天然低共熔溶劑提取柑橘籽類檸檬苦素的工藝優化

王夜梅,李江南,尹會平,張耀海,蘇學素,焦必寧*

1(西南大學柑桔研究所,農業農村部柑桔產品質量安全風險評估實驗室(重慶),農業農村部柑桔及苗木質量監督 檢驗測試中心,重慶,400712)2(西南大學 化學化工學院,重慶,400715)

柑橘(CitrusreticulataBlanco.)為蕓香科柑橘屬植物,是全世界種植的最重要水果作物之一,每年全世界柑橘類水果廢棄物的數量幾乎占新鮮水果的一半,對環境造成了嚴重污染[1]。柑橘富含類黃酮、類檸檬苦素、生物堿等生物活性物質,其中類檸檬苦素是柑橘類水果廢物(種子、果皮為主)的重要成分。檸檬苦素、諾米林和黃柏酮是柑橘類檸檬苦素的3種主要苷元[2]?，F代研究表明,檸檬苦素具有消炎、抗病毒、抗癌、抗氧化作用,諾米林和黃柏酮在癌癥和病毒的治療中也表現出重要作用[2-3]。

目前,檸檬苦素類化合物主要采用液-固萃取[4-5]、超聲輔助萃取[6-7]和微波輔助萃取[8-9]進行提取,在這個過程中會使用有機溶劑(例如甲醇、丙酮和二氯甲烷),這些試劑具有易揮發、易燃、有毒對環境和人體健康有害等缺點[10]。自ABBOTT等[11]發現季銨鹽和酰胺在低溫下能形成透明均勻的液體,首次提出了共晶溶劑的概念。作為綠色可持續溶劑,天然低共熔溶劑(natural deep eutectic solvents,NADESs)是在深共熔溶劑(deep eutectic solvents,DESs)之后出現的,氫鍵受體(hydrogen-bond acceptor, HBA)和氫鍵供體(hydrogen-bond donor, HBD)主要通過分子間氫鍵結合,通過調節HBAs與HBDs的類型和摩爾比,可以獲得不同理化性質的NADESs[12]。NADESs的熔點極低,具有綠色、無毒、生物降解性好等優點,克服了傳統有機溶劑易揮發、毒性大的缺點[13-14]。因此NADESs在天然成分提取中的應用越來越多,例如提取酚類[15]、黃酮類[16]、生物堿[17]、多糖[18]和植物色素[19]等物質,其中以氯化膽堿為氫鍵受體的研究較多[20]。

本研究采用超聲輔助提取法提取柑橘籽中的檸檬苦素類化合物,共制備了13種NADESs,篩選出最佳提取溶劑。采用響應面法對液固比、含水量、提取時間和提取溫度進行優化,得到最佳提取工藝,旨在建立一種綠色環保的類檸檬苦素的提取方法,為柑橘類水果廢棄物的開發利用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

柑橘籽,實驗室自制;檸檬苦素、諾米林和黃柏酮標準品(HPLC≥98%),上海源葉生物科技有限公司;尼羅紅,上海麥克林生化科技有限公司;用于制備NADESs的試劑包括氯化膽堿(ChCl,98%)、檸檬酸(Ca,≥99.5%)、DL-乳酸(La,85%～90%)、二氯乙酸(Bca,95%),上海麥克林生化科技有限公司;丙二酸、DL-酒石酸、蔗糖、葡萄糖為分析純,成都市科隆化學品有限公司;乙二醇、丙三醇、脲素、甲酸、無水乙醇為分析純,重慶川東化工(集團)有限公司;1,2-丙二醇,國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、乙腈(HPLC),上海星可高純溶劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Milli-Q AdvantageA10超純水系統,美國Millipore;NDJ-5S數字顯示黏度計,中國LICHEN-BX有限公司;S230 Seven Compact電導率儀,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PHSJ-3F雷磁pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;cary50紫外分光光度計,美國Agilent公司;SB5200D型超聲波清洗器,寧波新芝儀器公司;UPLC色譜儀(2996PDA檢測器),美國Waters公司;IECCL31R臺式冷凍離心機,德國Thermo Fisher公司;SZCL智能型數字式恒溫加熱磁力攪拌器,鄭州科泰有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預處理

收集實驗室廢棄柑橘籽,洗凈后,45 ℃熱風風干,粉碎后過40目篩,然后加入4倍體積石油醚,常溫振蕩2次,每次10 h,除去石油醚后,放置通風櫥揮發至無醚味,獲得脫脂柑橘種籽粉末,密封保存備用。

1.3.2 天然低共熔溶劑的制備

根據摩爾比,將氫鍵受體與氫鍵供體混合,在60～80 ℃加熱攪拌制備13種不同的NADESs,詳見表1。

表1 NADESs 的組成Table 1 Composition of the NADESs

1.3.3 天然低共熔溶劑的理化性質

1.3.3.1 極性測定

參照伏琳玥等[21]的方法,使用尼羅紅染料作為溶劑顯色探針,添加到NADESs中,在400～800 nm波長下光譜掃描,記錄最大吸收波長,尼羅紅極性參數ENR計算見公式(1):

式中:ENR,尼羅紅極性參數,kcal/mol;h,普朗克常數;c,真空光速,m/s;NA,阿伏加德羅常數;λmax,最大紫外吸收波長。

1.3.3.2 黏度測定

黏度測試在室溫下使用數字黏度計進行。所需的轉子為1#、2#、3#和4#,在6、12、30、60 r/min下測量,測量值和滿值之間的百分比值為15%～85%,確保精確度。

1.3.3.3 pH和電導率測定

使用pH計在室溫下檢測NADESs的pH。

電導率儀首先用0.000 56 mol/L KCl溶液在室溫下進行校準,所有后續測試在室溫下進行。

1.3.4 檸檬苦素類化合物的提取

采用超聲波輔助提取法提取柑橘籽中的檸檬苦素類化合物。具體操作方法如下:稱取脫脂柑橘種籽粉末0.5 g,在離心管中加入5 mL NADESs(30%含水量,體積分數),在50 ℃下超聲波提取30 min(功率200 W,頻率40 kHz)。提取后,將混合物以8 000 r/min離心8 min,在HPLC分析之前,用甲醇將上清液進行稀釋定量,每組實驗重復3次。

作為對照樣品,用體積分數80%乙醇溶劑按以上述操作方法提取檸檬苦素類化合物。其得率按公式(2)計算:

式中:ρ,NADESs待測液中檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的質量濃度,mg/mL;V,樣品體積,mL;N,稀釋倍數;m,稱取脫脂柑橘種籽粉末質量,g。

1.3.5 類檸檬苦素含量測定

參照孟鵬等[22]的超高效液相色譜方法并作適當修改。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);洗脫程序:進樣量3 μL;柱溫35 ℃;流速0.3 mL/min;檢測波長210 nm;流動相為V(乙腈)∶V(水) =40∶60。

標準曲線的繪制:檸檬苦素、諾米林和黃柏酮用純甲醇定容至10 mL,制得母液,然后稀釋為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L一系列混標,繪制標準曲線,試驗結果見表2。

表2 檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的標準曲線和線性范圍Table 2 Standard curve and linear range of limonin, nomilin and phellodendron ketone

1.3.6 單因素試驗

從1.3.4節提取結果中篩選出類檸檬苦素得率最高的NADES組合,分別以選取的NADES摩爾比(2∶1、1∶1、1∶3、1∶4、1∶5)、含水量(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、液固比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL∶1g)]、提取時間(10、20、30、50、60 min)及提取溫度(20、30、40、50、60 ℃) 為變量進行單因素試驗。

1.3.7 響應面優化實驗設計

依據Box-Behnken實驗設計原則,同時結合單因素試驗結果,選取4個因素:(A)含水量、(B)液固比、(C)提取時間和(D)提取溫度,各取3個水平分別記為水平-1、0、1,進行響應曲面分析試驗,響應面實驗因素與水平設計見表3。

表3 響應面實驗因素與水平設計Table 3 Response surface experimental factors and level design

1.4 數據分析

所有數據點均為重復3次實驗的“平均值±標準偏差”。數據采用Excel 2019、Design-Expert 10.0.7進行響應面實驗設計及數據統計,使用Origin 2021進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 NADESs理化性質

制備的13種NADESs在室溫下均為透明均勻的液體。NADESs的物理和化學性質隨著HBDs和HBAs的類型和摩爾比而變化。制備的NADESs的極性參數、黏度、電導率和pH如表4所示。物質的溶解度和熔點受極性影響,采用尼羅紅極性參數ENR來確定NADESs的極性(電子版增強出版附圖1所示https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033762)。ENR值越小,NADESs的極性越強,13種NADESs極性表現為有機酸基>胺基>糖基>醇基。NADESs黏度降低可以增加液-液傳質作用,提高天然產物提取效率。在制備的13種NADESs中,除NADESs10外,醇基NADESs的黏度較小,蔗糖、檸檬酸作為氫鍵供體時,NADESs黏度最大,可能是因為存在更強大的三維分子間氫鍵網絡。從電導率的角度來看,除NADES10外,醇基NADESs表現出更高的電導率,其中NADES6與NADES12雖然形成了無色均一的低共熔混合物,但黏度過大,在室溫下流動性差,無法準確測量電導率和pH。NADESs的pH 受氫鍵供體影響較大,由表看出,氯化膽堿-醇基、氯化膽堿-糖類的NADESs體系為弱酸性到弱堿性,氯化膽堿-有機酸的NADESs為酸性,氯化膽堿-脲素的NADESs為堿性。

表4 十三種NADESs的極性參數、黏度、電導率和pHTable 4 Polarity parameters, viscosity, conductivity and pH of 13 NADESs

2.2 NADESs 提取柑橘籽檸檬苦素類化合物的比較

制備了由HBA(氯化膽堿)和4類HBDs(有機酸、多元醇、糖和胺)組成的13種不同的NADESs來提取柑橘籽的檸檬苦素類化合物。提取參數設定為液固比10 mL/g,含水量30%,提取時間30 min,提取溫度50 ℃,超聲波功率200 W。檸檬苦素、諾米林和黃柏酮是柑橘籽中主要的檸檬苦素類化合物,以其為評價指標,結果如圖1和電子版增強出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033762)。

圖1 不同NADESs對柑橘籽中檸檬苦素、 諾米林和黃柏酮的得率Fig.1 The yield of limonin, nomilin and phellodendron ketone in citrus seeds by different NADESs

NADESs的類型對從柑橘籽中提取檸檬苦素類化合物的效率有顯著影響。以有機酸為氫鍵供體的低黏度NADESs表現出較好的提取率,NADES10提取效率最高[檸檬苦素為(8.64±0.81) mg/g、諾米林為(3.77±0.17) mg/g、黃柏酮為(0.26±0.02) mg/g]。有機酸基NADESs可以更好地破壞和溶解細胞壁,這是提高提取率的原因之一[23],另一方面柑橘籽中類檸檬苦素主要是檸檬苦素,其在酸性條件下容易發生閉環反應,較低的pH可以促進檸檬苦素D環內酯水解酶催化檸檬苦素A環內酯轉化成檸檬苦素[24],從而提高類檸檬苦素化合物的總量。NADES5和6雖然其pH值低,但其高黏度影響了傳質效果,導致提取率較低。對醇基的 NADESs,羥基的增加使醇更容易與氯化膽堿形成分子內氫鍵,導致黏度增加,提取率降低[12]。此外,為了評估NADES作為常規溶劑的可能替代品,與80%乙醇的提取效率進行比較,結果顯示與傳統溶劑獲得的結果相當。綜上所述,選擇氯化膽堿和甲酸制備的NADES作為提取檸檬苦素類化合物的溶劑。

2.3 單因素試驗結果

由于檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的提取趨勢一致,所以在優化提取工藝時,提取率以3種物質的總和計算。單因素試驗結果表明,3種成分的總含量在NADES11摩爾比為1∶4、提取溫度50 ℃、提取時間30 min、含水量20%、液固比10∶1(mL∶g)時達到最高(圖2)。

a-摩爾比;b-含水量;c-液固比;d-提取時間;e-提取溫度圖2 摩爾比、含水量、液固比、提取時間和提取溫度對類檸檬苦素總含量的影響Fig.2 Effects of molar ratio, water content, solid-liquid ratio, extraction time and extraction temperature on the total content of limonoids

2.4 響應面實驗結果分析

2.4.1 回歸方程模型與方差分析

根據2.3節結果分析,設定氯化膽堿與甲酸摩爾比為1∶4,選取含水量(A)、液固比(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)作為單因素,以檸檬苦素類化合物得率為響應值,進行響應面優化實驗,Box-Behnken實驗設計與結果見電子版增強出版附表2所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033762)。運用Design expert 10.0.7數據分析軟件對試驗數據進行多元回歸擬合,得到二次多項回歸方程如下:

Y得率=8.88-0.81A-1.12B-0.047C-0.32D+0.15AB-0.68AC-0.025AD+0.34BC+0.043BD+0.99CD+1.17A2+1.3B2-0.04C2+1.47D2。

得率模型回歸方差分析(ANOVA)的結果見表5。由表5可知該回歸模型極顯著(P<0.01),失擬項不顯著(P=0.078>0.05),模型擬合程度好,表明可用該模型對得率進行分析和預測。同時模型回歸系數R2=0.950 7,調節后的R2=0.901 4,表明模型與實際提取過程具有較高的擬合度,方程可靠性較高。

表5 得率模型及回歸系數的回歸分析結果Table 5 Regression analysis results of yield model and regression coefficient

通過分析方差數據可以看出,一次項含水量、液固比對得率具有極顯著影響(P<0.01),提取溫度對得率具有顯著影響(P<0.05),分析各因素的主效應關系為:B>A>D>C,即液固比>含水量>提取溫度>提取時間。其二次項交互作用CD對得率具有極顯著的影響(P<0.01),AC對得率具有顯著的影響(P<0.05),AB、AD、BC、BD對得率的影響不顯著(P>0.05)。

2.4.2 響應面分析及最佳工藝驗證

利用Design Expert 10.0.7軟件得到響應面圖,可以直觀分析各因素間的交互作用強弱。由圖3可知,A與C、C與D之間對類檸檬苦素的提取均有顯著影響,且C與D之間相應曲面傾斜度最高,說明提取溫度和提取時間的交互作用對類檸檬苦素的得率有極顯著影響,含水量與提取時間的交互作用次之。響應曲面陡峭程度為CD>AC>BC>AB>BD>AD,這與方差分析結果一致。

根據回歸方程模型,得到預測的最優條件為:含水量12.038%、液固比10.229∶1(mL∶g)、提取時間33.909 min、提取溫度59.852 ℃。本著成本節約及最大限度提取有效成分的原則,將該條件依據實驗實際情況修正為含水量12%、液固比10∶1(mL∶g)、提取時間34 min、提取溫度60 ℃,在此最優條件下經3次平行試驗實際得率為(13.87±0.28) mg/g,與預測值總得率為14.47 mg/g,在5%偏差范圍內相差不大,證實了預測值和實驗值之間的良好相關性。

a-液固比-含水量;b-提取時間-含水量;c-提取溫度-含水量;d-提取時間-液固比;e-提取溫度-液固比;f-提取溫度-提取時間圖3 各因素對目標成分總提取效率影響的響應曲面圖Fig.3 Response surface diagram of the influence of various factors on the total extraction efficiency of target components

3 結論

綜上所述,建立了一種基于天然低共熔溶劑的綠色有效提取方法,并成功應用于柑橘籽中檸檬苦素類化合物的提取。對NADESs的極性、黏度、pH和電導率理化性質進行測定,在制備的13種NADESs中,氯化膽堿-甲酸(摩爾比1∶4)對檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的提取效率最好。通過響應面法確定最優提取工藝為液固比10∶1(mL∶g)、含水量12% (體積分數)、提取溫度60 ℃、提取時間34 min,在此條件下類檸檬苦素提取率為13.87 mg/g。NADESs 顯示了其作為提取天然產物中生物活性物質的溶劑的潛力,為柑橘水果廢棄物的開發利用提供了新型環保的研究方法。