王鑫,賈學靜,2,汪卓,2,陳建平,2,劉曉菲,2,宋兵兵,2,李瑞,2,鐘賽意,2*
1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋生物制品工程實驗室, 廣東省海洋食品工程技術研究中心,廣東省亞熱帶果蔬加工科技創新中心,廣東 湛江,524008) 2(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,大連工業大學,遼寧 大連,116034)
羅非魚又名非洲鯽魚,原產于非洲。因生長速度快,肉質鮮美,被引入我國大量養殖。我國羅非魚加工產業發達,但在加工過程中,大量的組織被當作下腳料丟棄[1]。這些下腳料中,魚皮因富含膠原蛋白和糖胺聚糖等高附加值產品[2],是提取高附加值生物材料的理想原料[3]。
糖胺聚糖又名黏多糖,是一類由多個二糖結構單元構成的長鏈線性復雜多糖,包括硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate,DS)、透明質酸(hyaluronic acid,HA)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)等[4]。其中魚皮中富含的DS是一種硫酸化糖胺聚糖,主要由N-乙酰半乳糖胺和L-艾杜糖醛酸以β-1,4或β-1,3鍵連接的二糖組成。DS具有傷口修復、抗炎、抗病毒、抗血栓等活性[5],具有廣闊應用前景。商品化DS主要從豬皮、豬腸黏膜、牛皮中獲取,近年,由于陸生動物來源的DS存在瘋牛病、口蹄疫等風險,以魚皮為原料[6]提取的水生動物來源DS受到廣泛關注。
目前,魚皮DS及膠原蛋白的提取通常是分開進行的,提取魚皮DS一般采用堿提取和酶提取等方法。這些方法的提取溫度通常在50 ℃以上,長時間的堿、高溫處理易對膠原蛋白的結構造成破壞[7],不利于膠原蛋白提取,造成資源的浪費。因此,本研究采用在較低溫度下酶提酸促溶的方法對羅非魚皮DS與膠原蛋白進行同時提取,反應條件溫和,避免了高溫、強酸、強堿對DS與膠原蛋白結構的破壞。同時,通過單因素試驗及雙指標響應面法對工藝條件進行優化,使DS得率與膠原蛋白提取率都能達到較高水平,實現羅非魚皮DS及膠原蛋白的同時提取。
羅非魚皮,廣東省湛江市恒誠生物科技有限公司,清洗后-20 ℃保存;木瓜蛋白酶(800 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、胃蛋白酶(3 000 U/mg),上海源葉生物科技有限公司;阿利新藍8GX,美國Sigma公司;硫酸皮膚素標準品、硫酸軟骨素標準品、透明質酸標準品、L-羥脯氨酸標準品,中國藥品生物制品檢定所;SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液,上海碧云天生物技術有限公司;Amberlite FPA98Cl樹脂,陶氏化學公司;NaCl、醋酸等均為分析純,西隴科學股份有限公司。
HH-8CJ恒溫磁力攪拌水浴鍋,常州市金壇友聯儀器研究所;Thermo Lynx 6000高速落地離心機,賽默飛世爾科技有限公司;TU-1901紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;TENSOR 27傅里葉紅外光譜儀,德國Bruker公司;GelDoc XR+凝膠成像系統,美國伯樂公司。
1.3.1 魚皮的預處理
將羅非魚皮洗凈,去除多余的鱗片及魚肉等雜質,魚皮的脫脂參考蔣麗等[8]的方法略作改動,在料液比1∶4(g∶mL)、pH 9、加酶量0.5%、39 ℃條件下用脂肪酶脫脂1 h。再將處理后的魚皮用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h除去雜蛋白及色素, 蒸餾水清洗至中性。剪成約1 cm×1 cm的小塊并經破壁機粉碎備用。
1.3.2 魚皮DS與膠原蛋白的同時提取
經過處理的魚皮加入適量的水進行酶解,酶解結束后加入醋酸調至pH值為3,繼續提取30 min,促進膠原蛋白溶出,最后沸水浴滅酶。8 000 r/min離心20 min取上清液,加入NaCl溶液使濃度為0.9 mol/L,4 ℃鹽析過夜,離心分離得到膠原蛋白沉淀及含DS的上清液。膠原蛋白沉淀用適量0.5 mol/L醋酸溶解,于0.1 mol/L醋酸中透析1 d,再于蒸餾水中透析1 d,每隔6 h換水一次,冷凍干燥得到羅非魚皮膠原蛋白。含DS的上清液濃縮后經3 kDa透析袋脫鹽1 d,pH值調至8,過濾取澄清液,50 ℃下在Amberlite FPA98Cl樹脂柱中吸附上樣,然后用蒸餾水洗至洗脫液接近無色,分別用0.3、0.5 mol/L的NaCl溶液,以1 mL/min的流速依次洗脫,收集0.5 mol/L NaCl溶液洗脫組分,用阿利新藍法檢測管中DS含量,收集含有DS的洗脫液。透析袋透析2 d,冷凍干燥得到羅非魚皮DS。
1.3.3 蛋白酶的篩選
取10 g魚皮,加入300 mL蒸餾水,分別加入5 000 U/g的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、2709堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶,在各自適宜pH下30 ℃酶解24 h。以DS得率及膠原蛋白提取率為指標,篩選出酶解提取最適宜的酶。
1.3.4 單因素試驗
以DS得率及膠原蛋白提取率為指標,加酶量、料液比、提取時間、提取溫度為單因素,探究單因素對同時提取效果的影響。
1.3.5 響應面優化
綜合單因素試驗結果,選取加酶量、提取時間、提取溫度作為影響因素,DS得率及膠原蛋白提取率為響應值,采用 Box-Behnken 實驗設計和響應曲面分析優化同時提取效果。試驗因素及水平如表1所示。
表1 Box-Behnken 實驗因素及水平表Table 1 Factors and levels in response surface design
1.3.6 DS得率的測定
參考張虹等[9]的方法略作改動,取0.1 mL樣液,1.5 mL阿利新藍染液染色10 min,于480 nm處測定吸光度,對照DS標準曲線計算樣液DS含量,如公式(1)所示:
Y1=ρ×V×100/m
(1)
式中:Y1,DS得率,mg/100 g;ρ,DS含量,mg/mL;V,DS樣液體積,mL;100,100 g魚皮;m,魚皮質量,g。
1.3.7 醋酸纖維素薄膜電泳
參考左格格等[10]的方法略作改動,取HA、CS、DS標準品及羅非魚皮DS樣品各5 mg,用蒸餾水配制成5 mg/mL。用點樣器點樣后,在7 mA電流下電泳30 min,阿利新藍染色液染色20 min,最后用2%醋酸水溶液脫色30 min。
1.3.8 膠原蛋白提取率的測定
參照楊碧仙等[11]的方法測定樣品中的羥脯氨酸含量。通過測定膠原蛋白中羥脯氨酸的含量,乘以羥脯氨酸換算系數,就可計算得到膠原蛋白的含量,如公式(2)、公式(3)所示:
m=ρ×C×V×11.1×10-6
(2)
Y2=m1/m2×100
(3)
式中:m,膠原蛋白含量,g;ρ,羥脯氨酸含量,μg/mL;C,稀釋倍數;V,樣品體積,mL;11.1,羥脯氨酸與膠原蛋白的換算系數;Y2,膠原蛋白提取率,%;m1,樣品中膠原蛋白質量,g;m2,羅非魚皮中膠原蛋白總量,g。
1.3.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳
參考CAO等[12]的方法,略作改動。使用分離膠濃度為8%(質量分數),濃縮膠濃度為5%(質量分數)。將羅非魚皮膠原蛋白溶于0.5 mol/L醋酸配制成5 mg/mL的膠原蛋白液,與5×樣品緩沖液混合,100 ℃加熱8 min,4 000 r/min離心5 min,取15 μL上清液上樣。以80 V電壓濃縮20 min,至樣品在濃縮膠中濃縮成一條線后,電壓調為100 V繼續電泳90 min。電泳后用考馬斯亮藍R-250染色凝膠,并用脫色液脫色至分離膠背景無色,進行凝膠成像系統分析。
1.3.10 傅里葉變換紅外光譜掃描
將凍干樣品與干燥的KBr置于瑪瑙研缽中磨成細膩的粉末,裝樣,手動壓片,對樣品在4 000~500 cm-1內進行掃描圖譜,分辨率為2 cm-1。
1.3.11 數據處理
所有實驗均重復3次,結果使用JMP Pro 16軟件進行差異顯著性分析(P<0.05),采用Origin 2021和 Design-Expert 8.0等軟件進行數據統計分析及繪圖。
選取5種蛋白酶,并比較其對同時提取效果的影響,其中木瓜蛋白酶、中性蛋白酶的酶解pH值為7,堿性蛋白酶、胰蛋白酶的酶解pH值為8,胃蛋白酶的酶解pH值為3。如圖1所示,中性蛋白酶對DS的提取效果最好,顯著高于其他4種酶,對膠原蛋白的提取也有較好效果;胃蛋白酶被廣泛應用于膠原蛋白的提取[13],對膠原蛋白的提取效果最好,所得到的羅非魚皮膠原蛋白提取率最高,但其對DS的提取效果較差,綜合考慮選擇中性蛋白酶用于DS與膠原蛋白的同時提取。
1-胃蛋白酶;2-木瓜蛋白酶;3-中性蛋白酶;4-堿性蛋白酶; 5-胰蛋白酶圖1 酶種類對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme species on DS yield and collagen extraction rate 注:圖中小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。
2.2.1 加酶量對同時提取效果的影響
在提取時間24 h、提取溫度30 ℃、料液比1∶30 (g∶mL)的酶解條件下,比較不同加酶量(3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g)對DS得率及膠原蛋白提取率的影響。如圖2所示,隨著加酶量的增加,蛋白酶與魚皮的接觸機會增多,DS得率及膠原蛋白的提取率呈現顯著上升趨勢,在加酶量達到6 000 U/g后,酶與底物的接觸趨于飽和,DS得率的上升趨于平緩,而膠原蛋白的提取率由于過量的酶導致膠原蛋白水解,呈現下降的趨勢。在加酶量為6 000和7 000 U/g時,DS得率及膠原蛋白的提取率變化不顯著,考慮到蛋白酶的過量使用會影響膠原蛋白的純度,本試驗的加酶量選擇為6 000 U/g。
圖2 加酶量對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on DS yield and collagen extraction rate
2.2.2 提取時間對同時提取效果的影響
在加酶量6 000 U/g、提取溫度30 ℃、料液比1∶30(g∶mL)的酶解條件下,比較不同提取時間(8、16、24、32、40 h)對DS得率及膠原蛋白提取率的影響。如圖3所示,提取時間為8~24 h時,由于提取時間較短,酶對蛋白的水解不充分,DS未被完全釋放,隨著提取時間的延長,膠原蛋白非螺旋區被水解,膠原蛋白持續溶出,與DS連接的蛋白充分水解,DS持續釋放,DS得率及膠原蛋白提取率呈顯著上升趨勢,在提取時間為24 h時,DS得率及膠原蛋白提取率均達到最大值,延長提取時間,導致了DS的水解及膠原蛋白的過度酶解,DS得率及膠原蛋白提取率逐漸下降。本試驗的提取時間選擇為24 h。
圖3 提取時間對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on DS yield and collagen extraction rate
2.2.3 提取溫度對同時提取效果的影響
在加酶量6 000 U/g、提取時間24 h、料液比1∶30(g∶mL)的酶解條件下,比較不同提取溫度(10、20、30、40、50 ℃)對DS得率及膠原蛋白提取率的影響。如圖4所示,提取溫度為10~30 ℃時,溫度的升高加速了蛋白酶的酶解反應速率,DS得率顯著上升,30 ℃后,得率上升趨勢減緩;提取溫度為10~20 ℃時,膠原蛋白提取率有顯著增加,在提取溫度為20 ℃時達到提取率最大值,在提取溫度為20~30 ℃時,膠原蛋白提取率略有下降,但變化不明顯,繼續提高溫度,由于過高的溫度導致膠原蛋白變性,無法再通過鹽析進行分離,膠原蛋白提取率有明顯下降。綜合考慮,本試驗的提取溫度在30 ℃為佳。
圖4 提取溫度對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on DS yield and collagen extraction rate
2.2.4 料液比對同時提取效果的影響
在加酶量6 000 U/g、提取時間24 h、提取溫度30 ℃的酶解條件下,比較不同料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)]對DS得率及膠原蛋白提取率的影響(圖5)。
圖5 料液比對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of the liquid ratio on DS yield and collagen extraction rate
如圖5所示,料液比為1∶10~1∶40(g∶mL)時,DS得率及膠原蛋白提取率隨料液比的增大顯著上升,在1∶40(g∶mL)時DS得率及膠原蛋白提取率出現最大值,隨后開始下降。在較低的料液比下,酶解液黏度較大,不利于通過攪拌使蛋白酶與底物充分接觸,但過大的料液比會增加后續分離純化的成本??紤]經濟效益和實驗的實際操作性,本試驗將料液比固定為1∶40(g∶mL)。
2.3.1 響應面試驗設計與結果
根據單因素實驗結果,采用Box-Behnken模型進行二次多元回歸方程設計,進一步優化同時提取工藝。試驗設計及結果如表2所示。
表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results
2.3.2 DS得率的響應面結果分析
由表2中試驗數據得到多元擬合回歸方程加酶量(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為:Y1=124.95-1.80A+4.99B-18.18C+6.42AB+8.59AC+0.37BC-5.25A2-4.37B2-31.47C2
由表3可知,此回歸模型P<0.000 1,模型極顯著。失擬項P=0.469 5>0.05不顯著,表示模型對實驗的擬合度較高?;貧w方程的相關系數R2=0.989 3,校正決定系數R2=0.975 5,變異系數為3.30%<10%,說明羅非魚皮DS的提取實際值和預測值有較好的擬合相關性,試驗的重復性較好。3個因素對羅非魚皮DS得率的影響為C>B>A,其中B、C為極顯著因素,A為不顯著因素。交互項AB、AC極顯著,BC不顯著,二次項C2極顯著,A2、B2顯著,表明這3個單因素對DS得率的影響不是簡單的線性關系,二次項和交互作用均對DS得率有較大影響。
表3 DS得率回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equations with DS yields
2.3.3 膠原蛋白提取率的響應面結果分析
由表2中試驗數據得到多元擬合回歸方程加酶量(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為:Y2=50.79-0.92A-1.60B-18.61C+0.29AB+1.38AC-0.64BC-6.38A2-3.59B2-13.69C2
由表4可知,此回歸模型P<0.000 1,模型極顯著。失擬項P=0.093 4>0.05不顯著,表示模型對實驗的擬合度較高?;貧w方程的相關系數R2=0.994 3,校正決定系數R2=0.987 0,變異系數為4.50%<10%,說明羅非魚皮膠原蛋白的提取實際值和預測值有較好的擬合相關性,試驗的重復性較好。
表4 膠原蛋白提取率回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for regression equation with collagen extraction rate
3個因素對羅非魚皮膠原蛋白提取率的影響為C>B>A,其中C為極顯著因素,B為顯著因素,A為不顯著因素。交互項AB、AC、BC不顯著,二次項C2極顯著,A2、B2顯著,表明這3個單因素之間的交互作用不明顯,對膠原蛋白提取率的影響不是簡單的線性關系。
2.3.4 驗證實驗
通過響應曲面分析得到羅非魚皮DS及膠原蛋白的最佳提取條件為:中性蛋白酶加酶量5 925.36 U/g,提取時間25.79 h,提取溫度28.47 ℃,料液比1∶40(g∶mL),在此條件下,羅非魚皮DS得率為128.99 mg/100 g,膠原蛋白提取率為53.88%??紤]到實際操作的可行性,將提取工藝修改為:中性蛋白酶加酶量5 930 U/g,提取時間25.8 h,提取溫度28.5 ℃,料液比1∶40(g∶mL),在此條件下羅非魚皮DS得率為132.12 mg/100 g(濕重計),膠原蛋白提取率為53.14%,與預測值接近,進一步證明了該模型的可行性。
由于不同的糖胺聚糖之間的電荷密度存在差異,在醋酸纖維素薄膜上的遷移率不同,因此可以通過電泳圖上條帶的分布情況判斷樣品中含有的糖胺聚糖種類。條帶的灰度則可以反映糖胺聚糖的含量,根據條帶的深淺可以初步判斷樣品所含糖胺聚糖的組成。由圖6可知,羅非魚皮DS樣品的遷移率與DS、HA一致,DS顯色條帶下方有較淡條帶,這與SALLES等[14]報道的HS顯色條帶出現位置一致。DS顯色條帶顏色較深,HA、HS顯色條帶較淺,說明羅非魚皮DS樣品的主要成分為DS,還含有少量HA、HS。
圖6 羅非魚皮DS的電泳圖譜Fig.6 The cellulose acetate membrane electrophoresis of DS from tilapia skin
由圖7可知,中性蛋白酶與胃蛋白酶酶解的羅非魚皮膠原蛋白均含2條α鏈(α1與α2)和1條β鏈,可以初步判斷出兩者均為典型的Ⅰ型膠原蛋白[15]。2種膠原蛋白均在相對分子質量為130和110 kDa附近分別出現α1鏈和α2鏈,2條鏈的灰度比接近2∶1,這與Ⅰ型膠原蛋白典型的[α1]2α2結構一致[16]。與胃蛋白酶相比,中性蛋白酶酶解的羅非魚皮膠原蛋白α鏈以下出現的低分子電泳條帶較少,表明中性蛋白酶在酶解過程中對膠原蛋白降解作用較小,對膠原蛋白結構的保留更完整。
1-Marker;2-中性蛋白酶酶解膠原蛋白; 3-胃蛋白酶酶解膠原蛋白圖7 羅非魚皮膠原蛋白的電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE pattern of collagens from tilapia skin
2.6.1 DS紅外光譜掃描分析
圖8 羅非魚皮DS紅外譜圖Fig.8 FTIR spectra of DS from tilapia skin
2.6.2 膠原蛋白紅外光譜掃描分析
圖9 羅非魚皮膠原蛋白紅外譜圖Fig.9 FTIR spectra of collagen from tilapia skin
實驗通過單因素試驗和響應面法優化羅非魚皮DS及膠原蛋白同時提取的工藝,最優的提取工藝為中性蛋白酶加酶量5 930 U/g,提取時間25.8 h,提取溫度28.5 ℃,料液比1∶40(g∶mL),羅非魚皮DS得率可達132.12 mg/100 g(濕重計),膠原蛋白提取率可達53.14%,與預測值接近,說明響應面法建立的模型穩定可靠。醋酸纖維素薄膜電泳結果顯示羅非魚皮DS樣品除含有DS外,還含有少量HA、HS雜質。聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示羅非魚皮膠原蛋白為典型的Ⅰ型膠原蛋白。紅外光譜掃描結果顯示羅非魚皮DS及膠原蛋白的結構完整,其中羅非魚皮DS樣品中還含有其他種類的糖胺聚糖,有待進一步純化。結果表明優化后的同時提取工藝具有較高的可行性,同時提取制備的DS及膠原蛋白具備典型特征,為羅非魚皮DS及膠原蛋白在食品和生物醫藥等領域中的應用提供了一定理論依據。