乳酸菌發酵乳蛋白水解物對RAW264.7細胞氧化損傷的保護作用

候智興,李恒*,蔣敏,錢建瑛,閆建國,盧儉,許正宏,史勁松*

1(江南大學 生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫,214122)2(寧夏塞尚乳業有限公司,寧夏 銀川,750001) 3(糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)

乳蛋白是牛乳中占比最高的營養組分,是國民健康飲食的重要組成。乳蛋白中豐富的酪蛋白、乳清蛋白等蛋白,是天然功能蛋白的優質來源。研究表明,乳蛋白在抗氧化、免疫調節、緩解疲勞、維持腸道健康[1-2]等方面均具有良好的生理作用。其中,抗氧化能力是各類生物活性的基礎,長期的氧化應激會導致各種威脅生命的病理狀況,例如衰老、心臟病、糖尿病、自身免疫性疾病、癌癥、神經系統疾病等,因此其活性分析可為功能物質的挖掘與功能評價提供參考和遴選依據[3]。

采用生物加工的方法處理乳蛋白有利于功能蛋白/肽的挖掘。研究發現,將蛋白酶酶解乳清分離蛋白添加到酸奶后,可促進酸奶的發酵,提高酸奶的抗氧化活性[4]。除生物酶酶解方法外,采用乳酸菌發酵可促進更高活性的生物活性肽的產生。CHANU等[5]用乳酸菌發酵水牛乳制備得到對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有廣譜抗菌活性的抗菌肽;PADGHAN等[6]用發酵劑結合LactobacillusacidophilusNCDC-15發酵牛乳制備得到抗氧化性顯著高于單獨發酵劑組的抗氧化肽。乳酸菌發酵過程中分泌的多種蛋白酶可以彌補酶法水解中酶類單一的局限,但由于乳酸菌發酵產酸的特性,往往造成蛋白的聚集而影響蛋白酶活性的發揮,蛋白水解并不充分。因此,綜合利用酶解與乳酸菌發酵聯合的方法有利于充分發揮乳酸菌水解蛋白的能力,并促進功能物質的產生以及活性的提升[7]。

本文采用蛋白酶水解聯合乳酸菌發酵的方法,依據體外抗氧化活性篩選可良好發酵乳蛋白水解物(milk protein hydrolysates,MPH)的乳酸菌,并在氧化損傷細胞模型上探討發酵MPH對氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮牛乳蛋白由寧夏塞尚乳業有限公司提供。實驗所用菌株與RAW264.7巨噬細胞均保藏于本實驗室。

堿性蛋白酶,諾維信(中國)生物技術有限公司;四甲基偶氮唑鹽、H2O2、三氟乙酸、乙醇、水楊酸、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、NaCl、MnSO4、MgSO4、吐溫-80等,國藥集團化學試劑有限公司;DPPH、ABTS,上海麥克林生化科技股份有限公司;胎牛血清、DMEM培養基,美國Gibco公司;One step qRT-PCR SYBR 試劑盒,諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

酶標儀,美國Thermo公司;冷凍干燥機,美國LABCONCO公司;Synergy超純水系統,美國Millipore公司;RCT型磁力加熱攪拌器,德國IKA公司;YS100倒置顯微鏡,日本Nikon公司;CFX Connect實時熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司;超濾濃縮儀,德國默克公司;超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋,美國AUTOCLAVE Engineers公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MPH的制備

配制40 g/L的牛乳蛋白水溶液,按3 000 U/g酶底比加入堿性蛋白酶,55 ℃水解3 h,過程中用1 mol/L NaOH水溶液調節pH值,使其維持在8.0。水解完畢后100 ℃加熱10 min。采用分子質量3 000 Da的超濾膜在4 ℃ 下超濾,濾液凍干得到MPH備用。MPH中多肽含量采用雙縮脲法進行測定,以水解后所得多肽質量與初始牛乳蛋白質量的比值計算MPH得率,為78.34%。

1.3.2 乳酸菌發酵MPH

將分離自泡菜的16株乳酸菌在MRS培養基中活化培養3代,每代活化12 h,以2%接種量接種至含MPH的發酵培養基,37 ℃ 發酵48 h。發酵液6 000 r/min 離心20 min,上清液凍干得到不同乳酸菌發酵MPH用于篩選評價。其中,以篩選所得的乳酸菌發酵MPH所得產物命名為FPS。

發酵培養基(g/L):MPH 25、檸檬酸氫二胺2、葡萄糖10、K2HPO42、乙酸鈉3、MgSO40.58、MnSO40.25,100 ℃滅菌10 min。

1.3.3 MPH發酵前后抗氧化活性測定

將發酵前后的MPH樣品分別配制成2、4、6、8、10 mg/mL 溶液。分別測量各樣品對DPPH自由基、·OH、ABTS陽離子自由基的清除能力和鐵離子還原力,采用模糊綜合評價法評價抗氧化能力并依此篩選乳酸菌用于后續評價。以等量去離子水作為對照,每個測試樣品設置3組平行。

1.3.3.1 DPPH自由基清除率的測定

參考KILIC等[8]的方法。配制0.08 mg/mL的DPPH溶液,將該溶液與樣品溶液1∶1(體積比)渦旋混勻,避光孵育30 min后,在517 nm處測量吸光度。DPPH自由基清除率按照公式(1)計算:

式中:E,清除率;A0,對照組吸光值;Ai,待測樣品吸光值。

1.3.3.2 ·OH清除率的測定

參考ZHOU等[9]的方法。將0.2 mL不同濃度的樣品溶液依次與9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 8.8 mmol/L H2O2混合,室溫反應10 min后加入1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液,37 ℃水浴反應30 min后在510 nm處測定吸光值。參照公式(1)計算·OH清除率。

1.3.3.3 ABTS陽離子自由基清除率的測定

參考LI等[10]的方法。將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L K2S2O8以1∶1體積比混合搖勻后室溫避光靜置12 h制得ABTS儲備液;用10 mmol/L pH 7.4的PBS稀釋ABTS儲備液,使其在734 nm下吸光度為0.70±0.05時制得ABTS工作液。取20 μL不同濃度樣品和200 μL ABTS工作液混合搖勻,室溫避光靜置10 min,于734 nm處測定吸光值。參照公式(1)計算ABTS陽離子自由基清除率。

1.3.3.4 鐵離子還原力的測定

參考CHEN等[11]的方法。取 1 mL 不同濃度樣品溶液與2 mL PBS(0.2 mol/L,pH 6.6)、2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀溶液混合,50 ℃反應20 min,冷卻至室溫后加入2.5 mL三氯乙酸溶液(10%,質量分數)混勻,3 000 r/min離心10 min后取2.5 mL上清液,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL FeCl3溶液(0.1%,質量分數)于37 ℃水浴30 min,于700 nm處測定吸光值。

1.3.3.5 抗氧化活性的綜合評價

采用模糊綜合評價法[12]計算和評價樣品抗氧化活性。根據極值標準化公式Zij=(Xij-Xij min)/(Xij max-Xij min),將各抗氧化指標值無量綱化置于閉區間[0,1]中。其中,Xij為第i個菌株發酵MPH的第j個抗氧化指標值,Xij max、Xij min分別為第i個菌株的第j個抗氧化指標的最大值和最小值?？寡趸C合評價值Zi按照公式(2)計算并作為乳酸菌篩選依據。

Zi=Σ(Zij)(i=1,2,…,16;j=1, 2, 3, 4)

(2)

1.3.4 分子質量分布的測定

采用凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)測定樣品分子質量分布。配制溶液V(水)∶V(乙腈)∶V(三氟乙酸)=60∶40∶0.1,加入待測樣本配制成20 mg/mL溶液,10 000 r/min離心10 min后過0.22 μm 濾膜用于測定。

色譜條件:色譜柱TSKgel G2000SWXL,柱溫30 ℃,紫外檢測波長220 nm,流動相為V(水)∶V(乙腈)∶V(三氟乙酸)=60∶40∶0.1,流速0.5 mL/min、進樣量10 μL。

1.3.5 游離氨基酸的測定

取樣品2.0 g,用50 g/L的三氯乙酸于50 mL容量瓶中定容,超聲1 h后抽濾,濾液在10 000 r/min離心30 min,上清液用0.22 μm濾膜過濾,采用HPLC分析游離氨基酸含量。

色譜條件:色譜柱Agilent Hypersil ODS,柱溫40 ℃,紫外檢測波長338 nm,流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(醋酸鈉)=1∶2∶2,流速1.0 mL/min,進樣量10 μL。

1.3.6 FPS對H2O2誘導RAW264.7巨噬細胞氧化損傷的保護作用評價

1.3.6.1 細胞存活率測定

RAW264.7細胞在含10%血清和1% 雙抗的DMEM培養基中,于37 ℃、5% CO2的濕潤環境培養。細胞(1×104個/孔)培養于96孔板中至完全貼壁后,添加不同濃度FPS的新鮮培養基繼續孵育24 h。再次吸去培養基并用pH 7.5的PBS淋洗3遍后,加入含有10% CCK-8溶液的等體積無血清培養基,避光孵育2 h后于450 nm波長下測量吸光值。以不加FPS培養孔作為對照,以無細胞的培養孔為空白組。每組5個平行,根據公式(3)計算細胞存活率。

式中:A1,對照組吸光值;Ai,實驗組吸光值;A0,空白組吸光值。

1.3.6.2 FPS對巨噬細胞RAW264.7氧化損傷的保護作用

取對數生長期的細胞(1×104個/孔)在96孔板中培養24 h后,添加含不同濃度FPS的新鮮培養基。孵育24 h后用PBS洗滌3次,更換含有400 μmol/L H2O2的無血清培養基培養12 h后,加入含有10% CCK-8溶液的等體積無血清培養基,避光孵育2 h后于450 nm測量吸光值。參照公式(3)計算細胞存活率。以不加FPS的培養孔為對照組,無細胞的培養孔為空白組,每組5個平行。

1.3.6.3 FPS對巨噬細胞RAW264.7抗氧化酶基因mRNA水平的影響

將對數生長期的細胞按5×104個/孔接種于6孔板中至完全貼壁,加入不同濃度的FPS培養24 h,PBS洗滌3次。之后除空白組以外,更換為含有400 μmol/L H2O2的無血清培養基培養,培養12 h后用PBS洗滌3次,棄去PBS后轉移至無RNA酶的離心管中,裂解細胞,提取RNA進行PCR反轉錄,所用引物如表1所示。反應體系:200 ng RNA,5 nmol/L上下游引物,1 μL One Step SYBR Green Enzyme Mix,10 μL 2× One Step SYBR Green Mix,并在95 ℃,10 s;60 ℃,30 s條件下運行40個循環。通過RT-PCR系統測定靶基因上調核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)和谷胱甘肽過氧化酶1(glutathione peroxidase 1,GPX1)基因的相對轉錄水平,并用2-(△△CT)方法進行分析。測定的目標基因為每組平行3個復孔,實驗重復3次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數據統計及分析

數據用平均值±標準差表示和單向方差分析法分析,采用Graphpad Prism 9作圖。與對照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌菌種的篩選

從泡菜樣本中分離篩選獲得16株乳酸菌,包括5株副干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacillusparacasei)、3株植物乳植桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)、2株發酵黏液乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)、2株鼠李糖乳酪桿菌(Lacticaseibacillusrhamnosous)、2株谷糠乳桿菌(Lactobacillusfarraginis)、1株瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)和1株嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)。進而對這些菌株發酵MPH的抗氧化能力進行評價。通過測定發酵前后不同樣本對DPPH自由基、·OH、ABTS陽離子自由基清除率及鐵離子還原力,并依據模糊綜合評價法分析計算,結果如表2所示。綜合來看,16株乳酸菌發酵產物對不同自由基清除能力和抗氧化能力有明顯差異,其中,鼠李糖乳酪桿菌(Lacticaseibacillusrhamnosous)ST(LST)發酵產物的抗氧化活性最強,綜合評價值達到3.12,顯著高于其他菌株。因此選定菌株LST發酵產物FPS作為后續評價對象。

表2 乳酸菌發酵MPH的抗氧化能力Table 2 Antioxidant activities of MPH fermented with lactic acid bacteria

2.2 LST發酵產物FPS的抗氧化活性

進一步評估FPS的體外抗氧化能力。如圖1所示,隨著濃度增加,FPS對3種自由基清除率和鐵離子還原力逐漸增加,有良好的劑量依賴關系。與發酵前相比,當FPS質量濃度為10 mg/mL時,DPPH自由基、·OH和ABTS陽離子自由基的清除率分別提高了19.28%、19.21%、20.87%,鐵離子還原力提高了34.38%,均有顯著差異,說明MPH經LST發酵后顯著提高了抗氧化活性。

a-DPPH自由基清除率;b-·OH清除率;c-ABTS陽離子自由基清除率;d-鐵離子還原能力圖1 不同濃度MPH與FPS抗氧化能力的比較Fig.1 Comparison of antioxidant activities of MPH and FPS at different concentrations 注:不同小寫字母表示同一濃度下,MPH與FPS的差異達到顯著水平(P<0.05)。

2.3 MPH與FPS游離氨基酸含量分析

比較MPH與FPS游離氨基酸含量,結果如表3所示。發酵后,游離氨基酸總量由32.6 mg/g 上升至52.7 mg/g;含量最高的Leu由11.1 mg/g增加到16.3 mg/g;Met、Asp和Ala濃度顯著升高,約是發酵前的4～6倍。Trp、Tyr、Met、Asp等是具有較強抗氧化活性的氨基酸種類[13],且大多數抗氧化肽的末端或兩端均含有疏水氨基酸,其含量的增加有利于抗氧化活性的提高[14]。研究發現,給高脂大鼠飼喂Leu可顯著提高大鼠抗氧化能力[15],在酶解南瓜子中發現Trp增加并提高了水解物的抗氧化活性[16];Met對活性氧敏感,通過與活性氧結合使其失活并促進谷胱甘肽的合成發揮抗氧化作用[17]。由此推測,FPS抗氧化性的增加與LST水解乳蛋白釋放游離氨基酸的組成、疏水性以及位置有關,有待進一步分析。

表3 MPH與FPS的游離氨基酸含量 單位:mg/g

2.4 MPH與FPS分子質量變化

如圖2所示,MPH經發酵后,FSP重均分子質量由發酵前425 Da下降至396 Da。具體分析不同分子質量大小的組分分布發現(表4),1 000～180 Da組分比例顯著下降,其中,分子質量500～180 Da的組分減少最為顯著,為7.43%,分子質量<180 Da的組分增加了8.66%。說明LST發酵過程中可將分子質量較小的多肽進一步水解,這也與游離氨基酸含量的增加相吻合。

圖2 MPH與FPS的GPC圖譜Fig.2 GPC profiles of MPH and FPS

表4 MPH與FPS的分子質量分布情況Table 4 Molecular weight distribution of MPH and FPS

2.5 FPS對H2O2誘導RAW 264.7 巨噬細胞氧化損傷的保護作用

2.5.1 FPS對RAW264.7細胞活力的影響

巨噬細胞在宿主免疫過程中發揮重要作用,是多種氧化劑和親電試劑的靶細胞[18],并對活性氧反應敏感[19]。研究采用巨噬細胞RAW264.7建立氧化損傷模型,首先考查FPS對RAW264.7細胞活力的影響。如圖3所示,在質量濃度為50～400 μg/mL時,FPS對細胞活力無顯著影響。因此,后續實驗即在此濃度范圍內考查FPS對細胞氧化應激狀態的影響。

圖3 不同濃度FPS對RAW 264.7細胞活力的影響Fig.3 Effect of FPS concentration on the viability of RAW264.7 cell

2.5.2 FPS對氧化損傷RAW 264.7細胞存活率的影響

進一步在氧化損傷模型中考查FPS對細胞存活率的影響。采用H2O2誘導巨噬細胞RAW264.7建立氧化損傷模型。如圖4所示,經H2O2處理后,模型組細胞存活率為65.79%;給藥FPS后,與模型組相比,細胞存活率隨FPS濃度的增加而增加,并具有良好的劑量依賴性;當FPS質量濃度為400 μg/mL時,細胞存活率上升了31.48%,且與對照組無顯著差異。由此說明,FPS對H2O2誘導的細胞損傷具有良好的保護作用。

圖4 不同濃度 FPS 對氧化損傷RAW 264.7 細胞活力的影響Fig.4 Effect of the concentration of FPS solution on the viability of oxidative-damaged RAW 264.7 cells 注:與對照組相比,#P<0.05,##P<0.01; 與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01(下同)。

2.5.3 FPS對Nrf2、SOD1、HO-1、GPX1基因轉錄水平的影響

在氧化應激下,抗氧化防御系統被激活以清除活性氧。Nrf2是抗氧化防御的重要內源性調節因子,當Nrf2轉位到細胞核中,它會結合到抗氧化反應元件并上調一系列抗氧化酶的表達,包括SOD1、HO-1、GPX1等[20-21]。如圖5所示,在H2O2誘導的RAW264.7 巨噬細胞氧化損傷模型中,Nrf2、SOD1、HO-1、GPX1基因轉錄水平均顯著下降;給藥FPS后,隨劑量的增加,FPS均明顯提高如上抗氧化基因的轉錄水平,當質量濃度為100～400 μg/mL時有顯著差異,且呈劑量依賴關系。結果說明,FPS可顯著促進氧化損傷細胞中抗氧化基因的轉錄,改善氧化應激并發揮保護作用。

a-Nrf2;b-SOD1;c-HO-1;d-GPX1圖5 FPS對氧化損傷RAW 264.7細胞中氧化應激相關基因轉錄水平的影響Fig.5 Effects of FPS on the transcriptional level of the genes for oxidative stress in oxidative-damaged RAW 264.7 cells

3 結論

采用生物酶水解聯合乳酸菌發酵的生物加工方法有助于乳蛋白的進一步水解,促進抗氧化等活性的提升。本研究在利用蛋白酶水解獲得MPH的基礎上,從發酵食品中分離篩選獲得16株乳酸菌,通過綜合評價分析不同乳酸菌發酵MPH產物的體外多種自由基清除能力及鐵離子還原能力,從中篩選獲得一株抗氧化活性較強的鼠李糖乳酪桿菌LST。與發酵前相比,LST發酵MPH所得產物上清液FPS在質量濃度為10 mg/mL時,對DPPH自由基、·OH和ABTS陽離子自由基的清除率分別提高了19.28%、19.21%、20.87%,鐵離子還原力提高了34.38%,具有良好的抗氧化活性。進一步分析FPS的游離氨基酸含量與分子質量分布,發酵后分子質量進一步下降,500～180 Da組分減少7.43%,分子質量<180 Da的組分增加了8.66%,說明LST具有良好的發酵MPH能力,產生的游離氨基酸中,Leu、Met、Asp、Ala、Trp、Tyr等抗氧化與疏水性氨基酸的量顯著增加。FSP不影響RAW264.7細胞增殖,在H2O2誘導的RAW264.7細胞氧化損傷模型中,同時促進Nrf2、SOD1、GPX1、HO-1等抗氧化基因的轉錄,劑量依賴關系良好,從而對細胞氧化損傷進行保護。綜上所述, LST具有良好發酵MPH的能力,且可產生更高的抗氧化活性。后續研究將進一步探討發酵產生的抗氧化乳肽等功能物質,分析其緩解氧化損傷的機理。