5-羥甲基糠醛對秀麗隱桿線蟲影響的量效關系及其機制初探

楚陽陽,張怡琳,游春蘋*

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(光明乳業股份有限公司乳業研究院,上海乳業生物工程技術研究中心, 乳業生物技術國家重點實驗室,上海,200436)

5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF)是一種主要通過還原糖發生美拉德或焦糖化反應生成的呋喃類化合物,常見于含碳水化合物較高的食品和植物中[1]。LEE等[2]對包括蘋果、芒果、荔枝等在內的56種果汁進行檢測,發現所有樣品均含有5-HMF(質量濃度范圍0.08～91.5 mg/L);羅弈皓等[3]對金銀花中5-HMF的含量進行檢測,發現其含量范圍為0.003 3%～0.013 6%;邢倩倩[4]通過高效液相色譜法測得在巴氏殺菌乳和常溫酸奶中羥甲基糠醛含量分別為6.69、747.58 μg/100 g。日常生活中,人體每天通過飲食攝入的5-HMF大約是3.14～68.86 mg[5],其中咖啡和面包占總量的85%,其他重要來源包括酒精飲料、餅干、蜂蜜和巴氏殺菌產品等[6]。由此可見,5-HMF涉及到的食品種類多,含量差異較大。

關于5-HMF的研究和認識主要集中于兩方面。一方面,5-HMF被認為是食物和藥品中的潛在毒性物質,對眼黏膜、上呼吸道黏膜、橫紋肌、內臟和神經系統等有毒副作用[7],并且高劑量5-HMF具有潛在的致癌風險[8]。5-HMF及其2種低聚物(Ⅱ和Ⅲ)被發現能夠以劑量和時間依賴的方式阻斷PC12和HT22細胞在S或G2-M期的增殖,并通過小鼠模型證明了當給藥劑量達到0.15 mg/kg時,低聚物Ⅲ可以誘導青春期小鼠焦慮和抑郁樣行為[9]。另一方面,低劑量5-HMF所具有的抗氧化、改善學習記憶、保護神經細胞等生物活性也受到廣泛關注[10]。顧海等[11]使用10 μmol/L和1 μmol/L的5-HMF作用于H2O2引起的氧化損傷海馬神經細胞,結果顯示5-HMF對神經細胞具有一定的保護作用。ZHAO等[12]發現5-HMF通過清除ABTS陽離子自由基和DPPH自由基表現出抗氧化活性,并以劑量依賴性方式誘導紅細胞溶血現象。因此,研究不同濃度的5-HMF對人體健康的“兩面性”影響及其作用機制具有重要意義。

秀麗隱桿線蟲,是與人類基因高度同源且代謝途徑與人類相似的一種模式生物,是迄今為止發現的唯一一種完成全基因組測序的多細胞生物[13],其研究包括諸多領域,如發育生物學、壽命及衰老研究、神經退行性疾病等。VAN BOXEL等[14]將秀麗隱桿線蟲暴露于微塑料中,在蠕蟲的消化道中發現了微塑料的存在,并且在生殖期間發現了較小微塑料的存在,這表明,微塑料對秀麗隱桿線蟲具有生殖毒性;MARTNEZ-FERNNDEZ等[15]將秀麗隱桿線蟲作為實驗模型,研究發現多巴胺(dopamine, DA)對順鉑誘導的神經毒性對動物運動的影響具有保護作用;也有研究學者將秀麗隱桿線蟲作為實驗模型,研究電離輻射對神經系統的影響[16]。但目前為止關于5-HMF對線蟲毒性機制的研究相對較少,因此,本實驗運用常見模式生物秀麗隱桿線蟲作為研究對象,通過分析不同濃度5-HMF對線蟲壽命、產卵、基礎運動指標以及與胰島素/胰島素樣生長因子信號通路(includinginsulin/insulin-like growth factor, IIS)相關基因的表達情況進行分析,探究5-HMF對于機體的影響及其初步機制,為5-HMF在毒理學領域的進一步深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5-HMF(H106323-250 mg),阿拉丁科技(中國)有限公司;秀麗隱桿線蟲(野生型),OP50菌株,上源生物科技有限公司。

5-氟-2′-脫氧尿嘧啶核苷,Sigma公司;酵母提取物粉、胰蛋白胨,Oxoid公司;細菌蛋白胨,海博生物技術有限公司;NaCl、瓊脂粉、CaCl2、MgSO4、K3PO4、膽固醇、Na2HPO4、KH2PO4、甘油、NaOH、NaClO,國藥集團化學試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設備

16021線蟲培養皿、XSCWP08挑蟲針,上源生物科技有限公司;MS5C磁力攪拌器,JOANLAB公司;XSC-SM1線蟲專用體視顯微鏡,北京學思創生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同濃度5-HMF線蟲培養皿的配制

母液的配制(40 mg/mL):400 mg的5-HMF溶于10 mL的無菌水中,高壓滅菌鍋121 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫,4 ℃冰箱備用。

100 mL NGM、含0.010、0.100、1.000 mg/mL 5-HMF的線蟲生長培養基(nematode growth medium,NGM)(100 mL)的制備:準確稱取NaCl 0.3 g、瓊脂粉2 g和細菌蛋白胨0.25 g,溶于去離子水中(NGM:97 mL,0.010 mg/mL 5-HMF:96.975 mL,0.100 mg/mL 5-HMF:96.75 mL,1.000 mg/mL 5-HMF:94.5 mL),高壓滅菌15 min后,待其冷卻至60 ℃,加入1 mL提前配制好的CaCl2(1 mol/L)和MgSO4(1 mol/L)、2.5 mL K3PO4(1 mol/L pH 6.0)以及0.32 mL膽固醇溶液(5 mg/mL無水乙醇),配制含0.010、0.100、1.000 mg/mL 5-HMF的NGM培養基還需分別加入0.025、0.25、2.5 mL質量濃度為40 mg/mL的5-HMF。將上述試劑混勻,倒入平板,待凝固后,置于室溫2 d,看是否有雜菌污染。置于4 ℃冰箱備用,可保存1個月。

含有5-氟-2′-脫氧尿嘧啶核苷的不同濃度5-HMF線蟲生長培養基(mNGM)的配制:配制方法與上述NGM相似。去離子水添加量有所不同:mNGM:90 mL,0.010 mg/mL 5-HMF:89.975 mL,0.100 mg/mL 5-HMF:89.75 mL,1.000 mg/mL 5-HMF:87.5 mL。最后,分別向不同的培養基中各加入7 mL 5-氟-2′-脫氧尿嘧啶核苷,即可配制成不同濃度的mNGM培養基。

1.3.2 秀麗隱桿線蟲的培養及同期化

秀麗隱桿線蟲復蘇后,轉移至已經滴加大腸桿菌的NGM培養皿中,待線蟲長至產卵期時,參考代亞賢[17]的實驗方法進行同期化實驗。

1.3.3 壽命實驗

采用含有5-氟-2′-脫氧尿嘧啶核苷的培養基進行實驗。參考SAKTHIVEL等[18]的實驗方法,每塊平板挑取20條線蟲,每組5塊平板,20 ℃培養,每天觀察線蟲的生存情況,每天更換平板(目的:減少因后代而產生的的誤差,使線蟲食物充足)。判定線蟲死亡的標準參照ZHANG等[19]的實驗方法。待全部線蟲死亡,則實驗結束。

1.3.4 產卵情況

參照SITIA等[20]的實驗方法,將線蟲同期化培養48 h后,顯微鏡下觀察,選擇生殖口為透明半月形的L4期雌雄同體的線蟲,使用挑針挑取到含有不同濃度5-HMF的NGM平板上,每塊平板挑取3條線蟲,每組5塊平板,20 ℃培養。進行產卵實驗。

每天觀察線蟲產卵情況,將挑至新板的線蟲繼續培養,在顯微鏡下記錄舊板中產卵數量,并計算平均值,此項實驗持續5 d。

1.3.5 基礎運動指標的測定

實驗方法參考李煜等[21]的方法,在壽命實驗的第4、8、12、16、20天分別進行基礎運動指標的測定。每個實驗組選取9條線蟲,放置在顯微鏡下,記錄1 min內線蟲咽泵頻率、頭部擺動、身體彎曲的次數。

1.3.6 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)

1.3.6.1 秀麗隱桿線蟲總RNA的提取

將各組別線蟲用含5-氟-2′-脫氧尿嘧啶核苷的培養基培養至第10天后,按照試劑盒說明進行操作。

1.3.6.2 cDNA合成

按照試劑盒說明進行操作。

1.3.6.3 PCR擴增

按照試劑盒說明進行操作。所用引物序列見表1。其中Actin為內參基因。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數據處理分析

實驗數據使用SPSS單因素方差分析進行多組間的比較,所有結果數據以平均值±標準差表示,P<0.05被認為差異具有統計學意義。GraphPad Prism 8軟件進行作圖,其中不同小寫字母代表有顯著性差異,相同小寫字母代表無顯著性差異(本實驗結果中,與時間相關實驗結果保留小數點后一位,與濃度相關實驗結果,保留小數點后3位)。

2 結果與分析

2.1 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

如圖1及表2所示,低濃度5-HMF作用于線蟲時,會使線蟲的最長壽命(其中最后一條線蟲死亡的時間)從24 d增加至27 d(延長12.5%);平均最長壽命(5個平板中線蟲最長壽命的平均值)從23.3 d增加至25 d(延長7.8%);中位生存時間(線蟲存活剩50%所經歷的時間)由(12.0±2.4) d增加至(14.0±2.6) d(延長16.7%);平均壽命(每個濃度組共100條線蟲的平均存活時間)從12.5 d增加至14.0 d(延長12%)。相反,當5-HMF濃度升高至中高濃度時,會導致實驗組中線蟲的最長壽命分別縮短20.8%和41.7%。結合圖1-c和圖1-d中線蟲的平均最長壽命以及最長壽命擬合曲線可知,當線蟲分別存活23.3、24 d時(5-HMF濃度為0時的存活時間),5-HMF的質量濃度分別為0.035、0.056 mg/mL。由此表明,0.035 mg/mL可作為5-HMF影響線蟲平均最長壽命的臨界濃度值,0.056 mg/mL可作為5-HMF影響線蟲最長壽命的臨界濃度值。

a-壽命生存曲線;b-平均最長壽命;c-平均最長壽命擬合曲線;d-最長壽命擬合曲線圖1 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.1 Effect of different concentrations of 5-HMF on the life span of Caenorhabditis elegans 注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)。

表2 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲中位生存時間,平均壽命以及平均最長壽命的影響Table 2 Effects of different concentrations of 5-HMF on the median survival time, average life span, and average maximum life span of C. elegans

2.2 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲產卵情況的影響

如圖2所示,與對照組相比,低濃度組5-HMF在線蟲的整個產卵周期中,沒有產生顯著影響;而當5-HMF濃度達到中、高濃度組時,線蟲的產卵數量從第1天開始出現顯著下降(P<0.05)。其中,在第1、4、5天時,中高濃度組并無顯著性差異;第2天和第3天時,兩組組間也呈現出顯著性差異(P<0.05)。這表明,中、高濃度的5-HMF會以時間和濃度依賴性的方式顯著減少線蟲的產卵數量。

圖2 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲產卵情況的影響Fig.2 Effect of different concentrations of 5-HMF on egg laying of C. elegans

2.3 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲基礎運動指標的影響

如圖3所示,與對照組相比,低濃度組5-HMF在線蟲的整個生命周期中,對線蟲的咽泵頻率、頭部擺動以及身體彎曲次數并無顯著性影響;中濃度組的5-HMF在本次實驗進行到第12天時,才會顯著性減少線蟲的咽泵頻率、頭部擺動以及身體彎曲的次數;高濃度組的5-HMF在實驗進行到第4天時就已經出現顯著性減少3種基礎運動指標次數的情況。由此可表明,中、高濃度的5-HMF均會以時間和濃度依賴性的方式顯著減少線蟲的咽泵頻率、頭部擺動以及身體彎曲的次數。

a-咽泵頻率;b-頭部擺動;c-身體彎曲圖3 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲咽泵頻率、頭部擺動、身體彎曲的影響Fig.3 Effects of different concentrations of 5-HMF on pharyngeal pump frequency, head swing, and body bending of C. elegans 注:由于中濃度組線蟲在本次實驗第19天就已全部死亡,故在基礎運動指標測定時,第20天并無數據,高濃度組線蟲在 本次實驗第14天就已全部死亡,故在基礎運動指標測定時,第16天以及20天并無數據。

2.4 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲IIS通路相關基因表達的影響

如圖4所示,5-HMF低濃度組中Daf-2基因表達水平顯著降低(P<0.05),中高濃度組中Daf-2基因表達水平顯著上升(P<0.05)。相反,Daf-16、Sod-3、Sir-2.1基因表達量均隨著5-HMF濃度的升高而降低。5-HMF在低濃度時,3組基因表達量均呈顯著性上升(P<0.05),在中高濃度時基因表達量均顯著下降(P<0.05)。由此推測,5-HMF在低濃度時可以抑制IIS信號通路中Daf-2基因的表達,并促進Daf-16、Sod-3、Sir-2.1基因的表達;在高濃度時則完全相反。該結果與秀麗隱桿線蟲壽命實驗結論相呼應。

圖4 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲IIS相關 基因表達水平的影響Fig.4 Effects of different concentrations of 5-HMF on the expression level of IIS related genes in C. elegans

如圖5所示,由基因擬合關系式可知,當基因表達水平為1時(5-HMF濃度為0),5-HMF作用于基因Daf-2,Daf-16,Sod-3以及Sir-2.1的臨界質量濃度分別為0.067、0.067、0.075、0.052 mg/mL。該結果結合2.1節平均最長壽命臨界質量濃度值0.035 mg/mL以及最長壽命臨界質量0.056 mg/mL可知,對于壽命相關基因和壽命表型相關實驗結果的量效關系中,5-HMF的臨界質量濃度均處于0.010～0.100 mg/mL,即5-HMF對壽命有關基因和表型的影響具有較高的吻合度。由此可以初步推斷,當5-HMF質量濃度≤0.010 mg/mL時,可起到延長線蟲壽命的作用,而當5-HMF質量濃度≥0.100 mg/mL時,則會對線蟲壽命有不利影響。

a-Daf-2;b-Daf-16;c-Sod-3;d-Sir-2.1圖5 不同濃度5-HMF對秀麗隱桿線蟲IIS 相關基因表達水平影響的非線性擬合曲線Fig.5 Non-linear fitting curve of effects of different concentrations of 5-HMF on the expression levels of IIS related genes of C. elegans

3 結論

5-HMF作為一種兩面性化合物,對人體既可能產生有益作用,也可能有負面作用。本研究利用與人類基因組高度同源的秀麗隱桿線蟲建立體內實驗模型,通過設置質量濃度梯度(低濃度組:0.010 mg/mL;中濃度組:0.100 mg/mL;高濃度組:1.000 mg/mL)研究5-HMF對秀麗隱桿線蟲壽命、產卵數量、基礎生理指標中3個指標(咽泵頻率、頭部擺動、身體彎曲)以及與壽命相關通路IIS中部分基因(Daf-2、Daf-16、Sod-3和Sir-2.1)表達的影響。

壽命實驗結果發現,低濃度的5-HMF對秀麗隱桿線蟲壽命相關指標沒有顯著損害,反而能夠使其顯著上升。而中高濃度的5-HMF對秀麗隱桿線蟲有顯著的毒性作用,即縮短線蟲壽命。對于線蟲的最長壽命以及平均最長壽命的臨界質量濃度值分別為0.056 mg/mL和0.035 mg/mL。測定線蟲的產卵數量是常用評價外源化合物對秀麗隱桿線蟲生殖毒性的指標之一[26]。本實驗通過統計秀麗隱桿線蟲的產卵數量進而預測5-HMF對線蟲的生殖毒性情況。實驗結果表明,低濃度的5-HMF并不會對線蟲的產卵情況產生影響。相反,中高濃度組5-HMF會顯著性減少線蟲的產卵數量。這一結果提示線蟲的產卵數量會受5-HMF濃度的影響。

測定秀麗隱桿線蟲的運動能力是評定其健康狀況[27]以及反應神經網絡是否完整[28]的常用方法之一,其中身體彎曲被證實與活性氧的產生具有相關性[29]。本實驗通過對3組運動能力指標的測定,可以對線蟲的運動能力水平進行初步分析。結果顯示,與對照組相比,低濃度的5-HMF對線蟲的咽泵頻率、頭部擺動以及身體彎曲次數并無明顯影響;而中、高濃度的5-HMF則會在不同程度上顯著性減少3組運動行為的次數。這些結果提示5-HMF對秀麗隱桿線蟲運動能力的影響與處理時間和濃度相關。

與秀麗隱桿線蟲壽命實驗結果相對應,qRT-PCR實驗結果也顯示出5-HMF以濃度依賴性的方式影響秀麗隱桿線蟲壽命相關通路IIS的部分基因。Daf-2是線蟲胰島素/胰島素樣生長因子1受體的同源蛋白,缺失該基因可使成年線蟲的壽命延長一倍;Daf-16基因同壽命、免疫力密切相關,是一種壽命調控因子,其作為該通路的下游靶器官,可用于調節線蟲的壽命和抗壓性;Sod-3是線蟲體內超氧化物歧化酶家族成員之一,與線蟲過氧化損傷引起的衰老有關;Sir-2.1作為Daf-16的輔助因子,當其過度表達時,可導致線蟲壽命延長[30],而Daf-16可通過調節該通路下游與氧化應激相關的超氧化物歧化酶基因(Sod-3)的表達,保護線蟲免受或減弱氧化應激的損傷,進而提高線蟲抗氧化能力,達到延長壽命的目的。本文結果表明,不同濃度5-HMF可能通過調節壽命途徑中IIS相關基因的表達來延長/縮短線蟲壽命,并且對于不同基因的作用濃度有所區別,其中低濃度5-HMF可以延長線蟲壽命,而中、高濃度5-HMF會加快線蟲死亡時間。根據相關基因和壽命的非線性擬合曲線的結果可初步推斷當5-HMF質量濃度≤0.010 mg/mL時,會對線蟲壽命產生正面影響,當5-HMF質量濃度≥0.100 mg/mL時,則會對線蟲壽命產生負面影響。

綜上所述,5-HMF對秀麗隱桿線蟲的正負向影響與濃度密切相關,不同濃度的5-HMF可能通過調節秀麗隱桿線蟲IIS通路部分基因影響線蟲的壽命,以及通過對產卵數量、基礎運動指標產生影響,改變線蟲的健康狀況。本研究結果可為后續進行有關5-HMF毒理學領域的深入研究提供初步參考,并為5-HMF進一步毒性分析和安全應用提供理論依據。