超臨界萃取結合分子蒸餾純化生姜精油及其揮發性成分分析

郭家剛,楊松,伍玉菡,朱倩,杜京京,江艦*

1(安徽省農業科學院農產品加工研究所,安徽 合肥,230031)2(安徽省食品微生物發酵與功能 應用工程實驗室,安徽 合肥,230031)

生姜(ZingiberofficinaleRosc.)又名百辣云,為姜科姜屬多年生宿根草本植物根莖,在我國廣泛分布于中部、東南部及西南部地區,具有獨特的風味和藥用價值,是典型的藥食兩用植物[1-2]。生姜中不僅富含蛋白質、維生素和纖維素等人體必需營養物質,而且含有姜酚、姜酮和揮發油等多種生物活性成分[3]。生姜精油是從生姜根莖中萃取得到的一類具有濃郁芳香的揮發性成分,也是天然香料的重要組成部分,因其具有去腥增香[4]、抑菌消炎[5-6]、抗氧化損傷[7]等功效,在食品、醫藥、化妝品等領域均有廣泛的應用前景[8]。生姜精油常用的提取方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑浸提法、超臨界流體萃取等[9-10]。然而水蒸氣蒸餾法、溶劑浸提法等傳統方法存在操作溫度高、提取效率低、易發生熱敏成分副反應以及溶劑殘留等問題,限制了其廣泛應用[11]。超臨界流體萃取是一種新型的萃取技術,具有萃取效率高、無溶劑殘留、操作條件溫和等優點,克服了傳統萃取工藝的弊端,有效保持了天然活性物質的特性,被稱為“綠色萃取技術”[12]。目前,超臨界CO2流體萃取技術已在植物活性物質萃取方面得到了廣泛應用[13]。但超臨界CO2流體萃取生姜油成分復雜,不僅含有揮發性的精油,還含有非揮發性的姜辣素等物質,需要對其進一步分離純化[14]。因此,聯合現代儀器分析技術,開發節能高效、綠色環保的萃取分離技術對生姜精油產品的開發和應用具有重要意義。

分子蒸餾是近年來新興的一種分離純化技術,主要利用不同物質分子平均自由程及揮發性的差別而實現高效分離[15]。該技術在高真空遠低于沸點的溫度下進行的,物料受熱時間短且分離效果好,特別適用于濃縮、純化或分離分子質量高、沸點高、黏度高的物質及熱穩定性差的有機混合物[16],已成為分離目標產物最溫和的蒸餾方法。由于生姜油中主要的揮發性成分是萜烯類物質,大多為熱敏性化合物,易受光、熱等因素而發生氧化或降解[17],采用超臨界CO2流體萃取技術聯合分子蒸餾技術能較好的保持生姜精油揮發性成分穩定,提升精油產品品質。然而,目前采用超臨界CO2流體萃取制備生姜油,并結合分子蒸餾分離純化生姜精油揮發性成分的研究鮮有報道。

本研究以舒城黃姜為研究對象,通過優化生姜精油超臨界CO2流體萃取聯合分子蒸餾工藝條件制備高品質生姜精油,并利用氣相色譜-質譜聯用技術對萃取生姜精油的揮發性成分進行分析,以期為舒城黃姜精深加工產品的開發利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用生姜原料為舒城黃姜,安徽谷瑞農業科技開發有限公司種植基地;生姜原料采收于2021年9月,在15 ℃恒溫庫中貯藏至2022年5月,然后用于生姜精油提取工藝研究。CO2(純度≥99.99%,食品級),合肥申和氣體有限責任公司;甲醇、乙醇(均為色譜純),德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

ME204電子顯示天平,梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;Milli-Q去離子水發生器,美國Millipore公司;20 mL頂空進樣瓶,上海安譜實驗科技股份有限公司;SC-C03-CXGA空氣源熱泵烘干機組,鄭州歐納爾冷暖科技有限公司;SFJ粉碎機,上海申銀機械廠;HA220-50-06型超臨界CO2流體萃取設備,南通市華安超臨界萃取有限公司;FZL-001刮膜式分子蒸餾設備,天津達純科技有限公司;三重四級桿氣質聯用儀(配備7890B氣相色譜儀、7000B質譜檢測器),美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生姜預處理

生姜經過挑選、清洗、攤晾、切片后,采用烘房60 ℃干燥至生姜水分含量≤5%,粉碎過40目篩后密封包裝,然后置于陰涼干燥處保存備用。

1.3.2 水蒸氣蒸餾提取生姜精油

準確稱取50 g生姜粉置于蒸餾燒瓶中,加入適量蒸餾水,連接提取裝置,蒸餾完成后,靜置分層,分離出上層精油,并加入適量無水Na2SO4干燥,經過濾后,稱重并計算精油得率為0.96%。

1.3.3 超臨界CO2萃取生姜油的單因素試驗

準確稱取3.0 kg生姜粉裝入10 L的超臨界CO2萃取釜Ⅰ中,分別調節CO2流量、萃取溫度和壓力等參數進行萃取試驗。在萃取壓力24 MPa、萃取溫度40 ℃條件下萃取2 h,固定其他因素,分別考察萃取壓力(16、20、24、28、32 MPa)、萃取溫度(30、35、40、45、50 ℃)和萃取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對生姜油萃取得率的影響。生姜油萃取率的計算如公式(1)所示:

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上,選取萃取壓力、萃取溫度和萃取時間為考察因素,設計三因素三水平正交試驗[L9(34)正交表],進一步考察各因素對生姜油萃取率的影響,正交試驗因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.5 分子蒸餾技術純化生姜精油

將一定量的超臨界CO2流體萃取生姜油裝入分子蒸餾物料桶中,打開加熱器、真空泵、冷水機,固定分子蒸餾冷凝溫度5 ℃,刮膜轉速200 r/min,設定蒸餾溫度(50、60、70、80、90、100 ℃),調節進料閥保持進料流量2 mL/min,系統真空度65 Pa,進行分子蒸餾分離純化,并對所得餾出物輕組分(生姜精油)和重組分進行收集,分別稱取質量并計算各組分得率,考察不同蒸餾溫度對生姜精油分離純化效果及品質的影響。

1.3.6 氣相色譜-質譜分析條件

將經過萃取分離得到的生姜精油用甲醇按照體積比稀釋50倍,過0.22 μm有機相尼龍微孔濾膜,供氣相色譜-質譜分析。色譜(GC)條件:DB-5MS石英毛細柱(60 m×250 μm×0.25 μm);色譜柱升溫程序:起始溫度50 ℃,保持1.5 min后以8 ℃/min升至125 ℃,然后以3 ℃/min升至145 ℃,再以0.5 ℃/min升至150 ℃,保持10 min,最后以15 ℃/min升至260 ℃,保持8 min至完成分析;載氣為高純氦氣(99.999%),流速為1 mL/min;進樣口溫度250 ℃,進樣量1 μL,分流比30∶1。質譜(MS)條件:電子轟擊(electron impact, EI)離子源,電子能量70 eV;傳輸線溫度280 ℃,四級桿溫度150 ℃,離子源溫度230 ℃;掃描方式為離子監測模式,掃描質量范圍35～450 amu。

1.3.7 定性定量方法

移取C7～C30正構烷烴標準品,用正己烷溶劑將其配制為質量分數為5%的標準溶液,按照1.3.6節分析條件進樣,測定各正構烷烴的保留時間。各成分的RI值根據Kovats公式進行計算,如公式(2)所示:

式中:RI,被分析組分的保留指數;tx,被分析組分流出峰的保留時間,min;tn和tn+1,n和n+1碳原子數的正構烷烴流出峰的保留時間。

生姜精油樣品經過GC-MS/MS分析后,利用儀器配置的質譜數據系統NIST11質譜庫對生姜精油中的化學成分進行自動檢索,然后計算各分析組分的保留指數,將計算的保留指數與ESO精油數據庫中的保留指數進行比對,對其成分進行定性分析,采用色譜峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。

1.4 數據處理

所有實驗均設置3組平行,結果以平均值±標準差表示。使用SPSS Statistics 22.0軟件進行數據統計分析,采用最小顯著性差異(least significance difference, LSD)法分析差異顯著性(P<0.05),利用Origin 2017軟件和GraphPad Prism 6軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 萃取壓力對萃取率的影響

萃取壓力是超臨界CO2流體萃取工藝中重要的參數之一,萃取壓力的變化不僅影響萃取效率,而且對萃取選擇性也有重要影響[18]。在萃取溫度為40 ℃,萃取時間為2 h,CO2流量35 L/h條件下,考察了不同萃取壓力(16、20、24、28、32 MPa)對生姜油萃取率的影響。由圖1可知,萃取壓力對生姜油萃取率的影響顯著,隨著萃取壓力的增大,姜油萃取率逐漸升高,這是因為在萃取溫度等條件一定時,壓力增大,流體密度增加,溶劑的溶解度增加,導致萃取率升高。當萃取壓力達到24 MPa時,此時的生姜油萃取率最高為5.28%,而萃取壓力進一步增加,生姜油萃取率呈現下降趨勢,可能是由于壓力過大,導致物料過分緊實,物料之間的縫隙變小,影響了萃取物的擴散速率,導致生姜油的萃取率下降[19],因此,生姜油的最佳萃取壓力選擇為24 MPa。

圖1 萃取壓力對姜油萃取率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the extraction rate of ginger oil

2.1.2 萃取溫度對提取率的影響

萃取溫度對超臨界流體的溶解能力影響較大,是影響超臨界萃取的主要因素之一[20]。在萃取壓力24 MPa,萃取時間為2 h,CO2流量35 L/h條件下,考察了不同萃取溫度(30、35、40、45、50 ℃)對姜油萃取率的影響。如圖2所示,當溫度在30～40 ℃時,隨著萃取溫度的升高,生姜油的萃取率逐漸增加,當萃取溫度高于40 ℃時,萃取率變化趨于平緩,當溫度由45 ℃增加到50 ℃時,生姜油的萃取率有略微下降。溫度對生姜油萃取率的影響在于:一定范圍內溫度升高促使溶質分子擴散能力增強,溶質的溶解度升高,使生姜油萃取率增加;溫度升高會導致超臨界流體溶劑化效應降低,使其溶解度降低,從而導致生姜油萃取率降低。綜合以上分析,生姜油萃取溫度以40 ℃為宜。

圖2 萃取溫度對姜油萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of ginger oil

2.1.3 萃取時間對提取率的影響

萃取時間也是超臨界流體萃取的一項重要參數,不僅與萃取效率密切相關,而且直接關系到運行成本的高低[21]。在萃取壓力24 MPa,萃取溫度40 ℃,CO2流量35 L/h條件下,考察了不同萃取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對姜油萃取率的影響。由圖3可知,隨著萃取時間的延長,生姜油的萃取率呈現一個上升的趨勢,2 h之后,萃取率隨時間的延長沒有顯著變化,說明此時萃取已經相當充分,延長時間已不太可能增加生姜油萃取得率,而且萃取時間過長會導致萃取物中樹脂類等成分增多,影響生姜油的品質。因此,從能效和產品品質方面考慮,生姜油最適萃取時間為2 h。

圖3 萃取時間對姜油萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction duration on the extraction rate of ginger oil

2.2 正交試驗結果

為全面考察超臨界CO2萃取各因素對生姜油萃取率的影響,在單因素試驗的基礎上設計了正交試驗。根據單因素試驗,對超臨界CO2萃取生姜油的萃取壓力、萃取溫度和萃取時間3個因素進行L9(34)正交試驗,超臨界CO2萃取生姜油的正交試驗結果見表2。

由表2可知,不同的超臨界CO2萃取工藝條件對生姜油的萃取率的影響存在一定的差異。通過極差分析可知,萃取壓力(A)的極差最大,對生姜油萃取效果的影響最大,其第2水平的值最大,即萃取壓力為24 MPa的萃取效果最好,其次是萃取時間和萃取溫度,分別以第2水平和第3水平為最佳,正交試驗結果表明各萃取因素對生姜油萃取率的影響大小依次為:A>C>B,即:萃取壓力>萃取時間>萃取溫度。在試驗范圍內最佳效果的萃取工藝條件為A2B3C2,即萃取壓力為24 MPa,萃取溫度為45 ℃,萃取時間為2 h。為驗證試驗的重現性,在最優工藝條件下進行3次重復試驗,平均萃取率為(6.23±0.70)%。結果表明試驗設計合理可行,數據可靠,重現性良好,適宜生姜中姜油的萃取。

2.3 分子蒸餾參數優化

在分子蒸餾系統中,蒸餾溫度是影響物料分離效果的關鍵因素之一。蒸餾溫度越高,物質的分子平均自由程越大,輕、重組分物質的分離效果越好,同時較高的溫度會對分離組分產生不同程度的影響[22]。在真空度為65 Pa,轉速為200 r/min,流速為5 mL/min,考察了不同溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)生姜精油得率的影響。生姜油經過分子蒸餾,被分為輕組分和重組分,輕組分主要是揮發性芳香精油,重組分主要是非揮發性姜辣素。如圖4所示,輕重組分總的回收率均保持在90%以上,其中輕組分得率隨著溫度的升高而逐漸提高,重組分得率隨著溫度的升高逐漸降低。經50～80 ℃分子蒸餾,生姜精油得率持續上升,80 ℃之后隨蒸餾溫度升高生姜精油得率呈現緩慢升高趨勢,在80、90、100 ℃時,生姜精油的得率差異不大。同時,隨著蒸餾溫度升高,生姜精油的顏色逐漸加深,由淡黃色向黃色轉變,可能是由于蒸餾溫度升高,有少量的姜辣素等物質被帶入生姜精油,考慮到較高的蒸餾溫度可能會對姜烯等熱敏物質因熱降解反應引起較大的損失[23],因此,選擇最佳的蒸餾溫度為80 ℃,此時,生姜精油的得率為40.59%,在此條件下,生姜精油的綜合得率為2.53%。

a-得率;b-感官品質圖4 蒸餾溫度對各組分的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on compents of ginger oil

2.4 生姜油GC-MS/MS分析

采用GC-MS/MS對生姜精油揮發性成分進行分析,得到生姜精油總離子流圖(圖5),對生姜精油中各揮發性物質進行了定性,確定了超臨界CO2萃取聯合分子蒸餾萃取生姜精油的主要揮發性成分,并將超臨界CO2萃取生姜精油與水蒸餾生姜精油進行了比較。由表3可知,不同萃取工藝所得生姜精油的揮發性成分組成和含量均存在一定差異,但主要揮發性成分基本保持一致。生姜精油中共鑒定出26種揮發性物質,其中超臨界CO2萃取聯合分子蒸餾萃取生姜精油鑒定出22種揮發性物質,包括17種萜烯類、4種醇類及1種酯類,相對百分含量最高的是α-姜烯(42.13%)、其次是β-倍半水芹烯(17.05%)和β-紅沒藥烯(13.52%);水蒸餾生姜精油共鑒定出21種揮發性物質,包括14種萜烯類、6種醇類及1種酯類,百分含量最高的是α-姜烯(40.59%)、其次是β-倍半水芹烯(17.01%)和β-紅沒藥烯(12.86%)。α-姜烯、β-倍半水芹烯、β-紅沒藥烯在兩種萃取方法所得生姜精油中均占有較高比重,百分含量均達70%以上,基本確定是生姜精油的主要化學成分[24]。不同方式所得生姜精油在百分含量和成分上也存在一定差異,其中α-姜烯、β-倍半水芹烯、β-紅沒藥烯等成分在超臨界CO2生姜精油中相對百分含量較高,α-合金歡烯和α-姜黃烯在水蒸餾法生姜精油中的相對百分含量較高。另外,超臨界CO2萃取聯合分子蒸餾得到的生姜精油的單萜烯類揮發性物質和出峰時間靠前的揮發性物質較多,如α-水芹烯、α-葑烯、β-水芹烯等,而水蒸氣蒸餾得到的生姜精油的醇類物質和出峰時間靠后的物質較多,如順式-水合倍半萜檜烯、蛇麻-1,6-二烯-3-醇、6-芹子烯-4醇等。這可能是由于超臨界CO2萃取聯合分子蒸餾工藝條件溫和,較好的保留了熱敏物質,而水蒸氣蒸餾法需要較高的溫度(100 ℃),造成了生姜精油中熱敏性化學成分的降解與損失[25],表明了超臨界CO2萃取聯合分子蒸餾在萃取揮發性風味物質工藝上具有顯著的優勢。

圖5 生姜油總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of crude ginger oil

表3 不同萃取工藝制得的生姜精油中揮發性成分分析Table 3 GC-MS/MS chemical composition analysis results of extracts from different extraction processes

續表3

3 結論與討論

在本研究采用超臨界CO2流體萃取聯合分子蒸餾技術對生姜精油的萃取進行了系統研究。經過單因素和正交試驗優化,得到超臨界流體萃取技術最佳工藝條件為萃取壓力24 MPa、萃取溫度45 ℃、萃取時間2 h,分子蒸餾分離純化生姜精油最佳溫度為80 ℃,在此條件下的生姜精油綜合萃取率達到了2.53%,基于GC-MS/MS對不同提取方式生姜精油揮發性成分進行了分析,確定了生姜精油的主要揮發性成分為α-姜烯、β-倍半水芹烯、β-紅沒藥烯等萜烯類物質,百分含量達70%以上,其中α-姜烯百分含量為42.13%。采用超臨界CO2流體萃取聯合分子蒸餾法純化生姜精油得率和品質均優于傳統的水蒸氣蒸餾法。該方法的建立,可為生姜精油的產業化與后續研究提供依據。

本研究通過GC-MS/MS對超臨界結合分子蒸餾生姜精油與水蒸氣蒸餾生姜精油的揮發性組分進行了分析,共鑒定出26種揮發性成分,其中超臨界結合分子蒸餾純化生姜精油中鑒定出22種,主要包括17種萜烯類、4種醇類、1種酯類,其主要揮發性成分是α-姜烯、β-倍半水芹烯、β-紅沒藥烯、α-姜黃烯;水蒸氣蒸餾生姜精油中鑒定出21種揮發性成分,主要包括14種萜烯類、6種醇類、1種酯類,其主要揮發性成分是α-姜烯、β-倍半水芹烯、β-紅沒藥烯、α-姜黃烯。2種提取方法得到的生姜精油的主要揮發性成分基本一致,但超臨界結合分子蒸餾純化得到的生姜精油含有一定量的低沸點揮發性物質,比如α-水芹烯、α-葑烯和β-水芹烯等,在水蒸氣蒸餾得到的生姜精油中未檢出,可能是水蒸餾溫度過高,導致低沸點揮發性物質發生了熱降解或者轉化。GB/T 39014—2020《生姜精油》對水蒸氣蒸餾法提取生姜精油的特征組分進行了明確,主要有莰烯、姜黃烯、α-姜烯、β-紅沒藥烯,而對于其他方法提取得到的生姜精油尚沒有明確規定。不同提取方法得到的生姜精油的揮發性物質的種類數量存在一定差異。劉紅霞等[26]采用水蒸氣蒸餾法提取云南小黃姜精油,共鑒定出27種化學成分,主要是α-姜烯、β-倍半水芹烯、β-紅沒藥烯、α-姜黃烯等;許舒雯等[27]采用有機溶劑萃取法提取銅陵生姜的揮發油化學成分, 共鑒定出12種主要成分,主要是乙酸香葉酯、α-姜黃烯、姜烯、α-法尼烯、β-甜沒藥烯、β-倍半水芹烯等。這說明不同的提取方法,不同產地的生姜提取生姜精油的揮發性風味物質有所差異,因此在分析鑒定生姜精油中揮發性成分時要充分考慮提取方法、生姜產地對其鑒定結果的影響。