γ-谷氨酰轉肽酶的催化特性及其在食品領域應用研究進展

張柯銘,羅茜,魏夏森,萬嗣寶,高海燕,秦臻

(上海大學 生命科學學院,上海 200444)

γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyl-transpeptidase, GGT, EC 2.3.2.2)屬于N-端親核氨基水解酶類(N-terminal nucleophile aminohydrolases superfamily),廣泛存在于動物、植物和微生物等生物體中,具有高度保守性。GGT一般以異源二聚體的形式在生物體內發揮作用,其特異性作用于γ位肽鍵,能夠催化斷裂γ-谷氨?；衔镏械墓劝滨０锋I,并將γ-谷氨?；D移到其他受體(如氨基酸、肽、胺等)上。由于GGT催化專一性強且不消耗ATP,在食品功能因子綠色生物制造領域具備突出優勢。目前,GGT已在合成茶氨酸等各種生物活性γ-谷氨?；衔锓矫骘@示出較大的工業應用潛力。本文主要綜述了GGT的分子結構、催化特性及其在食品工業領域應用的研究進展。

1 GGT的來源和分布

GGT作為一種重要的生物體內代謝酶,分布較為廣泛。其中哺乳動物GGT在谷胱甘肽(L-glutathione,GSH)代謝和γ-谷氨?；h中起著重要作用,被認為是人體許多生理疾病的診斷標志物。在酶工程應用領域,目前已報道的GGT催化功能及應用研究以微生物源最為多見,對于結構與功能研究較多的是來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)[1]和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的GGT[2]。此外,一些地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)[3-4]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[5-6]和幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)[7]等微生物來源的GGT也具有一定的應用潛力。

GGT的分布在真核生物與原核生物體內具有一定差異性。真核生物中,GGT通常被糖類物質修飾形成糖蛋白,分布于質膜,其活性位點位于質膜外部。例如,在人體和其他一些高等哺乳動物中,GGT主要結合于腎、胰、肝、脾和小腸等組織的微絨毛膜上,其中腎臟GGT含量最高[8];在昆蟲體內GGT則主要結合在線粒體膜上。而原核生物中,GGT通常是一種以可溶性形式表達的非糖基化蛋白,其分布位置因其所屬菌屬而異,主要以游離態存在,通過N端信號肽定位于細胞周質空間或分泌到細胞外。如大腸桿菌GGT一般是周質空間蛋白質,而芽孢桿菌GGT基本全部分泌到細胞外,屬于胞外酶[9]。因此原核生物來源的GGT更易于酶的分離純化和大規模提取制備,在食品工業中主要利用微生物來源的GGT進行茶氨酸等γ-谷氨?；衔锏拇呋铣裳芯考皯?。

2 GGT的結構及催化機制

2.1 GGT前體自催化裂解成熟機制

目前已報道的GGT蛋白質晶體結構研究表明,不同來源的GGT分子結構總體保守,屬于N末端親核水解酶超家族[10]。該超家族成員具有一個共同特點,其基因先經過轉錄和翻譯生成無活性前體蛋白,由活化的N端絲氨酸或蘇氨酸進行自催化裂解后才能產生相應的酶活力。

HASHIMOTO等[11]對大腸桿菌GGT的定位進行分析,發現在細胞周質空間中僅含成熟形式GGT,細胞質膜中只含有其前體,細胞質中不存在前體。這表明GGT成熟過程中存在蛋白水解過程。如圖1所示,GGT由單個基因編碼合成為一條多肽鏈,其N端帶有引導蛋白分泌至細胞外的信號肽序列。GGT前體形成后首先結合至細胞質膜,在信號肽引導下從膜上釋放并定位到周質空間,隨后信號肽被酶切割去除,前體再經過自催化反應形成具有活性的成熟酶。GGT前體本身具有催化該自剪切反應的活性中心,無需其他催化劑,催化的關鍵氨基酸為小亞基N端高度保守的蘇氨酸,前體蛋白水解成為二聚體,得到的C端和N端分別形成大亞基和小亞基,其中該蘇氨酸殘基成為小亞基的N端殘基,成為后續酶促反應的活性中心(親核試劑)[12]。

圖1 GGT的兩步成熟機制Fig.1 Two-step maturation mechanism of GGT

2.2 成熟GGT的分子結構

成熟GGT在微生物體內以異二聚體酶的形式發揮作用。根據已報道的GGT晶體結構[13-15],GGT整體結構類似于腎形,具有4層夾心(α/β/β/α)的核心結構,來自大小2個亞基的β鏈反向平行排列形成位于α-螺旋層之間的β-折疊夾心層,如圖2所示。該核心結構在N-端親核水解酶超家族成員中是保守的。在β折疊下方有一個淺槽區域,其中的活性中心包含能夠與半胱氨?；?、甘氨?；挺?谷氨?；Y合的3個亞位點。前兩者結合位點決定該酶的反應受體只能是L-氨基酸或二肽,進一步證實不同來源的GGT具有相似的催化特性和底物特異性,其只對含γ-谷氨酰殘基的化合物有光學和立體專一性催化作用[16]。

a-前體;b-成熟圖2 枯草芽孢桿菌來源BsGGT的前體和成熟形式示意圖Fig.2 Schematic diagram of precursor and mature forms of BsGGT 注:B中大亞基以紫色標識,小亞基以黃色標識。

位于底物結合口袋底部的γ-谷氨?；Y合位點如圖3所示,GGT發揮催化活性所必需的氨基酸殘基在微生物和哺乳動物中高度保守。

圖3 E.coli GGT的γ-谷氨?；Y合位點[17]Fig.3 The γ-glutamyl binding sites of E.coli GGT[17] 注:T391為活性中心(Helicobacter pylori GGT中為T380,Bacillus licheniformis GGT中為T399);G483和G484有助于形成氧陰離子空穴;R114、S462、S463、T409、N411、Q430、D433等參與γ-谷氨酰底物的識別與結合(除R114外,所有參與γ-谷氨酰結合的殘基都屬于 小亞基)。

小亞基N端高度保守的蘇基酸殘基除了負責前體蛋白自催化水解外,也是GGT催化反應中作為親核試劑進攻底物的關鍵催化位點[17]。

根據活性中心是否存在蓋環(lid-loop)結構序列,可以將GGT分為帶有“活性開關裝置”和“開放式”活性中心兩類,如圖4所示。

來自真核生物和革蘭氏陰性菌為蓋環陽性GGT;來自芽孢桿菌、古生菌和極端微生物的為蓋環陰性GGT[19]。蓋環的存在與否與組成差異影響催化反應的底物結合及反應速率。在GGT催化反應過程中,蓋環作為底物和產物進出的開關,能夠根據分子大小影響供體底物的選擇[20];同時其將活性中心與外部環境隔離,使γ-谷氨酰酶中間體免受大體積溶劑分子攻擊,從而抑制水解反應,有利于轉肽反應發生[21]。此外,蓋環中芳香殘基等性質差異影響其流動性和轉肽反應速率,如哺乳動物GGT的酶活力高于原核生物來源GGT[22]。而無蓋環GGT活性中心開放,其底物結合口袋暴露于溶劑中,更利于催化大型聚合物底物的水解[23]。GGT蓋環結構與功能研究有助于結合目標反應底物對不同來源GGT進行篩選,同時也為理性設計具有特異性催化活性的GGT突變體提供了參考。

2.3 GGT的催化機制

雖然不同來源GGT的分子結構較為保守,但不同生物體來源的GGT之間仍存在一定的底物特異性等催化功能差異。例如,所有GGT都對γ-谷氨酰供體化合物的構型表現出寬松的立體特異性,可以接受L-型和D-型的γ-谷氨酰衍生物[21]。哺乳動物及大腸桿菌GGT對L-氨基酸受體表現出嚴格的立體特異性,而枯草芽孢桿菌GGT具有更廣泛的底物立體特異性。與哺乳動物GGT不同,微生物GGT傾向于接受谷氨酰胺作為供體底物。

如圖5所示,GGT的催化反應是基于γ-谷氨?；鶊F從供體底物向受體底物的轉移過程。催化反應遵循兩步進行:1)GGT小亞基N端蘇氨酸的γ位氧原子進攻γ-谷氨?；衔锏聂驶荚?與其共價連接形成γ-谷氨酰-酶中間體;2)γ-谷氨酰受體作為親核試劑進入活性中心,進攻中間體的羰基,斷鍵生成新的γ-谷氨?；衔?同時釋放酶。實驗結果表明,反應的第二步即中間體的水解,比第一反應步驟更慢[17],為催化反應的限速步驟。

圖5 GGT催化機制示意圖Fig.5 Schematic diagram of the GGT catalytic mechanism

根據受體的不同,GGT可以催化3類反應:

1)轉肽反應:當氨基酸和短肽作為γ-谷氨酰胺受體時,GGT催化轉移GSH等γ-谷氨?；衔锏摩?谷氨?；?形成新的γ-谷氨?；衔?。方程式為γ-Glu-R+R′H→γ-Glu-R′+AH。

3 GGT的分子改造

目前針對GGT的研究主要側重于酶的克隆、表達、結構分析和應用,對其有關應用的酶學性質及酶分子改造研究尚有待進一步開展。已有研究表明GGT的關鍵氨基酸殘基對于高效率發揮轉肽作用至關重要,對其關鍵位點進行優化改造是提高酶的催化效率的重要手段。通過分子改造技術對野生GGT進行理性設計改造,突破上述瓶頸對GGT作為生物催化劑的工業化應用具有重要意義。

對酶的分子改造主要有2種途徑:理性設計與定向進化。理性設計基于酶結構與催化功能之間的關系,將經過分析、改造的GGT基因在大腸桿菌或枯草芽孢桿菌等宿主中重組表達,從而提高酶的催化活性、底物適應性、耐熱性或穩定性等催化特性。定向進化法則通過模擬自然進化機制,無需提前了解酶的空間結構及催化機理,通過引入隨機突變,同時結合高通量篩選技術以確定進化方向,從而實現酶的體外改造。近年來,為更好地滿足GGT工業化生產應用需求,研究者們一直致力于提高GGT的表達量以及催化效率(表1)。鑒于GGT催化機制的保守性,現有研究結果可為GGT的進一步酶工程改造提供參考思路,從而為酶法合成茶氨酸等γ-谷氨?；衔锾峁┬阅軆灹?、具有工業應用價值的生物催化劑。

目前,結構生物學研究已經解析了GGT供體結合位點的詳細空間細節,但受體結合位點的氨基酸殘基鑒定仍不明確。因此未來應進一步嘗試在受體底物存在的情況下進行共結晶研究,以明確有關受體結合位點空間構造及氨基酸殘基信息。此外,目前有關GGT的定點突變研究主要集中在具有重要催化作用的小亞基氨基酸殘基上,為更好地理解GGT結構與功能關系、對GGT進行針對性的分子改造,未來還需要對這些突變體的蛋白質結構進行解析。

4 GGT的酶學特性

盡管具有相似的催化功能,由于不同來源的酶在蛋白質序列、空間構象以及在生物體內的分布等方面存在差異,導致其酶學特性也表現出一定差異。通過反應條件優化(供體/受體比、pH、時間、溫度和酶量),可以選擇性地增強GGT的活性。

不同來源的GGT催化反應時所需的最適pH不同。真核生物GGT催化所需的最適pH值為8.0～11.0。原核生物中,芽孢桿菌屬GGT最適pH值為7.0～10.0[32]。此外,GGT 在反應體系中的催化反應類型也受環境pH值影響,通常酸性或中性條件(pH 6～8)利于水解反應;堿性條件(pH 8～9)下具有較高的催化轉肽反應活性,其中原核生物來源GGT催化轉肽反應的pH值范圍相對較寬,為6.0～10.5[33]。催化轉肽反應合成γ-谷氨?；衔飼r,GGT在pH>9.0條件下仍能保持酶活性,且可有效抑制水解反應[8],提高轉肽反應效率。因此可以通過調節反應體系的pH值使酶進行選擇性催化,也可以根據不同酶的pH穩定性選擇特定耐酸或耐堿的酶種。但KEILLOR等[34]發現在堿性條件下利用GGT催化轉肽反應時還存在自轉肽反應,對產量和純度造成不良影響。因此在GGT工業化進程中,設法降低自轉肽反應發生率和提升轉肽效率是提高產量的關鍵問題。

不同來源的GGT最適反應溫度和對溫度的耐受性存在差異,微生物來源GGT的最適催化溫度范圍為37～60 ℃。房鑫等[35]通過比較大腸桿菌和枯草芽孢桿菌GGT熱穩定性差異,發現大腸桿菌GGT由于存在大量疏水鍵維持其多亞基四級結構,在低溫條件下具有更高的穩定性;而在高溫條件下,二級結構的改變導致其酶活性低于枯草芽孢桿菌GGT。

此外金屬離子及鹽濃度對GGT活性也有一定的影響。金屬離子的加入會使溶液離子強度產生不同程度的變化,影響蛋白質鏈上氨基酸的電離,從而改變蛋白質的高級結構,部分金屬離子甚至會影響酶活性中心的空間結構。對地衣芽孢桿菌C12菌株GGT的實驗表明[8],在金屬離子濃度為5 mmol/L的條件下,Ba2 +、Mg2+、Ca2+能夠促進酶活力,但一價金屬離子K+和Na+以及三價金屬離子Al3+的加入對酶活力有一定的抑制作用。KIMANI等[32]對枯草芽孢桿菌168同源過量表達得到的GGT進行分析,證明Cu2+和Zn2+對GGT活力具有明顯抑制作用,NH4+有顯著促進作用,同時首次發現鑭系元素(La3+)對GGT活力具有促進作用。LIN等[31]發現CoCl2最終濃度為1 mmol/L時對酶活性沒有影響,而Hg2+、Zn2+、Pb2+、Ni2+離子的氯化鹽對GGT活性有抑制作用。Mg2+、K+、Na+離子的氯化鹽對酶活性有很強的增強作用,特別是當這些離子的濃度超過10 mmol/L時。

一些微生物來源的GGT具有較強的耐鹽性,如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌來源的BsGT和BlGT。BsGT耐鹽機制可能是由于其蛋白質表面有強酸補丁,可以使其保持水合狀態,即使在高鹽條件下也能夠避免自聚集[14]。這與TATE等[36]的研究結果相一致,即嗜鹽酶比其非嗜鹽同源酶表面的酸性殘基所占比例更高。

5 GGT的檢測方法

5.1 分光光度法

在有受體和無受體情況下,γ-谷氨酰對硝基苯胺(L-γ-glutamyl-p-nitroanilide,γ-GpNA)的轉肽反應或水解程度可分別反映GGT轉肽和水解活性。

5.1.1 GGT的轉肽活性測定

一般采用以γ-GpNA為供體、雙甘二肽為受體的酶反應體系測定GGT的轉肽活力,如圖6所示。構建含有一定終濃度的γ-GpNA、雙甘二肽、NaCl、緩沖液和酶液的反應體系,恒溫水浴37 ℃反應一定時間,加入醋酸溶液終止反應,于分光光度計(λ=410 nm)測定吸光值。1個轉肽酶活力單位定義為該條件下每分鐘生成 1 μmol 對硝基苯胺的酶量。

圖6 轉肽酶活力測定體系中發生的反應Fig.6 The reaction occurred in the assay system of transpeptidase activity

5.1.2 GGT的水解活性測定

GGT的水解活性的測定可參照TATE等[36]描述的測定方法:在1 mL的酶活力測定體系中加入一定終濃度的 γ-GpNA、Tris-HCl(pH 7.0)和適當稀釋的酶液,于最佳溫度下反應一段時間后,以乙酸溶液終止反應,測定吸光值(λ=410 nm)。一個水解酶活力單位定義為每分鐘水解生成1 μmol對硝基苯胺所需的酶量。

5.2 高效液相色譜法

高效液相色譜可定量測定GGT反應中的底物消耗量或產物生成量,因此可以用于定量測定GGT催化活性。GGT酶法合成L-茶氨酸的催化體系中,一般采用高效液相色譜法測定L-茶氨酸產物的生成量,用于表征GGT活力[37]。分別以L-谷氨酰胺和乙胺為供體和受體底物,GGT作為催化劑構建轉化體系,添加硼酸-NaOH緩沖液,在pH 10、37 ℃下反應一定時間,加入三氯乙酸終止反應。反應液經離心,濾膜過濾后,采用高效液相色譜對催化反應液中的L-茶氨酸含量進行測量,進而可以準確表征GGT活力。

6 GGT在食品工業領域的應用

利用GGT生物催化合成目標產物與化學法相比具有顯著優勢,在食品、醫藥等領域應用廣泛。細菌GGT通過酶促氨基酸與相關胺類化合物的γ-谷氨?；磻?可生成一系列γ-谷氨?；衔?具有增強食品風味、改善溶解度和提高蛋白酶抗性等用途,在食品工業中具有重要意義[38]。近年來,得益于酶工程技術的發展,生物催化與轉化技術在食品工業生產中逐漸受到重視,利用GGT制備一系列γ-谷氨?；衔镆殉蔀樯锎呋I域的熱門研究方向之一。

6.1 催化合成茶氨酸

茶氨酸(L-theanine,γ-N-乙基谷氨酰胺)是茶葉中特有的一種非蛋白游離氨基酸,屬于酰胺類化合物。L-茶氨酸具有焦糖味及類似味精的鮮爽味,其不僅對茶葉的品質與風味有重要影響,還具有豐富的生理活性,能夠調節人體情緒,影響記憶和學習能力,在穩定情緒、緩解壓力、提高睡眠質量、預防肥胖、預防心血管疾病等方面具有一定作用。L-茶氨酸不但可以作為食品添加劑,還可作為新型食品功能因子。

化學法制備L-茶氨酸反應時間長、收率較低、易產生DL-型消旋體等副產物,在實際生產中純化復雜、成本較高,也對產品安全性和生態環境具有潛在危害。而酶促合成法中催化反應具有立體結構專一性,不產生消旋體副產物;反應體系易建立,無需對谷氨酸等底物側鏈進行保護與脫保護;轉化率較高,反應時間較短且無需ATP供能,具有較高的應用潛力。

GGT是酶促合成L-茶氨酸途徑中的關鍵酶,其可催化谷氨酰胺的γ-谷氨酰胺基團轉移到乙胺上實現茶氨酸的合成。SUZUKI等[39]首先報道了大腸桿菌K-12 SH642來源的GGT能夠催化L-谷氨酰胺與乙胺生成L-茶氨酸。CHI等[28]利用地衣芽孢桿菌來源的GGT突變體N450A催化茶氨酸的合成,在37 ℃、pH 10.5條件下反應4 h,底物轉化率達到94%。HUNG等[40]使用固定化重組大腸桿菌制備L-茶氨酸,發現EcGGT固定化的最適海藻酸鹽質量濃度為20 g/L,實驗轉化率為23%。上述固定化GGT在循環使用5次后仍然表現出穩定性。YANG等[27]表達了B.pumilus來源的GGT,以此為催化劑合成茶氨酸,在37 ℃、pH 10.0 條件下反應16 h,底物轉化率為63%。楊套偉等[41]通過聚腺苷酸化修飾提高重組GGT產量,再過表達脂蛋白PrsA以促進GGT分泌表達,發酵48 h后,重組菌B.subtilispMA5-ggt-HapⅡ-prsA胞外GGT活力達到18.65 U/mL,優化反應條件并采用流加補料策略催化16 h,茶氨酸產量可達 65 g/L。劉栓英[24]將B.pumilusML413 來源的GGT基因成功在B.subtilis168 宿主細胞中成功克隆表達,優化以L-Gln和乙胺為底物的催化合成體系轉化條件,在35 ℃、pH 10.0條件下,分批補料擴大體系催化合成茶氨酸,最終產率達60%。

盡管國內外已有眾多學者對GGT在催化茶氨酸方面的應用進行研究,茶氨酸的產量相對于傳統合成來說已有較大提升,但生產成本仍然較高。未來應篩選和表征更多具有潛在應用價值的GGT,優化其酶學特性和產茶氨酸能力;利用理性設計、定向進化,結合高通量篩選方法獲得具有理想特性的分子改造GGT,開發出可滿足工業生產L-茶氨酸需求的高效催化劑。

6.2 催化合成其他谷氨?；衔?/h3>

通過研究不同氨基酸受體對GGT轉肽活性的影響,結果顯示相較于雙甘二肽,GGT能更好地接受一些天然氨基酸作為γ-谷氨酰胺受體,如蘇氨酸、精氨酸、纈氨酸等[42],這也拓展了該酶在制備重要的γ-谷氨酰胺化合物方面的應用潛力。

6.2.1 濃厚味γ-谷氨酰肽的合成

濃厚味γ-谷氨酰肽是一類能夠賦予食物濃厚感、豐富度、協調性等綜合性味覺感受(kokumi特性)的γ-谷氨酰肽,主要是二肽或三肽,能夠改善食品風味。近年來,濃厚味γ-谷氨酰肽對奶酪[43]、芝士[44]、豆醬[45]等食品濃厚味的貢獻作用陸續得到證實。以肽類食品風味增強劑為產品導向,進一步開發基于濃厚味γ-谷氨酰肽的新型產品逐漸成為食品研究者關注的方向之一。研究人員已經成功以L-谷氨酰胺為供體,不同類型氨基酸為受體,利用細菌GGT作為生物催化劑酶促合成多種濃厚感肽[44-47]。同時結合酶工程技術以及酶復配優化策略,有效提高了GGT的催化效能,為酶法合成濃厚味γ-谷氨酰肽的規?；瘧锰峁┝嘶A。

6.2.2 GSH合成

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構成的三肽,在所有生物細胞中均有分布,具有抗氧化作用。GSH作為一種重要的氨基酸衍生物。不僅可用于醫藥領域,也可作為功能性食品的原料,在增強免疫力、抗腫瘤、延緩衰老等功能性食品中廣泛應用。沈繼朵等[48]利用GGT和谷胱甘肽合成酶(GSH-Ⅱ)經兩步反應合成GSH,解決了GSH對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-Ⅰ)反饋控制的作用,創新了生產GSH的新線路。張魯嘉[49]利用B.subtilisNX-2的GGT催化L-谷氨酰胺和S-苯甲基-半胱氨酰甘氨酸甲酯(S-phenylmethyl-cysteinylglycinate methyl ester, SBCGM)獲得了GSH的前體γ-谷氨酰SBCGM。韋光緒等[50]通過GGT催化和進一步還原,得到了體內合成GSH的中間產物γ-谷氨酰半胱氨酸,實現其合成工藝的簡化。

6.2.3 γ-谷氨酰肽衍生物

一些C端具有γ-谷氨酰殘基的功能性γ-谷氨酰肽衍生物可通過GGT催化大規模合成,如γ-L-谷氨酰-L-3,4-二羥基苯丙氨酸(γ-glutamyl DOPA)[51]、γ-L-谷氨酰-?；撬?γ-Glu-Tau)和β-N-[γ-l(+)谷氨?；鵠苯肼[52]。楊娟[53]首次報道了解淀粉芽孢桿菌源GGT在催化合成一類小分子γ-谷氨酰肽中的應用。大蒜中一些天然風味增強劑,如γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸[54]和γ-谷氨酰S-甲基-L-半胱氨酸也可以GSH為底物經 GGT催化合成。GGT還可通過修飾和改性氨基酸來改善不良風味。如催化L-苯丙氨酸形成γ-谷氨酰苯丙氨酸[55],從而降低某些人體必需氨基酸的苦味。

6.2.4 醬油發酵中的應用

GGT的水解活性也被用于醬油發酵,以賦予其獨特的鮮味[56],也起到一定改善不良風味的作用。GGT在大豆發酵過程中穩定存在,特別是耐鹽型GGT,能夠在高鹽濃度環境下保留較高的活性。其能夠將大豆蛋白分解所得的谷氨酰胺進一步水解成為谷氨酸,減少谷氨酰胺向焦谷氨酸的轉化,抑制醬油產品不良風味和口感的出現。

6.2.5 乳制品中的應用

在牛乳加工行業中,熱處理是提高乳制品安全性和延長產品保質期的常用手段。為檢驗乳制品熱處理強度是否合格,需選定相應指標進行判定。GGT因其較為穩定的活性,在作為巴氏殺菌熱處理標志物方面也具有一定應用價值[39]。

7 總結與展望

γ-谷氨酰轉肽酶的研究近年來在食品工業領域受到了廣泛關注。結構生物學、酶工程等技術的發展進一步揭示了GGT的分子結構與催化機制,也為分子改造GGT以提高其酶學特性提供了更多途徑。微生物來源的GGT目前已被廣泛發掘、重組表達、性質分析及應用[19],然而目前還尚缺乏高效、穩定的商品化GGT酶制劑,大多數文獻報道的GGT酶法催化應用還處于實驗室級生產水平。為解決上述問題,未來還需從不同來源定向篩選高活性GGT基因;利用酶工程方法改造酶分子結構以改善GGT酶學特性、減少副反應(水解和自轉肽反應)的發生;通過計算機輔助設計、定向進化結合高通量篩選獲得穩定性、催化特性增強的人工進化酶;結合吸附、包埋、交聯和共價結合等酶固定化手段[57]提高酶的穩定性和耐受性;選擇適宜的發酵工程策略提高酶的產量。從而為茶氨酸等γ-谷氨酰肽產物高產量、低成本的綠色生物制造提供基礎。