pH對豌豆蛋白-高酯果膠復合物理化和結構特性的影響

馬開元,孫曉洋,陳復生,張麗芬*,朱婷偉

1(河南工業大學 糧油食品學院,河南 鄭州,450001)2(河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院,河南 鄭州,450046)

豌豆蛋白(pea protein,PP)是一種優質的植物蛋白,其氨基酸組成較平衡,并且賴氨酸含量豐富[1-2]。作為一種未被充分利用的蛋白,PP不僅具有來源廣泛、致敏性低、非轉基因的特點,而且具有降低膽固醇、血壓等獨特的生理活性[3]。由于PP表面疏水性較強且電荷量低,使其溶解性和乳化性較差[4],在以植物蛋白為體系的酸奶和飲料中應用時乳化穩定性不佳,體系通常發生脂肪上浮、油滴絮凝及聚集等失穩現象,嚴重影響食品品質和貨架期[5]。

研究表明多糖可以與蛋白質分子間產生相互作用,從而提高蛋白質乳液的穩定性[6]。果膠是一種應用廣泛的天然陰離子多糖,由于其來源豐富、價格低廉成為食品工業中常用的添加劑,根據甲酯化程度(degree of esterification,DE)的不同可分為高脂果膠(high methoxyl pectin,HMP)和低脂果膠(low methoxyl pectin,LMP),與HMP相比,LMP電荷密度較高,與蛋白的結合達到一定量后,游離在水相中的LMP和蛋白之間容易產生靜電排斥作用,不利于酸性乳飲料等的穩定[7]。HMP因電荷量較少在蛋白表面吸附較多,可通過疏水以及靜電相互作用和蛋白進行復合,提供空間位阻效應維持酸性蛋白體系的穩定性,在食品的結構、理化和功能特性中起到增稠劑、穩定劑、膠凝劑和乳化劑的作用[8]。ALBANO等[9]研究發現大豆蛋白和高甲氧基果膠在pH 3.5時相互作用最強,具有較高的絡合性,復合物穩定的乳液具有牛頓力學行為,液滴尺寸較小,可顯著提高乳化液的穩定性。GHARSALLAOUI等[10]通過研究高甲氧基果膠對豌豆分離蛋白乳液穩定性的影響,發現在一定條件下添加果膠后,由于果膠吸附產生空間排斥作用以及油水界面膜硬度的提高,可以使乳液更加穩定。

蛋白質和多糖在溶液中受pH、濃度、離子強度等影響,形成共溶體系、離散型相分離體系和靜電復合(可溶、不可溶)體系,其中pH是影響蛋白-多糖相互作用的重要因素[11]。薛麗瑩等[12]通過研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG]與大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)在pH 3.0、7.0、9.0條件下的相互作用,發現不同pH值下EGCG與SPI的結合力不同,兩者之間的相互作用可能會導致氨基酸殘基微環境發生改變,使得SPI二級結構發生改變。

綜上所述,本研究以PP和HMP為原料,通過分析pH對PP-HMP復合物濁度、粒徑、多分散性指數(polydispersity index,PDI)、電位、乳化活性和穩定性以及復合物結構特性的影響規律,闡明不同pH下PP-HMP復合物形成規律,探究PP-HMP復合物乳化特性與其理化和結構特性之間的關系,研究結果為擴大PP-HMP復合物在食品中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PP(蛋白含量為81.2%),雙塔食品貿易有限公司;HMP[CAS:9000-69-5,來源于蘋果,酯化度61%,半乳糖醛酸(干基計)75.1%],上海麥克林生化科技有限公司;大豆油,益海(周口)糧油工業有限公司;KBr(光譜純)、無水乙醇、NaOH,天津市科密歐化學試劑有限公司;HCl,洛陽昊華化學試劑有限公司;實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-IID超聲波破碎儀、DC-2030低溫恒溫槽,寧波新芝生物科技股份有限公司;FJS-6恒溫數顯磁力攪拌水浴鍋,常州市頂新實驗儀器有限公司;722S可見分光光度計,上海儀電公司;BT-納米粒度儀(Zeta電位分析儀),丹東百特儀器有限公司;FM200高速剪切分散乳化機,上海弗魯克科技發展有限公司;Cary Eclipse熒光光譜儀,安捷倫科技(中國)有限公司;IRAffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀,日本島津株式會社;HT-7700透射電子顯微鏡,日立(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PP-HMP復合物的制備

將PP和果膠用蒸餾水溶解,制備質量濃度為8 mg/mL 的PP和HMP溶液,于25 ℃恒溫攪拌水合過夜。然后將所制備的PP和HMP溶液以1∶1(質量比)混合,攪拌均勻后用0.1～2 mol/L 的HCl和NaOH溶液將混合溶液的pH值分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,然后恒溫攪拌4 h,超聲處理(5.43 W/cm3,15 min,25 ℃)后備用。

1.3.2 PP-HMP復合物理化特性分析

1.3.2.1 濁度的測定

將不同pH值的PP-HMP復合物用分光光度計在600 nm下測定透光率,將待測樣品放置于比色皿中,在常溫下測定濁度,每組樣品重復測定3次[13]。

1.3.2.2 粒徑和電位的測定

將顆粒分散液用蒸餾水稀釋100倍后,利用納米粒度儀測定其粒徑、PDI和Zeta-電位。平衡時間120 s,測定溫度25 ℃,為避免多重光散射,每次循環掃描60次。每個樣品重復測定3次[14]。

1.3.2.3 乳化活性和穩定性的測定

取5 mL大豆油加入10 mL PP-HMP混合溶液,在室溫下用高速剪切機以13 000 r/min的轉速剪切2 min,在第0 min和第40 min于樣品底部吸取50 μL乳狀液放入裝有10 mL 0.1%(質量分數)SDS溶液的離心管中,混勻后立即在500 nm處進行吸光值的測定[15]。乳化活性(emulsifying activty index,EAI)和乳化穩定性(emulsifying stability index,ESI)計算公式如公式(1)、公式(2)所示:

式中:ρ,復合物質量濃度,g/mL,A0,乳狀液在第0 min的吸光值,A40,乳狀液在放置40 min的吸光值;t,間隔時間,40 min;φ,乳狀液中的油相體積分數;T=2.303。

1.3.2.4 穩定性分析

將制備好的PP-HMP復合溶液放置于4 ℃冰箱中,定期觀察樣品是否出現沉淀,并用納米粒度儀檢測粒徑大小和分布。

1.3.3 PP-HMP復合物結構特性分析

1.3.3.1 傅里葉紅外光譜

將1.3.1節制備的PP和PP-HMP復合溶液冷凍干燥后取約2 mg與100 mg烘干后的KBr研磨混勻,然后使用壓片機壓制成薄片后掃描分析,設置波數范圍4 000～400 cm-1,掃描次數32次,分辨率4 cm-1,采用Peakt軟件分析蛋白的二級結構含量的變化[16]。

1.3.3.2 熒光光譜

將PP和PP-HMP復合溶液稀釋10倍后使用熒光分光光度計進行測定,固定激發波長λex為280 nm,激發和發射狹縫寬度分別為2.5 nm和5 nm,掃描范圍300～500 nm[17]。

1.3.3.3 透射電鏡觀察

將PP和PP-HMP溶液進行適當稀釋,取約20 μL滴到覆有聚乙烯醇縮甲醛脂膜的銅網上,水平放置2 min使分子聚集體沉積到網面上,用濾紙吸去表面多余溶液,之后滴加2%(質量分數)磷鎢酸溶液約20 μL放置2 min使顆粒充分染色,再用濾紙將銅網上多余染液進行吸取,置于紅外燈下干燥后用透射電子顯微鏡觀察并拍照[18]。

1.3.4 數據統計分析

每個試驗重復3次,試驗結果用平均值±標準差表示。采用SPSS 26.0軟件Ducan檢驗法對數值進行差異顯著性分析(P<0.05),Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 pH對PP-HMP復合物理化特性的影響

2.1.1 濁度

濁度是因樣品的吸收或顆粒的散射而造成透射光的衰減,可以反映粒子的大小,表征溶液體系中顆粒的聚集程度和穩定性。圖1表示PP、HMP和PP-HMP復合物的濁度隨pH的變化。單一HMP溶液在不同pH下呈澄清透明狀態,濁度值均低于0.1且無顯著差異,PP由于在等電點附近會聚集沉淀,因此單一的PP在pH 4.0～6.0的范圍內均發生不同程度的沉淀,pH 5時濁度最大,為1.203。而在PP-HMP復合體系中,隨著pH的升高,復合物濁度呈現顯著降低的趨勢,與PP溶液相比,其濁度最大值向酸性pH值偏移。pH 3.0時PP-HMP復合體系出現明顯的相分離現象,濁度呈現最大值1.276,此時形成不可溶復合物,顆粒分子相對較大,溶液顆粒聚集并形成沉淀;當pH值升高至6.0的過程中PP-HMP復合體系濁度急劇下降,顆粒分散液的透明度增大,這可能是由于HMP加入后產生的靜電排斥和空間位阻效應抑制蛋白的聚集,聚合物開始解離,同時PP與HMP電荷相反部分實現絡合,并增強HMP與PP之間的相互作用形成可溶性復合物,均勻分散在溶液中[19];pH值繼續增大至8.0時,由于PP和HMP均帶負電荷,兩者因靜電排斥作用而各自以單分子形態共存于溶液中[20]。

2.1.2 粒徑和PDI

表1顯示了pH對PP-HMP復合物的粒徑和PDI的影響。pH對單獨HMP的粒徑和PDI影響不顯著,在不同pH條件下無顯著差異,而單獨PP和PP-HMP復合物的粒徑和PDI在不同pH條件下呈現顯著差異。pH值為3.0時,PP溶液粒徑和PDI都較小,而PP-HMP復合物的粒徑較大為1.8 μm時,此時復合物不穩定容易形成沉淀,意味著不可溶復合物的形成;在pH 4.0～6.0時,單獨PP分子間的聚集,粒徑和PDI均較大,且粒徑分布較為分散,在此條件下加入HMP可抑制蛋白的自聚集,并通過疏水和靜電相互作用與蛋白發生絡合,形成可溶性復合物,使其獲得較小的粒徑和更窄的分布[21];當pH值增大至7.0～8.0時得到的復合物粒徑較小,這是由于蛋白質分子帶凈負電荷,與果膠分子之間發生靜電排斥,導致果膠分子從顆粒表面解吸而發生共溶現象,得到的粒徑也偏小。

a-PP和PP-HMP復合物的濁度;b-PP和PP-HMP復合物的外觀圖圖1 pH對PP和PP-HMP復合物濁度的影響Fig.1 Turbidity of PP and PP-HMP complex by pH 注:不同小寫字母表示同一樣品不同pH差異顯著(P<0.05)(下同)。

表1 pH對PP和PP-HMP復合物粒徑和PDI的影響Table 1 Particle size, PDI of PP and PP-HMP complex by pH

2.1.3 Zeta-電位

Zeta-電位反映了在水溶性遞送系統中分散體的穩定性,一定條件下,體系電位值越高,溶液粒子間的斥力位能越大,體系的穩定性越好[22]。PP-HMP復合物的Zeta-電位隨pH的變化如圖2所示。PP的Zeta-電位隨pH的增加呈現逐漸降低的趨勢,pH值接近5.0時約為0 mV,表明此時溶解的蛋白靜電荷為0,即為PP的等電點。HMP和PP-HMP復合物的Zeta-電位都呈現出先下降后升高的趨勢。pH 3.0時,單獨PP帶較多正電荷,與陰離子多糖HMP之間存在強烈的靜電作用,出現大范圍聚集并形成不溶性復合物,此時pH<果膠的pKa(3.5左右),果膠分子的電離過程受到抑制,所攜帶的電荷量會明顯降低,復合物電位絕對值也較低,體系較不穩定;隨著pH升高至PP等電點附近時,PP的正靜電荷顯著減少,可通過靜電相互作用有效地與果膠的陰離子基團發生結合形成穩定的可溶性復合物;當pH>PP等電點至6.0時,PP和HMP溶液負電荷都增多,兩者之間的靜電排斥作用增大,研究表明PP中11S組分的等電點在6.4左右,因此pH 6.0時不僅存在PP局部正電荷區域與HMP之間的靜電相互作用,同時存在11S組分與HMP的靜電相互作用[20],此時復合物的Zeta-電位絕對值達到最大,形成可溶性復合物,與濁度、外觀以及粒徑的測定結果一致(圖1、表1);pH值繼續升高至7.0～8.0時,過量陰離子基團的存在使兩者之間存在強烈的靜電相斥作用,使蛋白和果膠分子以獨立高分子存在,HMP所帶負電荷顯著減少,溶液水相中的HMP分子減少,導致復合物Zeta電位的絕對值向更小的方向移動。

圖2 pH對PP和PP-HMP復合物Zeta電位的影響Fig.2 Zeta-potential of PP and PP-HMP complex by pH

2.1.4 乳化活性和乳化穩定性

圖3是pH對PP-HMP復合物乳化活性和穩定性的影響以及乳液放置1 d后的外觀圖。pH 3.0時PP-HMP復合體系的乳化活性和穩定性均較差,制備的乳液很快出現絮凝并在10 min左右開始分層,此時PP-HMP復合體系形成大顆粒不溶性復合物,乳化后分子之間的橋連作用促進了被包裹的液滴的聚集,而且不溶性聚集體在油水界面上的吸附速度較慢[23],說明pH 3不適合用作乳液制備的條件;隨著pH的增大,復合物的乳化活性和穩定性顯著增大,放置1 d后分層現象明顯改善,當pH值高于6時,帶負電的果膠分子從乳液油滴的表面解吸,和液滴表面之間的相互作用也變弱,可能更容易從一個液滴上分離并與另一液滴結合,從而促進橋聯絮凝,并且水相中未吸附的果膠也會誘導蛋白包裹的乳液液滴發生絮凝[10]。

a-PP-HMP復合物的乳化活性和穩定性;b-PP-HMP乳狀液的外觀圖圖3 pH對PP-HMP復合物乳化活性和穩定性的影響Fig.3 Emulsifying activity and stability of PP-HMP complex by pH

2.1.5 穩定性

圖4表示PP-HMP復合物在pH值為3、6、8時的儲藏穩定性。PP-HMP復合物在pH 3時放置1 d即出現明顯沉淀,隨著儲藏時間的增加,24 d時復合物粒徑顯著增大;pH 8下放置6 d時出現輕微沉淀,儲藏時間越長粒徑越大;而pH 6下放置24 d粒徑顯著增大但未出現明顯沉淀,表明PP-HMP復合物在pH 6時具有相對良好的儲存穩定性,顯示了此時復合物較高的實際應用價值。

2.2 pH對PP-HMP復合物結構特性的影響

2.2.1 內源熒光光譜

蛋白質的內源熒光主要來源于色氨酸(Trp)殘基,可以反映蛋白質的三級結構和極性變化。圖5為PP-HMP復合物的熒光光譜圖。與單獨的PP溶液相比,PP-HMP復合物在pH 6的最大發射波長發生明顯紅移,說明復合物的形成改變了Trp殘基的微環境,表明疏水相互作用參與了復合物的形成,降低了蛋白分子中氨基酸殘基的暴露程度,使其形成了更緊密的三級構象[24];相對于pH 6,PP-HMP復合物在pH 3和pH 8的最大吸收波長發生明顯藍移,且隨著pH的減小,最大熒光強度明顯降低,可能是由于蛋白質結構的重排和解折疊使得Trp等氨基酸殘基由于分子內相互作用力處于更為疏水的環境,從而減弱了復合物的猝滅效率[25]。

a-PP-HMP復合物的粒徑;b-PP-HMP復合物儲藏不同時間的外觀圖圖4 不同pH下PP-HMP復合物的粒徑隨儲藏時間的變化Fig.4 Change of particle size of PP-HMP complexes with storage time at different pH 注:不同字母表示同一pH樣品在不同儲存條件差異顯著(P<0.05)。

圖5 PP-HMP復合物的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of PP-HMP complex

2.2.2 紅外光譜特性

圖6-a為PP-HMP的FTIR圖譜,加入HMP之后,PP-HMP復合物與單獨PP相比在1 103～1 020 cm-1和1 747 cm-1處出現新的吸收峰,其中1 103～1 020 cm-1處吸收峰是由羧基形成的—COOR(C—O)和—COO—伸縮振動引起,是HMP中的半乳糖醛酸在指紋區(1 473～1 000 cm-1)的特征吸收峰[26],表明PP和HMP之間存在相互作用,而不同pH的PP-HMP復合物在不同波段的吸收峰出現不同程度的藍移或者紅移。PP-HMP復合物在pH 3.0條件下酰胺A帶和B帶紅移,說明N—H、O—H、C—H發生伸縮振動,兩者之間存在氫鍵相互作用,酰胺Ⅱ帶出現紅移,酰胺Ⅲ帶出現大幅藍移說明PP和HMP之間的相互作用可能涉及C—N共價鍵的相互作用;復合物在pH 6.0時的光譜圖酰胺Ⅱ帶和酰胺A帶發生紅移,代表N—H發生彎曲振動、C—N、N—H及C—C鍵發生伸縮振動,而且O—H伸縮振動帶發生明顯紅移,這說明HMP通過氫鍵和疏水相互作用與PP發生結合[12];此外,pH 8.0時—OH發生伸縮振動,這可能是由于HMP上的羥基在堿性條件下被氧化,C—N共價鍵的伸縮引起振動酰胺Ⅲ帶出現輕微藍移[27]。傅里葉紅外光譜圖表明pH值會影響PP和HMP之間的相互作用。

a-紅外光譜圖;b-二級結構相對含量圖6 PP-HMP復合物的紅外光譜圖和二級結構相對含量Fig.6 FTIR and secondary structure fractions of PP-HMP complex

蛋白質二級結構的定量信息如圖6-b所示。與PP相比,PP-HMP可溶復合物的β-折疊和無規卷曲相對含量減少,β-轉角和α-螺旋相對含量增大,表明在pH 6條件下HMP能夠抑制PP的聚集,可以使PP的結構更加有序,剛性結構增強,同時更易于形成界面吸附,提高PP-HMP復合物的乳化活性和乳化穩定性[28]。不同pH會影響PP-HMP復合物二級結構的相對含量,與pH 6相比,pH 3和pH 8時復合物的無規卷曲結相對含量增加,而α-螺旋相對含量減少,復合物在這2種pH條件下形成較多無序的分子結構導致乳化活性和穩定性較低,不利于乳液的制備。

2.2.3 透射電鏡觀察

圖7為PP-HMP復合物的透射電鏡圖,淺灰色為HMP的網絡結構,黑色部分為PP的顯色,單獨PP在pH 6.0時呈現出形態規則的球狀結構(圖7-a),加入果膠后,從圖7-c中可以看出果膠的網絡結構嵌入蛋白的球狀結構中,復合顆粒形成形態統一并且規則有序的花蕾狀結構,且粒徑較小并分散均勻,說明pH 6時的PP和HMP通過復合形成了具有核-殼結構的納米顆粒,有利于乳液的穩定。而pH 3狀態下PP結構展開和果膠相互作用被果膠大量覆蓋,導致聚合物橋聯絮凝,乳液不穩定而快速分層,跟上述乳化活性和穩定性的結果一致。在pH 8條件下蛋白和果膠分別以各自獨立的形態存在,呈現出形態大小均不太規則的類似球形結構。

a-PP-pH 6;b-PP-HMP pH 3;c-PP-HMP pH 6; d-PP-HMP pH 8圖7 PP-HMP復合物的透射電鏡圖Fig.7 Transmission electron micrographs of PP and PP-HMP complex

3 結論

本文研究了不同pH對PP-HMP復合物理化和結構特性的影響,得出以下結論:PP和HMP在pH 3.0、6.0和8.0時分別以不可溶復合物、可溶性復合物和共溶狀態存在;與pH 3.0和8.0相比,PP-HMP復合物在pH 6.0時Zeta-電位絕對值、乳化活性和穩定性較高,放置24 d未發生分層現象,并且與單獨PP相比,PP-HMP復合物的β-轉角和α-螺旋相對含量增大,色氨酸殘基的暴露程度降低,結構更加有序緊密。透射電鏡結果顯示,pH 3.0、8.0時,PP-HMP復合物呈現出形態大小不規則的結構;pH 6.0時PP-HMP復合物呈現分散均勻且形態規則有序的結構,適合乳液的制備。研究結果表明,pH可以改善PP-HMP復合物的理化和功能特性,為蛋白-多糖復合物在食品中的應用提供理論基礎。