少動鞘氨醇單胞菌合成結冷膠研究進展

鄭麗圓,李宛瑩,喻林兵,夏永軍,艾連中,熊智強

(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海食品微生物工程研究中心,上海,200093)

結冷膠最初被稱為多糖S-60,是少動鞘氨醇單胞菌(舊名為Sphingomonaselodea和Pseudomonaselodea)發酵所產胞外多糖[1]。結冷膠是近年來在食品領域中應用最廣泛的凝膠劑之一,1992年美國食品和藥品管理局批準其作為凝膠劑、懸浮劑和穩定劑應用于食品和化妝品工業,1996年我國批準其作為食品添加劑[2]。結冷膠能在冷、熱條件下形成熱可逆水凝膠[3],在食品中使用量一般為0.1%～0.3%,只需0.25%的用量即可達到瓊脂1.5%的凝膠強度。在食品工業中,結冷膠作為穩定劑用于乳液凝膠,在連續相和油水界面處形成網絡結構[4-5],結冷膠可應用于多種類型的果凍、布丁等凝膠性食品的加工[6-8],在飲料中使用也能有效防止不溶物沉淀產生[9]。結冷膠在醫療領域可作為新型材料用于軟骨組織再生[10-12],也可作為藥物遞送載體用于鼻、眼、胃和結腸給藥[13-14]。在個人護理領域中應用于面膜、沐浴露和噴霧等產品。在化工領域結冷膠作為抗溶脹黏土穩定劑廣泛用于石油開采[15]。在農業領域結冷膠復合水凝膠顯示出高保水性,可控制肥料的釋放[16]。GAMAL等[17]學者率先對結冷膠生物合成途徑和代謝調控進行研究,參與合成部分基因已克隆測序,為其代謝調控提供方向,但目前對結冷膠合成調控機制尚未完全解析[18-21]。本文主要從結冷膠生物合成途徑和代謝調控進行綜述,以期加深對結冷膠生物合成的認識,為構建產結冷膠工程菌株提供新思路。

1 結冷膠的組成和結構

結冷膠分子骨架由β(1→3)-D-葡萄糖、β(1→4)-D-葡萄糖醛酸、β(1→4)-D-葡萄糖和α(1→4)-L-鼠李糖線性四糖重復單元組成,按摩爾比1∶1∶1∶1聚合,分子質量約為5×105Da[22-23]。結冷膠存在兩種形式:高?；Y冷膠(也稱天然結冷膠)和低?；Y冷膠(也稱脫?；Y冷膠)。高?；Y冷膠在第一個葡萄糖基的C-3位置上為甘油酯基,在同一葡萄糖基的C-6位置上為乙?；?圖1),每重復單元有1 mol甘油酯基和0.5 mol乙?；鵞24]。高?；Y冷膠因含有豐富的?；?形成的凝膠富有彈性且較柔軟,與黃原膠和刺槐豆膠性能相似,適合做增稠劑[25]。高?；Y冷膠通過熱堿處理,可除去甘油酯基和乙?；?獲得低?；Y冷膠。低?；Y冷膠在冷熱水中均溶解,加入陽離子可形成強度大、堅硬但易脆裂并具有更高熱穩定性的凝膠[26-27]。二價陽離子(Ca2+和Mg2+)比一價陽離子(Na+和K+)更有效地促進膠凝,結冷膠在Ca2+存在下形成最穩定的凝膠[28]。不同化學結構決定高?；偷王；Y冷膠性能上的差異,結冷膠在溶液狀態下冷卻時形成的有序形式是雙鏈螺旋結構[29]。低?；Y冷膠多糖鏈之間平行排列成為半交錯互相纏繞的雙螺旋結構,而高?；Y冷膠的分子則呈內卷曲折疊結構。

2 結冷膠的生物合成途徑

少動鞘氨醇單胞菌基因組大小約為4.12 Mb,GC含量為67.4%。結冷膠生物合成基因簇主要分布在基因組的3個區域(圖2-a),彼此互不相連。Ⅰ區從gelQ到orf302共19個基因,22 021 bp;Ⅲ區為gelA單個基因,2 391 bp;Ⅳ區從gelR到gelG共3個基因,5 009 bp。Ⅰ區和Ⅳ區間隔2 180 kbp,Ⅳ區和Ⅲ區間隔1 035 kbp。此外,參與糖前體合成的基因pgmG、ugpG和ugdG位于基因組上其他位置。結冷膠生物合成途徑共分為3步(圖2-b):a)核苷酸糖前體合成;b)四糖重復單元組裝;c)重復單元的聚合和輸出[20]。

圖1 結冷膠的重復單元Fig.1 Repeated units of gellan gum

a-結冷膠組裝模型;b-結冷膠生物合成和裝配的模式圖2 結冷膠生物合成途徑Fig.2 The biosynthetic pathway of gellan gum

2.1 核苷酸-糖前體的生物合成

結冷膠生物合成途徑從糖核苷酸前體開始,該前體包括UDP-D-葡萄糖、UDP-D-葡糖醛酸和dTDP-L-鼠李糖(圖3)。葡萄糖-1-磷酸是UDP-D-葡萄糖醛酸和dTDP-L-鼠李糖合成的底物,由磷酸甘露糖變位酶/磷酸葡萄糖變位酶(phosphomannomutase/phosphoglucomutase,PMM/PgmG)催化形成,PgmG催化葡萄糖-1-磷酸比甘露糖-1-磷酸的效率(Kcat/Km)高約15倍[30]。合成葡萄糖-1-磷酸后,UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UgpG)催化葡萄糖-1-磷酸可逆轉化為UDP-D-葡萄糖[31];UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-glucose dehydrogenase,UgdG)將UDP-D-葡萄糖轉化為UDP-D-葡萄糖醛酸[32]。TDP-葡萄糖焦磷酸化酶(dTDP-D-glucose pyrophosphorylase,RmlA)將葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸轉化為TDP-D-葡萄糖,再經過dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶(dTDP-D-glucose 4,6-dehydratase,RmlB)、dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖異構酶(dTDP-4 dehydrorhamnose 3,5 epimerase,RmlC)和dTDP-6-脫氧鼠李糖脫氫酶(dTDP-4 dehydrorhamnose reductase,RmlD)催化形成dTDP-L-鼠李糖。

PgmG:磷酸葡萄糖變位酶圖3 結冷膠的核苷酸-糖前體生物合成Fig.3 Biosynthesis of nucleotide-sugar precursors of gellan gum

2.2 四糖重復單元的合成

在糖基轉移酶作用下將糖核苷酸前體轉移至活化的C55-異戊二烯磷酸酯脂質載體,參與此過程的基因主要包括gelQ、gelK、gelL和gelB[33](圖2-a)。GelB與少動鞘氨醇單胞菌ATCC 31554的糖基轉移酶SpsB同源,推測可將葡萄糖-1-磷酸從UDP-葡萄糖轉移到脂質載體上。GelK具有糖基轉移酶活性,能催化葡萄糖醛酸連接到脂質載體相連的第一個葡萄糖上[34]。四糖單元組裝所需的另外兩種糖基轉移酶可能為GelL和GelQ,推測分別參與UDP-葡萄糖和dTDP-L-鼠李糖的添加。

2.3 結冷膠重復單元的聚合和輸出

多糖生物合成下一步是重復單元的聚合并形成長鏈,GelS、GelG、GelC、GelE和GelD參與結冷膠的聚合和輸出。結冷膠聚合反應機制推測是Wzy依賴途徑(Wzy-dependent pathway),每個四糖重復單元通過轉運蛋白Wzx從內膜轉移至周質空間,然后通過聚合酶Wzy聚合形成一個長鏈聚合物。GelS與轉運蛋白Wzx同源,預測含10個跨膜結構域,可能與多糖鏈轉運相關[35]。GelG與聚合酶Wzy具有同源性,是一種位于質膜上的整合蛋白,有假定聚合酶特征,推測GelG參與多糖聚合[21]。多糖共聚酶(polysaccharide co-polymerase,PCP)蛋白家族控制合成多糖鏈長,GelC和GelE預測為PCP,與野生型菌株相比,缺失GelC和GelE的突變體顯示出非黏液表型,表明兩者控制多糖鏈長。多糖轉運至膜外需要外膜輔助家族蛋白(outer membrane auxiliary,OMA)介導形成的蛋白質通道,多糖經此通道輸出至細胞膜外。GelD與OMA外膜蛋白同源,GelD缺失顯著降低結冷膠產量,因此推測GelD起結冷膠轉運的功能。第Ⅲ區由雙組分調節蛋白GelA組成,含組氨酸蛋白激酶和響應調節蛋白同源區域,是結冷膠生物合成的正調節因子。GelA突變體在液體培養基中產生少量多糖,推測該蛋白可感知環境變化,在碳源豐富的條件下啟動結冷膠生產[20]。

結冷膠生物合成基因簇部分基因得到表征,但仍有一些基因未證實功能。研究發現,GelF中的突變可能是致命的,推測形成脂質連接中間體的第一步如果被阻斷,會損害細胞壁合成,或者是突變對下游基因產生極性效應,影響細胞存活。GelI突變會影響結冷膠的產量,但不會影響其組成。GelI與參與周質或外膜蛋白質折疊的肽基脯氨酰順反異構酶有弱同源性,推測GelI可能參與蛋白質加工和結冷膠的分泌。GelM和GelN的缺失導致結冷膠產量減少和黏度降低,但不影響其組成,表明這些蛋白質可能影響結冷膠的鏈長和分泌。AtrD和AtrB與I型分泌系統的ABC轉運蛋白顯示出同源性,ABC轉運蛋白可通過內膜輸出胞外多糖,也可能決定胞外多糖鏈長[36]。但AtrD和AtrB的突變沒有影響結冷膠的合成,其在結冷膠生產中的作用未知[37]。

3 結冷膠生產菌株的代謝調控

3.1 敲除旁支途徑相關基因

糖核苷酸前體合成是結冷膠生物合成的重要步驟,葡萄糖-6-磷酸不僅在PGM催化下生成葡萄糖-1-磷酸,繼而合成結冷膠糖核苷酸前體,還在磷酸葡萄糖脫氫酶(Zwf)催化下生成6-磷酸葡萄糖酸酯,參與磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP途徑)。VARTAK等[38]無效突變Zwf,期望使碳通量轉移到結冷膠合成中,但結冷膠產量并無改變,可能是在zwf突變株中,葡萄糖通過涉及葡萄糖酸激酶的途徑被利用,轉化為6-磷酸葡萄糖酸酯進入PPP途徑。

結冷膠發酵生產中會積累大量代謝副產物類胡蘿卜素和聚β-羥丁酸(poly-β-hydroxybutyric acid,PHB),類胡蘿卜素使發酵液呈黃色,影響產品的透明度,PHB使發酵液濁度增加。葡萄糖-6-磷酸經糖酵解途徑轉化為甘油醛-3-磷酸后,催化生成乙酰輔酶A,PHB生物合成途徑始于乙酰輔酶A,類胡蘿卜素生物合成始于3-磷酸-甘油醛。為使葡萄糖-6-磷酸更集中流向合成葡萄糖-1-磷酸,LI等[39]和ZHU等[40]敲除類胡蘿卜素生物合成途徑中的八氫番茄紅素去飽和酶基因crtl和編碼PHB合酶的phaC基因,以期結冷膠產量增加,減少副產物合成降低生產成本;結果顯示,crtI突變體盡管菌落形態與野生型菌株接近,但菌落呈白色,而野生型菌落呈黃色。ΔphaCΔcrtI雙敲除突變體的多糖產量顯著下降,推測雙敲除突變體中PHB合成途徑的阻斷可能會影響整個葡萄糖代謝網絡,導致代謝中間體包括丙酮酸等有機酸的積累,對結冷膠生產造成不利影響[28]。此外,類胡蘿卜素和PHB合成過程部分途徑如乙酰輔酶A在酶催化下生成3-羥基丁酰輔酶A是NADP(H)依賴性反應,阻斷PHB合成可能會破壞整個代謝網絡中NADPH和NADP+平衡,導致結冷膠產量降低。

3.2 增加合成途徑相關基因的表達

PgmG催化葡萄糖-6-磷酸形成葡萄糖-1-磷酸,UgpG直接參與催化生成UDP-葡萄糖,并間接參與另一結冷膠糖核苷酸前體UDP-葡萄糖醛酸的形成(圖3)。研究表明,ugpG、pgmG和gelK基因單獨過表達盡管導致其編碼的酶活性增加,但對結冷膠合成并無顯著影響,而共表達gelK和pgmG使結冷膠合成提升20%,黏度增加[41],推測單獨過表達PgmG雖然能提高糖核苷酸前體供給,但多糖重復單元組裝成為限制步驟,而共表達GelK和PgmG使糖核苷酸前體更高效的轉移至脂質載體進而合成結冷膠。在鞘氨醇單胞菌S7中單獨過表達pgmG,共表達pgmG和S7c6(spsGQIKLFDCEBrhsACB)也有類似的結果,單獨過表達pgmG對S-7多糖合成沒有顯著影響,但共表達pgmG和S7c6使發酵液黏度增加40%(30 000 Pa·s),產量提高10%[42]。spsGQIKLFDCEB編碼S-7多糖合成基因簇中4種糖基轉移酶和分泌蛋白,rhsACB負責鼠李糖合成。黏度增加40%可能是由于S7c6片段缺少編碼連接兩個側鏈葡萄糖殘基的糖基轉移酶,缺乏側鏈的聚合物積累使發酵液黏度大幅增加,導致工程菌氧氣利用率降低,S-7多糖產量僅提升10%。

參考相關文獻對少動鞘氨醇單胞菌合成結冷膠的代謝調控進行歸納總結,如表2所示。GelD負責將結冷膠轉運到胞外,過表達gelD工程菌結冷膠產量約為野生型的兩倍,高達12.46 g/L[43],推測GelD是影響結冷膠分泌到胞外的關鍵酶。分別使用載體pBBR122克隆少動鞘氨醇結冷膠生物合成基因gelQ、gelB、gelL和gelK,其中gelQ工程菌結冷膠產量是野生型兩倍[44]。GelQ是結冷膠四糖重復單元組裝的最后環節,參與dTDP-L-鼠李糖的添加,推測其為限制結冷膠四糖重復單元組裝的關鍵步驟。LEE等[45]分別過表達結冷膠合成途徑中的gelN和gelA基因,工程菌表型更黏稠,結冷膠產量分別增加48.3%和21.2%。GelA為雙組分調節蛋白,GelA過表達導致胞外多糖轉運蛋白、糖結合輸出蛋白和雙組分系統調節蛋白表達分別上調3.61、2.57和2.11倍,而糖差向異構酶下調2.1倍,糖單元差向異構化可能改變多糖的理化性質,該蛋白下調可能使工程菌環境適應能力增強。過表達GelN導致甘露糖-1-磷酸鳥苷基轉移酶/甘露糖-6-磷酸異構酶和總分泌蛋白L表達分別上調2.7和3.23倍,推測GelN與甘露糖向三磷酸鳥苷的轉移和促進結冷膠分泌有關;共表達GelA和GelN可能影響結冷膠合成與輸出的相關步驟,保障結冷膠的生物合成和分泌。

表2 少動鞘氨醇單胞菌合成結冷膠的代謝調控Table 2 Metabolic regulation of gellan gum biosynthesis

4 結論與展望

目前對結冷膠生物合成基因簇的研究僅能推測核苷酸糖前體的組成和重復單元的組裝模式,但四糖重復單元組裝的生化等實驗研究相對較少。參與結冷膠生物合成的基因多達26個,但結冷膠生產菌株的代謝調控目前僅限于少數基因的過表達或敲除。因此,結冷膠生物合成機制解析和結冷膠高產菌株構建工作未來可開展下列研究:1)缺少高效的遺傳操作工具限制了少動鞘氨醇單胞菌基因編輯,可建立CRISPR等新一代基因修飾系統全面解析結冷膠生物合成中各基因的具體功能和調控機制;2)結冷膠四糖重復單元組裝時甘油酯基在酶的作用下轉移到多糖鏈上,不同?；繒绊懡Y冷膠的特性,甘油酯基會引起結冷膠脫?；瘯r顯著的流變學變化,而編碼甘油?；D移酶的基因還尚未闡明,后續在基因功能解析基礎上可通過基因工程手段調控甘油?；D移酶來控制結冷膠?；?3)由于目前對鞘氨醇單胞菌合成結冷膠的生物途徑認識還不夠清晰,可在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母等遺傳背景清晰的宿主中,通過構建cosmid文庫、TAR克隆技術、Rec/ET同源重組技術等異源表達結冷膠基因簇,避開原始宿主中復雜調控網絡的緊密控制,探究結冷膠生物合成的最簡模塊和調控機制;4)通過開發誘導調控元件,對代謝途徑代謝網絡節點關鍵酶基因進行動態調控,快速響應細胞外環境及細胞內代謝物濃度變化,實現結冷膠高效合成。結冷膠生物合成途徑的深入研究,將為基因工程和代謝工程等方法促進結冷膠合成提供理論基礎,也將推動利用分子生物學技術開發具有不同結構和物理性質的新型結冷膠多糖。