工作電壓15 keV和工作電流15 mA,在不同放大倍數下觀察樣品形貌。

1.3.2.3 X射線光電子能譜儀(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)分析

運用XPS對樣品的硒價態進行分析。具體參數如下:分析室工作時真空度優于5×10-7mBar;使用單色Al Kα源(能量1 486.6 eV)為X光源,在工作電壓12 kV,燈絲電流6 mA條件下進行樣品的XPS測試。

1.3.2.4 傅立葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)分析

取2.0 mg樣品與KBr粉末以質量比1∶100的比例混合,研磨均勻后壓片至透明薄片,在掃描波長為4 000～400 cm-1的條件進行檢測。

1.3.3 劃痕試驗檢測Hela細胞的愈合能力[19]

Hela細胞按2×105個/孔接種于24孔板,待細胞融合度達到90%以上時,用10 μL槍頭于孔板中央做垂直劃痕,再用PBS清洗3遍除去劃下的懸浮細胞,然后,實驗組每孔分別加入1 mL 20 μg/mL CS、SeNPS和SeCS的無血清培養基;空白對照組加入1 mL的無血清培養基。將處理后的細胞放入培養箱(37 ℃、5% CO2)中繼續培養,在劃痕后0、24、48 h對劃痕區域隨機選擇5個點進行拍照,用Image J軟件計算劃痕愈合率。愈合率的計算如公式(1)所示:

1.3.4 Transwell小室檢測Hela細胞的遷移能力

采用20 μg/mL CS、SeNPs和SeCS分別處理Hela細胞48 h,然后,細胞經消化、離心和無血清培養基重懸細胞后,以5×105個/孔的細胞密度接種于Transwell上室,每孔200 μL,下室中加入600 μL含20%(體積分數)血清的培養基。然后,Transwell小室放入培養箱(37 ℃、5% CO2)中培養48 h,取出上室經PBS反復潤洗后,加入4%多聚甲醛固定30 min,結晶紫染色5 min,用棉簽蘸取PBS擦去上室內未遷移的細胞,隨機選取5個視野(200×)觀察并計數穿越小室的細胞數目。遷移率的計算如公式(2)所示:

1.3.5 Transwell小室檢測Hela細胞的侵襲能力[20]

將Matrigel基質膠涂在Transwell小室上,置于培養箱(37 ℃、5% CO2)固化1 h。采用20 μg/mL CS、SeNPs和SeCS分別處理Hela細胞48 h,然后,細胞經消化、離心和無血清培養基重懸細胞后,以5×105個/孔的細胞密度接種于Transwell上室,每孔200 μL,下室中加入600 μL含20%血清的培養基。然后,Transwell小室放入培養箱(37 ℃、5% CO2)中培養48 h,取出上室經PBS反復潤洗后,加入4%多聚甲醛固定30 min,結晶紫染色5 min,用棉簽蘸取PBS擦去上室內未遷移的細胞,隨機選取5個視野(200×)觀察并計數穿越小室的細胞數目。侵襲率的計算如公式(3)所示:

1.3.6 Western blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

20 μg/mL CS、SeNPs和SeCS分別處理Hela細胞48 h,經胰酶消化后,加入RIPA裂解液提取蛋白,用BCA試劑盒測定樣品的蛋白濃度。樣品經SDS-PAGE垂直板電泳后,電轉至PVDF膜上。PVDF膜經封閉液封閉1 h后,加入一抗置于4 ℃下過夜孵育。然后,將PVDF膜放入對應的二抗中孵育2 h,經TBST洗膜3次后,采用ECL對膜進行顯色,用化學發光成像儀進行拍照,計算機掃描并分析實驗結果。

1.3.7 數據統計與分析

每次實驗重復3次,實驗數據均以平均值±標準差表示。實驗結果采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析,采用單因素方差分析方法分析實驗數據。

2 結果與分析

2.1 TEM觀察SeCS的形態和大小

采用TEM對SeCS和SeNPs的形態和尺寸進行表征。實驗結果如圖1所示。由圖1-a和圖1-c可知,SeNPs嚴重聚集形成大顆粒,表明SeNPs極不穩定。由圖1-b和圖1-d可知,SeCS為尺寸相對較小的單分散且均勻的球形顆粒,表明SeNPs經CS修飾后能夠阻止SeNPs顆粒的聚集從而起到分散和穩定SeNPs的作用。此外,由圖1可知,SeCS的粒徑明顯小于SeNPs。

a,c-SeNPs;b,d-SeCS圖1 SeNPs和SeCS的透射電鏡圖Fig.1 TEM of SeNPs and SeCS

2.2 SEM觀察SeCS的表面形貌

采用SEM對SeCS的表面形貌進行檢測,實驗結果如圖2所示。由圖2-a和圖2-c可知,SeNPs易聚集,形成拐棗形狀的聚集體。而SeNPs經CS修飾形成SeCS后,形成大小均一的球形顆粒,說明CS可有效防止SeNPs的團聚沉淀(圖2-b、圖2-d)。

a,c-SeNPs; b,d-SeCS圖2 SeNPs和SeCS的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of SeNPs and SeCS

2.3 XPS測定SeCS的硒價態

采用XPS分析SeCS中硒元素的價態,實驗結果如圖3所示。由圖3-a可知,SeNPs中Se的電子結合能為54.78 eV,根據HAN等[21]報道零價硒的電子結合能位于54.6～57.5 eV可知,該峰為零價硒電子結合能峰位。由圖3-b可知,SeCS中Se的電子結合能峰位為54.58 eV,與SeNPs中Se的電子結合能峰位相近,表明SeCS中的Se也是以零價硒的形式存在。

a-SeNPs; b-SeCS圖3 SeNPs和SeCS的XPS圖Fig.3 XPS diagrams of SeNPs and SeCS

2.4 FTIR測定SeCS的特征基團

采用FTIR技術表征SeCS中CS與SeNPs的結合方式,實驗結果如圖4所示。SeNPs的紅外光譜圖沒有出現明顯的特征吸收峰,這跟前人的報道基本一致[22]。然而,相比SeNPs,SeCS在3 400 cm-1附近有一寬峰,這可能是由于CS中羥基的伸縮振動引起的。此外,在1 620和1 415 cm-1附近出現了CS中乙酰氨基的N-H伸縮振動和羧基的振動,且在1 200～800 cm-1有硫酸基的特征吸收峰[23]。綜上可知,SeCS中存在CS的特征吸收峰,提示CS可能通過吸附作用修飾在SeNPs的表面。

圖4 SeNPs和SeCS的紅外光譜圖Fig.4 FTIR diagrams of SeNPs and SeCS

2.5 劃痕試驗檢測Hela細胞的愈合能力

采用劃痕實驗檢測SeCS對Hela細胞愈合能力的影響。實驗結果如圖5所示。由圖5-a可知,細胞經SeNPs和SeCS分別處理24和48 h后,SeCS處理組中劃痕留下的空隙大于SeNPs,說明SeCS處理后的細胞劃痕愈合的程度弱于SeNPs。而且,當處理時間為48 h時,SeCS處理組中的細胞愈合率僅為(6.85±1.30)%,顯著低于SeNPs處理組中的愈合率(19.06±1.61)%(圖5-b),表明SeCS抑制細胞愈合的能力強于SeNPs。而CS在24 h時沒有表現出明顯的抑制細胞愈合的能力,隨著時間的延長,雖然相比空白對照組,愈合率有所下降,但沒有顯著差異。綜上可知,CS與SeNPs結合形成SeCS后,抑制細胞愈合的能力顯著上升。

a-20 μg/mL CS、SeNPs和SeCS處理0、24、48 h后劃傷Hela 細胞的顯微鏡照片(50×);b-Hela細胞劃痕愈合率柱狀圖圖5 不同處理對Hela細胞愈合能力的影響Fig.5 Effects of different treatments on healing ability of Hela cells 注:與空白對照組相比:*P<0.05,與SeNPs組相比: ##P<0.01(下同)。

2.6 Transwell小室檢測Hela細胞遷移能力

采用Transwell法測定SeCS對Hela細胞遷移能力的影響。實驗結果如圖6所示。由圖6-a可知,細胞經CS和SeNPs處理后,與空白對照組相比,遷移至下室的細胞雖有所減少,但效果不明顯。而SeCS處理細胞后,與CS和SeNPs相比,遷移至下室的細胞明顯減少,細胞聚集的密度顯著降低,表明SeCS使細胞的遷移穿透能力減弱。而且,SeCS處理細胞后,細胞的遷移率為(59.19±7.74)%,顯著低于CS組的遷移率(85.23±4.47)%和SeNPs處理組的遷移率(92.84±9.06)%(圖6-b),表明SeCS抑制細胞遷移的能力強于CS和SeNPs。

a-20 μg/mL CS、SeNPs和SeCS處理48 h后Hela細胞 遷移的顯微照片(200×);b-Hela細胞遷移率柱狀圖圖6 不同處理對Hela細胞遷移能力的影響Fig.6 Effects of different treatments on migration ability of Hela cells

2.7 Transwell小室檢測Hela細胞侵襲能力

采用Transwell法測定SeCS對Hela細胞侵襲能力的影響。實驗結果如圖7所示。由圖7-a可知,細胞經CS和SeNPs處理后,與空白對照組相比,侵襲至下室的細胞雖有所減少,但效果不明顯。而SeCS處理細胞后,與CS和SeNPs相比,侵襲至下室的細胞明顯減少,下室中的侵襲細胞數目越少,說明SeCS使細胞侵襲穿透基質膠的能力減弱。而且,SeCS處理細胞后,細胞的侵襲率為(82.43±4.21)%,顯著低于CS組的侵襲率(103.28±6.14)%和SeNPs處理組的侵襲率(98.75±6.28)%(圖7-b),表明SeCS抑制細胞侵襲的能力強于CS和SeNPs。

a-20 μg/mL CS、SeNPs和SeCS 處理48 h后Hela 細胞侵襲的顯微照片(200×);b-Hela細胞侵襲率柱狀圖圖7 不同處理對Hela細胞侵襲能力的影響Fig.7 Effects of different treatments on invasion ability of Hela cells

2.8 Western blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平

MMP有助于腫瘤細胞的侵襲、血管生成和惡性進展,MMP-2和MMP-9蛋白在人宮頸癌中高表達,可能影響其侵襲性[24-25]。為了進一步探究SeCS抑制Hela細胞遷移和侵襲的可能機制,采用Western blot方法檢測SeCS處理細胞后對細胞內MMP-2和MMP-9蛋白表達量的影響。由圖8-a可知,相比CS和SeNPs處理組,SeCS處理細胞后,MMP-2和MMP-9的蛋白條帶變淡,表明SeCS能夠抑制MMP-2和MMP-9的表達。進一步對其條帶的灰度值進行分析發現,MMP-2和MMP-9的蛋白表達量從SeNPs處理組的(112.69±11.53)%和(89.76±6.35)%下降到SeCS處理組的(75.75±7.32)%和(81.98±7.02)%,說明SeCS顯著下調了MMP-2和MMP-9的表達水平(圖8-b)。

3 結論

本文采用氧化還原法制備SeCS,通過TEM、SEM、XPS和FTIR對其結構進行鑒定,發現成功制備得到的SeCS為零價態的球形納米粒,這一研究結果與其他多糖如石榴多糖[26]、殼聚糖[27]和阿拉伯樹膠[28]修飾納米硒的報道相似。

癌細胞的轉移和侵襲是腫瘤細胞的典型特征。腫瘤轉移是一個涉及細胞遷移、侵襲和黏附的復雜過程[29]。其中,遷移是癌細胞侵襲和轉移的關鍵環節[30]。為了進一步考察SeCS對Hela細胞遷移能力的影響,本文采用劃痕實驗考察了20 μg/mL CS、SeNPs和SeCS處理細胞0、24、48 h后細胞的愈合效果,發現與CS和SeNPs相比,SeCS劃痕愈合速率顯著低于CS和SeNPs,說明SeCS能抑制細胞的橫向遷移。此外,本研究還運用Transwell實驗進一步考察了SeCS抑制Hela細胞縱向遷移的效果,發現相比CS和SeNPs,細胞經SeCS處理后,遷移細胞數目減少,說明SeCS能夠抑制Hela細胞的縱向遷移。而且,通過考察SeCS抑制Hela細胞侵襲的研究也發現,相比CS和SeNPs,SeCS處理后的細胞通過基質膠的能力變弱,說明SeCS能夠抑制Hela細胞的侵襲。這可能是SeCS處理Hela細胞后因不能降解ECM導致其侵襲能力減弱[31-32]。

研究發現,MMPs參與細胞外基質和基底膜的降解,其中,MMP家族成員MMP-2和MMP-9通過降解細胞外基質的主要成分膠原蛋白來參與多種癌細胞的侵襲[33]。為了闡明SeCS抑制Hela細胞遷移和侵襲的可能機制,采用Western blot對SeCS處理細胞后的MMP-2和MMP-9蛋白表達情況進行檢測,結果發現相比SeNPs,SeCS處理組中MMP-2和MMP-9蛋白的表達量更低,這可能是由于SeCS的尺寸小于SeNPs,使得SeCS更容易穿過細胞膜進入細胞,從而提高了細胞內SeCS的含量,增強了SeCS的抗腫瘤活性。同時,值得注意的是,相比空白對照組,CS組中的MMP-2和MMP-9蛋白沒有表現出下調趨勢,這一結果跟Transwell的實驗結果是一致的,說明CS沒有表現出抑制Hela細胞遷移和侵襲的作用。但是,這與前人報道的CS能夠抑制黑色素瘤細胞[17]、肺癌細胞[34]、乳腺癌[35]等細胞增殖和遷移的研究結果不一致,推測可能是CS對不同的腫瘤細胞具有不同的細胞選擇性,此外與CS處理細胞的濃度也密切相關。

綜上所述,本研究制備的SeCS能夠通過下調MMP-2和MMP-9的表達抑制Hela細胞的遷移和侵襲,為其后續的臨床應用奠定理論基礎和數據參考。