富硒小米蛋白的理化性質、功能特性及結構研究

李琳,金麗娜,郭佩佩,劉敦華,傅婧

(寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川,750021)

小米又稱粟米,禾本科植物,性喜溫暖,適應性強,一年生草本植物,被認為是世界第六大谷物,廣泛種植于亞洲及非洲的干旱和半干旱地區[1]。小米蛋白質含量遠高于其他谷類植物,約占總質量的11%,含人體所需的8種必需氨基酸,其中脯氨酸和天門冬氨酸含量較玉米和大米分別高出40%、55%,可作為優質天然蛋白質的來源之一[2]。硒(Se)是人體不可或缺的微量元素之一,缺硒會導致嚴重的健康問題,如克山病、糖尿病、心血管疾病等。自然界中硒以有機硒與無機硒的形式存在。植物根系吸收土壤中的無機硒,并通過硫同化作用將其轉化為有機形式,所以植物性食物是機體攝入硒的主要來源[3]。SURAI等[4]發現,與有機硒相比,無機硒在動物消化道中的毒性更大,更不易吸收。但目前常見植物性食物中的硒含量并不能滿足人體日常膳食營養需求,天然富硒食品也因此備受青睞[5]。

通過特定富硒土壤種植的小米中有機硒得以富集,有效提高了硒的生物利用度及小米的營養價值。硒在植物中常以硒蛋白的形式存在[6],但對富硒小米蛋白仍缺乏了解,極大地影響其應用價值。研究表明,施硒使花生蛋白質在合成過程中,半胱氨酸和蛋氨酸被硒代氨基酸所取代,造成蛋氨酸和含硫氨基酸的含量[7]較對照組相比呈現相反趨勢;Se可以通過S—S、Se—S和Se—Se鍵與大豆蛋白結合,影響蛋白質的二硫鍵和二級結構[8]。HUANG等[9]對硒生物強化的大豆蛋白進行研究,發現高濃度的硒蛋白其β-折疊增加,無規則卷曲減少,表明蛋白質分子從有序轉變為無序結構,剛性結構減弱,柔性結構增強[10]。蛋白質越柔韌越容易在界面處形成黏彈性的膜,使大豆硒蛋白的起泡性、乳化穩定性等功能特性低于對照組。此外與普通秀珍菇蛋白相比,富硒秀珍菇蛋白二硫鍵含量增加。二硫鍵的增長改變了蛋白質的空間結構,使蛋白質分子間結合更加緊密,結構越穩定,無益于富硒蛋白的持水性持油性[11]。綜上所述,植物中硒的累積過程對蛋白質的組成及結構有顯著影響,而結構的改變可能會影響蛋白質的某些功能特性、理化性質及其在食品加工中的應用。

然而國內外目前對富硒小米蛋白的研究主要集中在抗氧化、抗菌性等生理功能方面,對其理化特性、功能特性及結構研究較少。本文以普通小米蛋白(common millet protein, MP)為對照,研究富硒小米蛋白(selenium-rich millet protein, SMP)的理化性質、功能特性及結構,以期為SMP產品的綜合開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒小米,寧夏興鮮雜糧種植加工基地(有限公司);普通小米,市售;石油醚、NaOH、HCl、磷酸,天津市大茂化學分析廠;考馬斯亮藍G250,北京博奧拓科技有限公司;PAGE凝膠超快速制備試劑盒12.5%,大連美侖生物技術有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

ZK-08A密封型搖擺式粉碎機,北京中科浩宇科技發展有限公司;V-5100型可見分光光度計,南京菲勒儀器有限公司;FD-1A-50真空冷凍干燥機,上海繼譜電子科技有限公司;TDL-5-A型臺式大容量離心機,上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 小米蛋白的提取

參考AKHARUME等[12]的方法并加以改進。將2種小米分別粉碎,過60目篩,室溫下用1∶6(g∶mL)的石油醚,索式抽提4 h脫去脂肪。室溫干燥12 h,于4 ℃冰箱冷藏備用。

準確稱取一定量的脫脂小米粉,按料液比1∶8(g∶mL)加入蒸餾水,攪拌均勻后使用1 mol/L NaOH溶液調節pH 9.5,溫度30 ℃,提取2 h,提取結束后4 000 r/min離心20 min;收集上清液,使用1 mol/L HCl溶液調節pH 4,靜置30 min,5 000 r/min離心15 min,收集沉淀即為蛋白質粗品。冷凍干燥,-20 ℃保存待用。

1.3.2 小米蛋白純度及硒含量的測定

參考SN/T 3926—2014《出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質含量的測定 考馬斯亮藍法》測定蛋白質含量。

牛血清蛋白標準曲線的線性回歸方程為y=0.771 7x+0.077,線性因子R2=0.998 3,說明在0～0.1 mg/mL質量濃度范圍內,牛血清蛋白標準品溶液濃度與其吸光度呈良好的線性關系。

參考GB 5009.268—2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》測定蛋白中的硒含量。

1.3.3 小米蛋白理化性質研究

1.3.3.1 氨基酸含量的測定

準確稱取固體樣品200 mg,加入水解管中。加入6 mol/L HCl溶液10 mL,管中吹入N230 s并密封,置于油浴鍋110 ℃水解24 h。水解結束后待冷卻至室溫,定容至50 mL容量瓶。吸取樣品2 mL,置旋轉蒸發儀45 ℃脫酸,加入2 mL樣品緩沖液充分溶解,通過0.45 μm過濾器過濾后上機分析。

1.3.3.2 SDS-PAGE凝膠電泳

分別取100 μL 10 mg/mL MP、SMP蛋白溶液,加入25 μL SDS-PAGE樣品緩沖液。將樣品溶液于95 ℃水浴加熱5 min后,吸取10 μL上清液開始進樣,在80～100 V電壓下電泳3 h。電泳結束后,用考馬斯亮藍染色處理膠片,脫色,對蛋白質條帶拍照觀察。

1.3.4 小米蛋白功能特性研究

1.3.4.1 溶解度(solubility,PS)

稱取0.1 g MP、SMP蛋白粉末溶于10 mL蒸餾水中,使用電動分散均質機均質2 min后,在4 000 r/min下離心5 min。取上清液1 mL,根據1.3.2節中SN/T 3926—2014《出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質含量的測定 考馬斯亮藍法》測定上清液蛋白質含量。溶解度按公式(1)計算:

式中:A1,樣品中的蛋白質含量,%;A0,上清液中的蛋白質含量,%。

1.3.4.2 持水性(water holding capacity,WA)

參考TABTABAEI 等[13]的方法。稱取0.1 g MP、SMP蛋白粉末,加入1 mL蒸餾水,充分振蕩,混勻后,靜置20 min后,離心15 min,棄去上清液,稱質量,蛋白持水性的計算如公式(2)所示:

式中:m0,樣品的質量,g;m1,離心管和樣品的總質量,g;m2,離心后離心管加沉淀的總質量,g。

1.3.4.3 持油性(oil-holding property,FA)

稱取0.1 g MP、SMP蛋白粉末,加入5 mL大豆油,充分振蕩,混勻后,靜置20 min離心15 min,棄去上層油液,稱質量,蛋白持油性的計算如公式(3)所示:

式中:m0,樣品的質量,g;m1,離心管和樣品的總質量,g;m2,離心后離心管加沉淀的總質量,g。

1.3.4.4 乳化性(emulsification capability,EC)及乳化穩定性(emulsion stability,ES)

參考AKHARUME等[12]方法,稍加修改。將MP、SMP配制成10 g/L的蛋白溶液,取樣品溶液4 mL,加入2 mL大豆油,使用均質機(12 000 r/min)將體系混合均勻,均質后在0和10 min時取底部乳液50 μL,加入1 g/L SDS溶液5 mL,在500 nm處測定吸光度。乳化性和乳化穩定性的計算分別如公式(4)、公式(5)所示:

式中:A0,0 min時蛋白乳化液吸光度;A10,10 min時乳化液吸光度;L,比色皿光程(1 cm);n,溶液稀釋倍數;ρ,蛋白質量濃度,g/100 mL;φ,油相體積分數,25%;Δt,10 min。

1.3.4.5 起泡性(froth capability,FC)及起泡穩定性(froth stability,FS)

取一定量MP、SMP蛋白粉末,用蒸餾水復溶,加入10 mL蒸餾水,在12 000 r/min下高速分散2 min,使溶液均勻起泡,立即測定均質后總體積,靜置30 min再次測定體積。起泡性和起泡性穩定性的計算分別如公式(6)、公式(7)所示:

式中:V0,樣品水溶液的體積,g/mL;V1,樣品均質后的總體積,mL;V2,靜置30 min后的體積,mL。

1.3.5 小米蛋白結構表征

1.3.5.1 掃描電子顯微鏡

采用ZHU等[14]的方法,參數稍加修改。取適量MP、SMP蛋白樣品,噴金導電,在掃描電子顯微鏡上觀察樣品表觀結構,電壓20 kV。

1.3.5.2 傅立葉紅外光譜

參考張紅印[15]的方法,稍加修改。取適量MP、SMP蛋白樣品,與KBr混合并平鋪在壓片機上壓片,將已制備好的KBr薄片在400～4 000 cm-1范圍內掃描,分辨率為16 cm-1。

1.4 數據處理與分析

試驗數據用Excel 2019整理并做標準差;采用SPSS 26進行顯著性分析;Origin 2021b、FeakFit v 4.12等軟件繪圖。每個試驗進行3次重復,結果以平均值±標準差來表示,P<0.05表示為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 富硒小米基本成分分析

由表1可知,由于小米生長受光照、土壤、溫度、氣候等因素的影響,導致2種小米的水分、灰分、脂肪、淀粉等營養成分均存在顯著差異(P<0.05)。除水分外,富硒小米的灰分、淀粉、脂肪、蛋白質含量均高出普通小米,其中蛋白質、硒含量分別高出普通小米1.817個百分點、0.203 mg/kg。這可能是因為在對小米施硒處理時,由于不同品種的小米對硒的富集及轉化能力不同,而硒在轉化過程中取代硫,形成硒代氨基酸化合物,進一步轉運至小米中以硒蛋白的形式儲存在蛋白質中[16],造成硒、蛋白質含量差異(P<0.05)。

表1 兩種小米基本成分分析Table 1 Analysis of basic components of two kinds of millet

2.2 MP/SMP中蛋白質純度及硒含量

由表2可知,使用堿溶酸沉的方法提取小米蛋白、富硒小米蛋白,根據標準曲線計算出,蛋白質純度為48.720%,54.810%;硒含量分別為0.080、0.630 mg/kg。由此可知,蛋白質中的硒含量變化與表1小米中的硒含量基本一致,SMP硒含量較富硒小米高出0.169 mg/kg。張雪莉等[17]對杏鮑菇硒蛋白進行定性與定量分析,發現硒蛋白的硒含量要高于原料,這與本實驗結果相同,且有機硒含量占總硒的94.6%。NIU等[18]研究發現富硒苦麥蛋白中的硒含量占苦蕎總硒的81.58%,進一步說明硒主要與蛋白質結合。

表2 MP/SMP的蛋白質純度及硒含量Table 2 Protein purity and selenium content of MP/SMP

2.3 理化性質分析

2.3.1 氨基酸含量分析

SMP與MP的氨基酸組成及含量見表3。由表可知2種小米蛋白均檢出17種氨基酸且組成相似,其中谷氨酸含量最高,這與大多數植物蛋白中氨基酸組成相同[19]。且對比2種小米蛋白氨基酸含量,其中Met+Cys含量相差最大為1.304 g/100 g。這是由于植物中的硒通過含硫氨基酸的代謝途徑非特異性的將硒代含硫氨基酸結合到蛋白質中,取代含硫氨基酸而產生,從而造成某些含硫氨基酸(Met、Cys)含量發生變化[3]。

與FAO/WHO推薦模式進行對比。如表3所示2種小米蛋白中只有異亮氨酸、蛋氨酸+胱氨酸含量符合FAO/WHO給出的兒童推薦要求,成人推薦要求只有組氨酸沒有達到標準。根據FAO/WHO標準推薦模式,品質良好的蛋白質其EAA/TAA在40%左右,EAA/NEAA在0.6以上[20]。2種小米蛋白中EAA含量豐富,SMP與MP的EAA/TAA分別為53.529%、51.101%,高出FAO/WHO規定標準13.53個百分點、11.101個百分點;EAA/NEAA為1.152、1.045,說明2種小米蛋白均可作為優質蛋白質,且SMP的EAA/TAA與EAA/NEAA的比值較MP高出2.428和0.017個百分點,表現出更高的營養價值。

2.3.2 SDS-PAGE分析

如圖1所示,MP與SMP條帶分布基本一致,在分子質量13～70.2 kDa的范圍內均有存在。高分子質量范圍70.2、43 kDa處有2條清晰的譜帶,低分子質量范圍36.5、28、15.7、14 kDa有4條較弱的譜帶。JHAN等[21]鑒定出3種小米蛋白的分子質量基本分布在12、18、35、43、71 kDa,不同品種間分子質量略有不同,鑒定出的譜帶范圍與本實驗結果基本一致。譜帶顏色深淺不同說明2種小米蛋白在高分子質量范圍內蛋白含量存在差異,當分子質量>70.2 kDa時條帶趨于消失,2種小米蛋白的蛋白質含量相對較少,MP的條帶明顯弱于SMP,說明了SMP的蛋白含量高于MP[22]。研究表明,植物施硒對蛋白質分布不會產生影響,當硒被植物吸收轉運到植株內與果實時,會提高小米籽粒中蛋白質含量,但不會對蛋白質的代謝途徑做出改變,所以不會改變蛋白質的分布[23]。

圖1 SDS-PAGE結果Fig.1 Results of SDS-PAGE

2.4 功能特性分析

2.4.1 pH對MP/SMP功能特性的影響

如圖2所示,隨著pH的增大,MP與SMP的PS、WA、FC及FS、EC均呈現先下降后上升,ES顯現出相反趨勢(P<0.05)。pH值為4時除ES外均達到最低值。當pH值大于6時,MP的溶解性優于SMP。這是因為,在堿性條件下,蛋白結構由緊密變得疏松,次級鍵被破壞,使蛋白質分子表面出現較多相同的電荷,由于靜電斥力和離子水合作用增加,從而使蛋白質PS升高[24]。pH 2時MP的PS與SMP相差20.22%,可能與其等電點較低有關。由于蛋白質的功能特性在很大程度上與PS相關[25],在等電點附近蛋白水化能力較小,僅僅是蛋白質的可溶部分參與泡沫的生成,因此FC較差。在酸性或堿性范圍內,水化能力增強,所以WA、FC與FS都較好。高堿性條件下蛋白質帶負電荷,導致多肽鏈在油水界面上展開與排斥,有利于2種蛋白質的溶解,已溶解的蛋白質能夠快速吸附至油水界面,并且吸附的越多,乳狀液界面積越大,EC越好[26]。李丹丹等[27]和JHAN等[21]分別對水溶性蠶繭蛋白和納米蛋白的功能特性進行研究,發現ES與EC趨勢相反則有可能是因為隨著pH的增大,蛋白表面電荷的增加破壞了界面蛋白膜的黏合性,導致油聚結率提高,ES下降。

a-溶解度;b-持水性;c-起泡性;d-泡沫穩定性;e-乳化性;f-乳化穩定性圖2 pH對MP/SMP功能特性的影響Fig.2 Effect of pH on the functional properties of MP/SMP 注:同種小米蛋白不同處理方式的顯著性差異用小寫字母表示,同種處理方式不同小米蛋白的顯著性差異用大寫字母表示(P<0.05)(下同)。

2.4.2 溫度對MP/SMP功能特性的影響

如圖3所示,溫度對2種小米蛋白功能特性的影響一致,呈現先上升后下降的趨勢(P<0.05)。其中SMP的功能特性均低于MP。劉思杉等[11]對富硒、富鋅秀珍菇蛋白的功能特性進行研究,發現經過硒處理的樣品功能特性低于對照組,這與本實驗結果一致。這是因為小米經過硒處理,使蛋白質結構更加穩定,不易溶于水,導致蛋白質PS、WA等特性低于MP。當MP的溫度為50 ℃時,PS達到最大值59.667%;SMP溫度為60 ℃時,PS達到最大值25.849%;這是由于升高溫度使蛋白質分子的立體結構伸展,有利于蛋白質分子與水分子的相互作用,起到了增溶的效果[28]。當溫度繼續升高,會導致蛋白質變性,在此狀態下,PS受蛋白質-水的相互作用,影響了多肽鏈二級和三級結構的結合,導致PS降低[29]。

當溫度為60～70 ℃時,MP、SMP的WA最高,分別為5.62、4.84 g/g;FA在60 ℃時最大。繼續升溫導致蛋白的變性和聚集現象的發生,蛋白表面積減少,極性分子對水的結合力降低,因此WA下降;在油水界面加熱處理會形成脂質-蛋白質絡合物[30],油的流動性增大,黏度減小,削弱了蛋白質與油的相互作用,降低了蛋白質的FA。

對于FS來說,當溫度達到70～80 ℃時,泡沫基本全部消失。這可能是過熱損害了蛋白質的起泡能力,導致熱變性聚合形成了大分子不可溶性聚體,不易在氣-水界面擴展和吸附,從而降低了蛋白質的FC。KAUR等[31]認為高起泡穩定性通常要求蛋白具有適當的表面活性特性和在界面處足夠的分子間相互作用,而加熱導致空氣膨脹,黏性降低,氣泡破裂,因此穩定性下降;當溫度達到50與60 ℃時,SMP與MP的EC分別達到最大值10.624%、12.897%;在40與50 ℃時,ES達到最大值41.190%、53.939%。溫度上升,隨著蛋白分子鏈收縮折疊狀態的轉變,分子表面的疏水基團向內部轉移,從而降低了蛋白質的EC。蛋白質的功能特性有助于產品的加工,是產品性能的基礎,雖然SMP的功能特性低于MP,但是不可忽略其作為一種天然硒補充劑的應用價值。

a-溶解度;b-持水性;c-持油性;d-起泡性;e-泡沫穩定性;f-乳化性;g-乳化穩定性圖3 溫度對MP/SMP功能特性的影響Fig.3 Effect of temperature on the functional characteristics of MP/SMP

2.5 小米蛋白的結構表征

2.5.1 掃描電鏡分析

利用掃描電鏡放大2 000倍、5 000倍分別觀察MP與SMP的微觀結構,2種小米蛋白的表面形態如圖4所示。SMP表面光滑,蛋白聚集度高,呈現致密均勻無孔狀結構。與SMP相比MP表面粗糙,蛋白表面有較多分布不均,大小不一的凸起。

2.5.2 傅立葉紅外光譜分析

a、b-MP;c、d-SMP圖4 MP/SMP掃描電鏡圖Fig.4 MP/SMP scanning electron microscope image

由于酰胺Ⅰ帶中具有豐富的二級結構信息,對酰胺Ⅰ帶進行峰形擬合和面積計算后各二級結構的相對百分比結果如圖5-b、圖5-c所示,MP經二階擬合得到10個峰,SMP得到7個峰,兩者相比,SMP峰值明顯發生了偏移。各二級結構組分含量如表4所示,SMP的α-螺旋、β-轉角、β-折疊3種結構明顯比MP分別高出5.532、5.506、2.885個百分點,而SMP的無規則卷曲含量則為0,這與MP二階導數擬合圖相符,這也說明SMP的有序性優于MP[34]。這與2.5.1節的掃描電鏡分析結果相互印證。此外,有研究表明高比例的無規則卷曲一定程度上會提高蛋白質的PS,從側面證明了MP與SMP的PS差異[35]。

a-MP/SMP傅立葉紅外光譜圖;b-MP二階導數擬合圖;c-SMP二階導數擬合圖圖5 MP/SMP 傅立葉紅外光譜圖及二階導數擬合圖Fig.5 MP/SMP FTIR spectra and second-order derivative fit

表4 MP/SMP二級結構含量Table 4 MP/SMP secondary structure content

3 結論

通過對富硒小米和普通小米基本成分分析,富硒小米水分含量低于普通小米,灰分、淀粉、脂肪、蛋白質和硒含量等指標均高于普通小米。MP與SMP共檢出17種氨基酸,其中SMP的營養價值更高。從SDS-PAGE圖像觀察2種蛋白條帶基本相同。研究了pH、溫度對蛋白質功能特性的影響得出以下結論:當pH升高,2種小米蛋白都呈現先下降后升高的趨勢,ES則相反呈現先上升后下降的趨勢。溫度上升2種小米蛋白的PS、WA、FA、EC、ES、FC、FS趨勢一致,均呈現先上升后下降的趨勢(P<0.05)。SEM呈現出SMP表面光滑,MP表面呈現溝壑狀;FT-IR對比其二級結構,MP結構與SMP相比更為無序,因此在一定程度上影響了蛋白質的功能特性。綜上所述,富硒小米蛋白質具有一定的工業應用前景,本研究結果為天然富硒食品的開發及加工提供了重要依據。