耐熱嗜酸β-甘露聚糖酶TaMan5A在畢赤酵母中高效表達及酶學性質研究

王家強,鄭鋒振

(浙江樹人學院 生物與環境工程學院,浙江 杭州,310015)

半纖維素是一種復雜的多糖類化合物,主要是由甘露聚糖和木聚糖組成的[1]。被木質纖維素包裹致密的半纖維素難以被降解,限制了木材的強度[2]和硬度,降低了資源的利用率。因此如何提高半纖維素降解效率、改善木質纖維素[3]的結構成為增強木材性能的主要問題。

降解半纖維素的方法有很多[4],使用β-甘露聚糖酶酶解是一種高效、清潔的方法。β-甘露聚糖酶廣泛存在于動物、植物和微生物中,但大部分都來自于微生物[5],青霉屬 (Penicillium)和木霉屬 (Trichoderma)[6]微生物是生產 β-甘露聚糖酶的重要來源,且多數分泌到細胞外。

甘露聚糖酶的耐熱特性使其在飼料工業[7-8]、造紙工業、食品工業[9]中有著廣泛的應用。并且甘露聚糖酶在降解玉米和小麥秸稈廢棄物方面也做出了重要貢獻。目前,焚燒仍是處理秸稈的一種重要的方式[10],但焚燒會產生大量CH4、CO、CO2[11-13],最終會導致溫室效應。2020年秸稈焚燒量已經達到了114.8萬t[13]。而使用酶處理是一種溫和的方式,基本不產生有毒副產物,為實現“碳中和,碳達峰”的國家戰略目標提供了新研究思路。

畢赤酵母(Komagataellaphaffii)作為異源蛋白的表達宿主具有顯著的優點。該系統易于操作,生產成本低廉且與先進的真核表達系統 (如CHO細胞系)高度相似。與大腸細菌相比,K.phaffii表達系統可以對異源蛋白進行正確的折疊并形成二硫鍵,這些特性使該表達系統比細菌更有利于重組表達真核蛋白。同時,K.phaffii將異源蛋白直接分泌到培養基中,且內源蛋白的分泌水平較低,很大程度降低了下游蛋白純化所需成本。此外,線性化的外源DNA通過交叉重組整合到K.phaffii基因組中,產生比較穩定的工程菌株。與Saccharomycescerevisiae不同,K.phaffii將幾乎所有的葡萄糖都轉化為生物質而不轉化為乙醇和有機酸,這使得K.phaffii在有氧條件下可以達到較高的細胞密度[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棘孢木霉(T.asperellum)ND-1源自內蒙古土壤樣品,大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和BL21(DE3)購自北京博邁德基因技術有限公司,畢赤酵母X-33由本實驗室保存。刺槐豆膠(locust bean gum, LBG), 美國Sigma-Aldrich公司。Xmark酶標儀,美國伯樂bio-rad有限公司;DYY-C電泳儀,北京六一生物科技有限公司。

1.2 培養基的配制

BMMY種子培養基:酵母粉10 g,胰蛋白胨20 g,100 mL 1 mol/L的磷酸鈉緩沖液 (pH 6.0),去離子水定容至1 L。使用前加入無菌的100 mL 13.4%酵母基礎氮源培養基和2 mL 0.02%生物素 (配方選自生工生物工程股份有限公司)。BMGY發酵培養基:在BMMY培養基的基礎上,添加甘油10 g。LB培養基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。YPD培養基(g/L):胰蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20。

1.3 TaMan5A基因的克隆與表達

以新鮮菌絲為材料,利用試劑盒QIAGEN提取T.asperellumND-1基因組,具體操作參考說明書。不同種類的微生物具有不同的密碼子偏愛性,密碼子的優化能夠進一步提高重組蛋白在K.phaffii中的表達水平[15]。將TaMan5A送至北京擎科生物科技股份有限公司進行密碼子優化,有效提高甘露聚糖酶TaMan5A在畢赤酵母中表達水平。

1.4 TaMan5A酶活力測定

用50 mmol/L,pH 4.0乙酸鈉緩沖液配制5 g/L LBG溶液,將50 μL酶液與450 μL LBG混勻,65 ℃反應10 min,加入750 μL DNS,沸水浴5 min,測定OD540值。以緩沖液反應體系為空白對照,參考甘露糖標準曲線計算酶活力。上述條件下,將1 min內水解LBG產生1 μmol甘露糖所需的酶量作為一個酶活力單位。

1.5 TaMan5A酶學性質

1.5.1 最適pH及其穩定性

最適pH:配制50 mmol/L pH 2.0～8.0的緩沖液各100 mL[16],并用不同pH緩沖液配制底物,稀釋酶液,測定不同pH條件下的酶活性,將最大酶活力作為100%。

pH穩定性:將用不同pH緩沖液稀釋了100倍的酶液放入4 ℃冰箱中,孵育1 h,重復測定最適pH的實驗步驟。以未孵育酶液測得的酶活力為100%。

1.5.2 最適溫度及其穩定性

最適溫度:設定了7個溫度梯度(20～80 ℃),用50 mmol/L pH 4.0的醋酸鈉緩沖液溶解底物并稀釋酶液。設定最大酶活力為100%,分別測定不同溫度下的酶活性。

溫度穩定性:將稀釋100倍的酶液在不同溫度下孵育30 min。以未孵育的酶液測得的酶活力作為100%,分別測定不同溫度下的酶活性。

1.5.3 乙醇和NaCl濃度變化對TaMan5A酶活性的影響

在2 mL離心管內分別加入2.5%、5%、10%、20%(體積分數)的乙醇和稀釋了10倍的酶液,在另外的2 mL離心管內分別加入50、100、150 g/L的NaCl溶液和稀釋了10倍的酶液,同放入4 ℃冰箱內孵育1 h,將未加乙醇和NaCl溶液的純酶液組所測得的酶活力作為100%,測定不同乙醇和NaCl濃度處理組別的相對酶活力。

1.5.4 金屬離子對TaMan5A酶活性的影響

用50 mmol/L pH 4.0的醋酸鈉緩沖液稀釋金屬離子溶液和酶液,使得金屬離子終濃度分別為1、5 mmol/L。將酶與金屬混合液放入4 ℃冰箱內孵育1 h,將未加金屬離子的酶液組所對應的酶活力作為100%,測定不同濃度金屬離子處理酶液的相對酶活力。

1.6 曲面優化

1.6.1 單因素試驗

以溫度50 ℃、pH 4.0、玉米秸稈用量0.25 g、TaMan5A用量0.2 g、纖維素酶用量0.3 g、水解2 d為基礎組合條件。首先采用單因素的方法優化秸稈降解效率,依次對pH值(2.0～8.0),玉米秸稈用量 (0.1～0.75 g),TaMan5A用量 (0.1～0.5 g),時間(1～3 d)進行優化,每次均以最佳條件作為定量值,以需優化單因素作為變量,獲得單因素最佳優化條件。設計方案如表1。

表1 實驗因素水平分析Table 1 Analysis of experimental factor levels

1.6.2 曲面優化

在優化單因素結果的基礎上,以pH、玉米秸稈用量、TaMan5A用量、時間為自變量,以OD值為響應量對秸稈的降解效率進行優化。實驗優化結果見表2。

表2 響應曲面設計方案及實驗結果Table 2 Response surface design scheme and experimental results

1.7 實驗數據的處理

酶學性質測定均作了2次重復,并設定了空白對照,采用Origin 2017對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 甘露聚糖酶基因TaMan5A的克隆

基于前期基因組測序信息,課題組從T.asperellumND-1基因組中篩選了一個GH5家族的甘露聚糖酶基因TaMan5A,根據酵母密碼子偏愛性,將甘露聚糖酶基因TaMan5A進行優化合成,并將其連在 pPICZαA表達質粒上,命名為pPICZα-TaMan5A。利用限制性內切酶SacI對質粒pPICZα-TaMan5A進行線性化, 濃縮之后電轉入K.phaffii中, 并在含有100 μg/mL Zeocin抗性的YPDS平板上進行培養和純化。重組菌株命名為TaMan5A-X33。利用引物 (AOX-F:GACTGGTTCCAATTGACAAGC,AOX-R:GCAAATGGCATTCTGACATCC)對其進行PCR驗證。由圖1對比DNA marker可得,該基因的長度為941 bp;且3和4泳道上均得到了很亮的PCR擴增條帶,說明2個工程菌均為真陽性。故本實驗得到的K.phaffii重組子為陽性克隆。

M-DNA marker;1-負對照;2-正對照;3,4-構建的工程菌株圖1 PCR驗證K.phaffii重組Fig.1 PCR verification of K.phaffii recombination

2.2 誘導表達

將成功設計的K.phaffii重組菌株 TaMan5A-X33在含Zeocin抗性的YPD平板上進行劃線。28 ℃, 200 r/min培養, 利用1%的甲醇誘導132 h后, 收集上清液。利用SDS-PAGE對蛋白表達水平進行分析,得到一條分子質量約為67 kDa的蛋白條帶(圖2), 與分子質量的理論值相一致。隨著誘導時間的延長, TaMan5A的表達量逐漸增多,說明TaMan5A在X-33中表達成功, 且蛋白純度較高, 可直接進行后續的酶學性質研究。

M-標準蛋白分子質量marker;1-0 h;2-24 h; 3-48 h;4-72 h;5-96 h;6-120 h圖2 TaMan5A 0～120 h搖瓶誘導表達Fig.2 Induced expression of TaMan5A in shake flasks from 0 to 120 hours

2.3 TaMan5A酶學性質的分析

2.3.1 最適pH及其穩定性

離心獲得的上清液即為實驗測定酶液TaMan5A,如圖3-a所示,在pH 2.0～8.0,酶活力呈現先上升后下降的趨勢,相對酶活力都高于35%,pH 4.0條件下測得最高酶活力,pH 5.0～8.0的條件下,酶活力不斷下降,是一類中性嗜酸酶。來源不同的甘露聚糖酶pH偏好不同,從枯草桿菌YZ-21中克隆出的甘露聚糖酶,其最適pH值為7.0,是一種pH中性酶[17]。如圖3-b所示,pH 2.0～6.0的范圍內殘留酶活力都在80%以上,TaMan5A在該pH條件范圍內穩定性高。pH>6.0時,殘留酶活力下降明顯,穩定性降低,但最低剩余酶活力也在43%以上。表明TaMan5A有較強的pH穩定性。

a-最適pH;b-pH穩定性圖3 TaMan5A的最適pH 及pH穩定性Fig.3 Optimal pH and pH stability of TaMan5A

2.3.2 最適溫度及其穩定性

如圖4-a所示,在20～65 ℃時,隨著溫度升高,酶活力不斷提升,20 ℃下,酶活力達到56%,在65 ℃下,酶活力最高,70 ℃～80 ℃時,酶活力下降明顯,但80 ℃下仍有57%的剩余酶活力。從地衣芽孢桿菌KD-1中克隆出來的甘露聚糖酶的最適溫度為60 ℃,2種酶都具有嗜高溫屬性[18]。如圖4-b所示,該酶在20～60 ℃內相對穩定。高于60 ℃,相對酶活力略有下降,在80 ℃仍有75%的剩余酶活力?？芍?TaMan5A具有耐高溫,溫度穩定性強的特質。

2.3.3 乙醇和NaCl濃度變化對TaMan5A的影響

如圖5-a所示,各乙醇濃度下的相對酶活力都略有下降,但最低也能夠達到90%。如圖5-b所示,50 g/L NaCl條件下,酶活力提升了8%,對酶活力起促進作用。100、150 g/L NaCl條件下,相對酶活力都有所下降,對酶活力起抑制作用。但最低酶活力也能達到94%,表明TaMan5A對乙醇和NaCl有較好的耐受力。

a-最適溫度;b-溫度穩定性圖4 TaMan5A的最適溫度及溫度穩定性Fig.4 Optimal temperature and temperature stability of TaMan5A

a-乙醇體積分數;b-NaCl質量濃度圖5 乙醇及NaCl濃度對TaManA的影響Fig.5 Effect of changes in ethanol and NaCl concentration on TaMan5A

2.3.4 金屬離子對TaMan5A的影響

如圖6-a所示,與對照相比,1 mmol/L的Co2+、脲使酶活力有所提升,Co2+使酶活力提高了18%,促進效果最明顯。Cu2+使酶活力降低了30%,抑制效果最強。如圖6-b所示,5 mmol的SDS、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Co2+、Ni+均使酶活力有所提升,其中在Fe2+、Co2+使酶活力分別提升了17%和15%,促進效果最明顯。Mg2+、脲、Pb2+條件下,相對酶活力只有49%、55%和68%,對酶活力抑制能力強。

2.4 優化協同降解效率

2.4.1 單因素試驗

OD540值反映了秸稈協同降解效果,OD540值越高,秸稈降解效率越高。由圖7-a所示,水解2 d,OD540值最高,是其最佳反應時間。在最優時間下,測定最適pH值(圖7-b),pH 4.0時OD540值最高,在pH=2.0或8.0時,秸稈幾乎不被降解。在已知的最優條件下,測定玉米秸稈量對降解效果的影響 (圖7-c),0.5 g秸稈時OD540值最高,是最佳秸稈用量。最后,測定最適TaMan5A用量 (圖7-d),添加0.5 g TaMan5A時OD540值最高。在邵麗杰等[19]的單因素優化實驗中,pH 4.8,溫度51 ℃,水解56 h時有最高降解效率,與本實驗最優基礎條件相似。其最適半纖維素添加量為0.004 g/mL,本實驗最佳添加量為0.05 g/mL,TaMan5A降解秸稈能力仍需優化。

a-1 mmol/L金屬離子;b-5 mmol/L金屬離子圖6 1 mmol/L 及5 mmol/L金屬離子對TaMan5A的影響Fig.6 Effect of metal ions 1 mmol/L and 5 mmol/L on TaMan5A

a-時間;b-pH值;c-秸稈用量;d-TaMan5A用量圖7 時間、pH、秸稈用量及TaMan5A用量單因素試驗Fig.7 Results of single-factor determinations with respect to degradation time, pH, corn stover amount, and TaMan5A amount

2.4.2 曲面優化

通過最小二乘法回歸方程式分析得到時間、pH、秸稈用量、TaMan5A用量的二次多項回歸模型:OD=0.804 3+0.027 1A-0.030 7B+0.319 6C+0.191 8D-0.002 0AB-0.006 2AC-0.037 5AD-0.025 5BC-0.015 0BD+0.021 0CD-0.031 9A2-0.275 3B2-0.090 9C2-0.057 3D2,對該模型進行方差分析,由表3可知,模型的P<0.01,說明實驗模型極顯著;缺乏擬合項(P=0.303 6>0.05),決定系數R2=94.38%,該回歸方程的擬合度良好,模型成立。方程一次項中C、D(P<0.000 1)極其顯著,底物量、TaMan5A用量對秸稈降解效率有很大影響,根據F值大小可以判斷本實驗所采用的4個因素對秸稈降解效率影響的主次順序為 (秸稈用量>TaMan5A用量>pH>時間),二次項B2極顯著 (P<0.01),pH的二次效應在實驗中具有一定重要性。

由表3和圖8分析可得出時間、秸稈用量、TaMan5A用量,pH值的P值都大于0.01,交互都不顯著,表明因素間是獨立的。其中底物用量和TaMan5A用量的F值分別為115.96和41.78,P值都小于0.01, 在提高秸稈講解效率的過程中發揮著重要著作用。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

3 結論與討論

TaMan5A基因是從T.asperellumND-1中首次克隆出來,并在K.phaffii中成功表達的。其最適pH值和溫度分別是4.0、65 ℃,是一種耐酸、耐高溫的酶。且該酶對堿性條件也要一定的耐受力,在pH=7.0時,仍有48%酶活力,有較寬pH生長范圍。在1 mmol/L的情況下,Co2+、脲,能提高TaMan5A的酶活力。在5 mmol/L的情況下,SDS、Zn2+、Fe2+等多種金屬離子都對TaMan5A有激活作用。在秸稈降解過程中,秸稈用量和TaMan5A用量對降解效率影響最大。課題組從T.asperellum中克隆出來的TaMan5a,與李珊珊等[20]從黑曲霉克隆出來的甘露聚糖酶有很大的相似性,最適pH值同為4.0,耐酸。2種甘露聚糖酶同耐高溫,最適溫度都在65 ℃以上。研究以新選育的T.asperellumND-1為出發菌株,篩選出了TaMan5A,同時探討了其功能作用及高效表達模式,可為相關研究提供參考。

a-pH值與時間交互;b-TaMan5A用量與pH值交互; c- TaMan5A用量與時間交互;d-秸稈用量與時間交互; e-秸稈用量與pH值交互;f-秸稈用量與TaMan5A用量交互圖8 兩因素交叉作用對響應值的影響Fig.8 Response surface diagram of the effect of the intersection of two factors on the response value