臭氧氧化在乙醇SBR出水資源化中的應用研究

李子奇,王靚,陳旭升,張宏建,張建華*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

燃料乙醇是一種清潔能源,可以作為化石燃料的替代品,進而降低人們對化石能源的依賴。隨著國內石油需求的增加,以燃料乙醇等替代能源為代表的能源供應多元化戰略已成為中國能源政策的一個方向[1]。我國生物質燃料乙醇主要以玉米、陳化糧和木薯等作為生產原料,以木薯為原料發酵法生產燃料乙醇時,每生產1 t乙醇就會產生8～12 t的廢水,傳統的處理方法將蒸餾廢液經固液分離、厭氧消化后仍難以達到排放標準,目前企業多采用序批式活性污泥法(sequencing batch reactor activated sludge process, SBR)進一步處理廢水,使SBR出水的水質達標后排入污水管網。如何實現廢水綜合利用是燃料乙醇產業面臨的突出問題,而開發燃料乙醇廢水資源化回用技術,實現廢水零排放,不僅能消除廢水的污染問題,還可以降低生產成本[2-3]。對此,研究者們開展了大量工作,ZHANG等[4]利用兩級厭氧處理木薯乙醇生產廢水,使廢水可全部回用到乙醇發酵并在13次回收中穩定運行;YANG等[5]采用離子交換樹脂處理經厭氧-好氧消化后的乙醇廢水,開發了乙醇廢水的新型全回收工藝。但迄今為止,關于SBR出水再利用的研究成果很少。為了實現SBR出水的資源化回用,助力乙醇行業的可持續發展,有必要探索SBR出水經濟高效的資源化回用方法。

O3是一種強氧化劑且制備成本低廉,可以高效氧化降解污水中的各種有害組分[6-7]。由于O3自身穩定性差容易自行分解[8],因此在使用O3處理污水時不會產生殘留問題,被視為一種高性價比的水處理手段。本文采用O3氧化的方式處理SBR出水,并開展乙醇發酵試驗,以期為SBR出水資源化回用于乙醇發酵、實現燃料乙醇清潔生產探索一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

市售安琪耐高溫活性釀酒酵母。

1.1.2 SBR出水

由太倉新太酒精有限公司提供。

1.1.3 培養基

種子培養基(g/L):葡萄糖20,酵母膏8.5,NH4Cl 1.3,MgSO4·7H2O 0.1,CaCl20.06。葡萄糖發酵培養基(g/L):葡萄糖150,蛋白胨5,酵母膏5,尿素0.5,KH2PO41.5,MgSO4·7H2O 0.65。

1.1.4 儀器與設備

BF-CS-310臭氧發生器,廣州百豐環?？萍加邢薰?SBA-40D生物傳感器,山東省科學院生物研究所;ICAP TQ電感耦合等離子體質譜儀,賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SBR出水的O3氧化處理

取250 mL SBR出水于錐形瓶中,以10 g/h通入O3,反應溫度為25 ℃,原始pH。

1.2.2 種子培養

將生長狀況良好的斜面酵母轉接至含有200 mL種子培養基的培養瓶中,30 ℃、200 r/min培養24 h。

1.2.3 乙醇發酵

將體積分數為10%的酵母種子液接種到裝有葡萄糖發酵培養基的250 mL三角瓶中,發酵栓封口,并在發酵栓中加入4%(體積分數)的稀H2SO4,放入恒溫培養箱,30 ℃培養48 h。

1.2.4 釀酒酵母細胞形態觀察

將體積分數為10%的酵母種子液接種到含有100 mg/L NO2-(NaNO2)的葡萄糖發酵培養基中,培養24 h后離心收集細胞,預處理方法參照文獻[9],掃描電子顯微鏡觀察酵母細胞形態。

1.3 分析方法

1.3.1 乙醇含量測定

采用蒸酒法[10]測定乙醇含量。

1.3.2 殘葡萄糖測定

將發酵液離心后取上清液,使用去離子水稀釋100倍,SBA生物傳感器測定葡萄糖含量。

1.3.3 酵母的計數與死亡率測定

美蘭染色后采用血球計數法測定酵母數與死亡率[11]。

1.3.4 無機離子測定

采用電感耦合等離子體質譜儀測定。

1.3.5 轉錄組數據測序

將體積分數為10%的酵母種子液接種到含有100 mg/L NO2-(NaNO2)的葡萄糖發酵培養基中,培養24 h后,離心收集酵母細胞(6 000 r/min,4 ℃,5 min),棄上清液后用預冷的PBS緩沖液洗滌菌體沉淀2次,于-80 ℃冰箱儲存。轉錄組學檢測與分析由武漢華大基因科技股份有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 SBR出水直接回用對乙醇發酵的影響

分別以自來水和SBR出水作為拌料水進行乙醇發酵,以自來水為對照組,發酵時間為48 h。每8 h取樣測定乙醇產量、殘糖與酵母細胞數,評估不同發酵系統的差異。如表1所示,在整個發酵周期中,以SBR出水作為拌料水進行乙醇發酵時,發酵液中乙醇濃度明顯低于對照組,且在16～32 h時差異最明顯。通過對酵母數的統計發現,SBR出水會導致發酵24 h的酵母細胞數減少46.2%。而通過對殘糖含量的分析發現,發酵24 h時殘糖的質量濃度比對照組高52.7%,乙醇產量相比對照組減少了54.8%。表明SBR出水直接回用會降低酵母活力并阻礙生長,抑制乙醇發酵。

表1 SBR出水直接回用對乙醇發酵的影響Table 1 Effect of direct reuse of SBR effluent on ethanol fermentation

2.2 SBR出水O3氧化后回用對乙醇發酵的影響

將O3氧化不同時間(5、10、15、20 min)的SBR出水回用于乙醇發酵,探究O3氧化是否可以解除SBR出水的抑制性。發酵系統的失重源自乙醇發酵途徑CO2的散失,單位時間內發酵系統的失重可以反映酵母的發酵速率[2]。如圖1所示,隨著O3氧化時間的增加,SBR出水的毒性不斷減弱,氧化20 min時,SBR出水回用乙醇發酵,其發酵速率與乙醇產量和對照組無明顯差異,說明O3氧化可在短時間內去除其發酵毒性,實現SBR出水的全回用。

a-失重;b-乙醇產量圖1 SBR出水氧化不同時間后回用對乙醇發酵的影響Fig.1 Effect of reuse of SBR effluent treated by oxidation for different time on ethanol fermentation

2.3 SBR出水中抑制組分探究

SBR出水進行水質分析結果如表2所示,SBR出水呈堿性,水中化學需氧量(chemical oxygen demand, COD)值僅為794.8 mg/L、電導率達到6.36 ms/cm,表明水中有機物濃度較低,但含有濃度較高的無機組分。

表2 SBR出水的水質分析Table 2 Water quality analysis of SBR effluent

對O3氧化20 min后SBR出水中的無機離子進行測定,結果如表3所示,O3氧化后SBR出水中大部分無機離子變化不顯著,只有NO3-濃度顯著升高,而NO2-在短時間內被去除,表明水溶液中NO2-被O3高效地氧化為NO3-,這一實驗現象和NAUMOV等[12]的研究結論基本一致。為檢驗NO2-與NO3-對乙醇發酵的影響,根據SBR出水中NO2-、NO3-的濃度,在去離子水中分別進行外源添加并開展乙醇發酵實驗。結果如圖2所示,NO3-在檢測質量濃度(54.13 mg/L)下對乙醇發酵無顯著影響,即使NO3-質量濃度達到300 mg/L時仍未對發酵產生抑制作用,表明NO3-不是SBR出水中的乙醇發酵抑制物。但在檢測質量濃度(104.83 mg/L)下的NO2-使發酵速率顯著降低,乙醇產量也相應受到抑制,發酵48 h的乙醇產量降低了23%。上述實驗結果表明,NO2-是SBR出水中抑制乙醇發酵的主要物質。

表3 O3氧化前后SBR出水中無機離子Table 3 Inorganic ions concentrations in SBR effluent before and after ozone oxidation

a-失重;b-乙醇產量圖2 NO2-離子與NO3-離子對釀酒酵母乙醇發酵的影響Fig.2 Effects of NO2- and NO3- on ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae

SBR通過在反應器中曝氣、沉降、排放等階段進行周期性的操作,使有機物在反應器內獲得充分的生物降解,能夠有效去除廢水中的COD、生化需氧量(biochemical oxygen demand, BOD),達到水質處理的目的[13]。其中,硝化和反硝化是SBR中最重要的過程之一,受環境變量調控。在有氧環境下,氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌可將污水中的氨氮轉化為亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮,而在無氧或缺氧條件下,反硝化細菌則將亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮還原為氮氧化物或N2。但在實際應用中,受廢水進水量與水質的影響,系統水力負荷會改變硝化與反硝化之間菌群的平衡,在高pH、高水溫、低溶解氧等條件下,使亞硝酸鹽氧化菌受抑制,導致NO2-積累[14-15]。

2.4 NO2-抑制乙醇發酵機理的探究

2.4.1 NO2-對乙醇發酵的影響

為探究NO2-抑制乙醇發酵的機理,以去離子水為對照組,通過在發酵培養基中外源添加不同濃度的NO2-,測定24 h酵母細胞死亡率與細胞數,并在發酵48 h時測定乙醇產量與殘糖含量。結果如圖3所示,NO2-質量濃度為5 mg/L時便對乙醇發酵產生了抑制作用,使發酵24 h時的酵母數降低了31.6%,最終發酵乙醇產量降低了1.7%。隨著NO2-濃度的升高,抑制作用顯著增強,添加15、50、100、300 mg/L NO2-,分別使24 h的酵母數降低了39.2%、46.3%、53.1%與71.1%,最終乙醇產量分別降低了2.9%、11.8%、21.4%與64.8%,大量葡萄糖在發酵液中無法被利用。酵母死亡率也隨NO2-濃度的增加而不斷上升。添加100 mg/L NO2-,此時接近SBR出水中NO2-濃度,酵母死亡率達到17.2%,遠高于對照組中3.5%。說明酵母細胞受到NO2-的脅迫無法正常生長繁殖,導致酵母數顯著減少,死亡率上升,細胞活性被抑制,因此對葡萄糖利用率降低,酵母乙醇發酵受到抑制。

a-死亡率、細胞數;b-乙醇、殘糖質量濃度圖3 NO2-對釀酒酵母乙醇發酵的影響Fig.3 Effect of nitrite on ethanol fermentation by S. cerevisiae

2.4.2 NO2-對酵母細胞形態的影響

利用場發射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscopy, FESEM)觀察自來水、SBR出水、O3氧化20 min后SBR出水與外源添加100 mg/L NO2-去離子水回用乙醇發酵時酵母的細胞形態。結果如圖4所示,以自來水拌料進行乙醇發酵時酵母細胞表面光滑、平整、飽滿(圖4-a);SBR出水直接回用的酵母細胞出現些許空洞、胞間粘連、部分細胞內容物外泄的情況(圖4-b),和NO2-質量濃度為100 mg/L時細胞形態相似(圖4-d);SBR出水經過O3氧化20 min后回用的酵母細胞(圖4-c)與自來水拌料酵母形態一致(圖4-a)。上述實驗結果表明NO2-能夠改變釀酒酵母正常細胞形態,導致細胞死亡和發酵過程受阻,是SBR出水中的主要抑制物,而O3氧化的方法可去除NO2-,避免其對發酵的抑制毒性。

a-自來水;b-SBR出水;c-O3氧化20 min后SBR出水; d-100 mg/L NO2-去離子水圖4 不同處理組中釀酒酵母的FESEM圖Fig.4 FESEM photographs of S. cerevisiae in different groups

2.4.3 NO2-對酵母影響的轉錄組學研究

酵母細胞的生理代謝與其基因的轉錄密切相關。在NO2-脅迫下,酵母細胞生長環境發生了改變。利用轉錄組學分析了NO2-脅迫組與對照組的代謝差異,并篩選|log2FC|≥1且Q<0.05的基因作為差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。結果顯示共檢測出了299個DEGs,包括251個上調DEGs和48個下調DEGs(圖5)。

圖5 DEGs火山圖Fig.5 DEGs volcano map

通過KEGG功能富集分析發現(圖6),NO2-脅迫組上調的部分DEGs富集到了糖酵解途徑。經過NO2-的誘導,催化丙酮酸降解為乙醛和CO2的PDC5(編碼丙酮酸脫羧酶)上調3.65倍。研究表明,乙醛能夠增加酵母對NO2-的相對抗性,這意味著PDC5表達量的提高將促使酵母產生更多的乙醛用以細胞的解毒[16-17]。TDH2基因編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶,可以催化3-磷酸甘油醛轉化為1,3-二磷酸甘油酸[18]。NO2-脅迫組中TDH2基因轉錄上調了2.06倍,這可能是由于NO2-使釀酒酵母中甘油醛-3-磷酸脫氫酶失活,抑制了糖酵解途徑并導致了ATP耗竭[19],釀酒酵母通過上調TDH2的轉錄水平維持了細胞生命活動。

a-上調基因;b-下調基因圖6 DEGs KEGG富集分析Fig.6 KEGG pathway analysis of DEGs

此外,發現磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PPP)中部分DEGs發生下調。PPP是糖代謝的重要途徑,由TKL2編碼的轉酮酶可在PPP和糖酵解之間建立可逆聯系,促進NADPH和5-磷酸核糖的合成用于細胞生長[20]。脅迫組TKL2的轉錄水平顯著下調了1.37倍,意味著NO2-離子的添加可能造成PPP通量減小,5-磷酸核糖與輔因子NADPH的合成減弱,進而影響了細胞正常代謝。三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle, TCA循環)是三大物質轉化的樞紐,是生物體將糖類等物質氧化獲得能量的最有效的途徑[21-22]。其中,用于調節TCA循環速率的關鍵酶異檸檬酸脫氫酶基因(IDH2)與琥珀酸脫氫酶基因(SDH9)在脅迫組轉錄下調,這表明加入NO2-后,TCA循環的通量減小,進而影響了NADH與ATP的合成,抑制了酵母的生命活動。以上結果表明,NO2-脅迫下,釀酒酵母的磷酸戊糖途徑與TCA循環途徑受到了抑制,進而影響了菌體的生長和乙醇的發酵。

3 結論

本研究通過對SBR出水進行水質分析,結合外源添加實驗,確定了NO2-是導致SBR出水無法回用的原因,并揭示了NO2-對酵母細胞的毒性機理,發現 NO2-會破壞正常的酵母細胞形態,使酵母的磷酸戊糖途徑與TCA循環通量減小,從而阻礙細胞生長,抑制乙醇發酵。為實現SBR出水的資源化回用,本文采用O3氧化的方式處理SBR出水,O3在廢水處理領域作為一種常見的處理手段,與離子交換、反滲透膜等廢水處理工藝相比具有成本低廉且綠色無污染等優點,SBR出水中NO2-在氧化作用下被高效轉化為NO3-,而NO3-在300 mg/L時仍不會對酵母產生影響,從而避免了對乙醇發酵的毒性,確定了O3氧化作為一種經濟高效的處理手段可以將SBR出水回用到乙醇生產中,對未來真正實現燃料乙醇產業的無廢清潔生產提供了理論基礎與發展方向。