適冷β-半乳糖苷酶及其在食品工業中的應用

周玲, 龔金炎,何光華,肖功年,許韓山,李玲*

1(浙江科技學院 生物與化學工程學院,浙江 杭州,310023)2(杭州市臨平區質量計量監測中心,浙江 杭州, 311199)

β-半乳糖苷酶是一種重要的酶,具有水解乳糖和合成低聚半乳糖的功能,通常來源于細菌、酵母菌、霉菌等微生物[1]。β-半乳糖苷酶在食品工業中廣泛應用于制造乳糖水解物(供乳糖不耐受患者使用)以及形成糖基化產物,具有重要意義。牛乳中乳糖質量分數為4.5%～5.0%,乳糖經過人體小腸黏膜細胞中分泌的β-半乳糖苷酶水解后才能被機體吸收,缺乏該酶會導致乳糖不耐受。在非洲國家乳糖不耐癥人群高達90%～100%,在亞洲占70%[2]。目前,解決乳糖不耐癥的最佳方法是用β-半乳糖苷酶水解乳糖生產低乳糖或無乳糖乳制品[3]。常用的商業化β-半乳糖苷酶的最適反應溫度大多較高,對pH的要求比較嚴格,從而存在生產成本較高、消耗能量高等問題。但是,在乳制品生產工業中,很多操作工藝都是在低溫下進行,因此,理想化的β-半乳糖苷酶是能夠在低溫下具有較高酶活性的適冷酶。本文從β-半乳糖苷酶的微生物來源、特性、催化特性的研究現狀進行綜述。進一步對適冷β-半乳糖苷酶的來源、特性、耐冷機制及工業化應用進行詳細的闡述。并對適冷β-半乳糖苷酶前景進行了展望,為該酶改造的深入探索與應用開發提供參考。

1 β-半乳糖苷酶來源、特性及催化機制

1.1 β-半乳糖苷酶來源及特性

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC:3.2.1.23)全稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galactohydrolase),俗稱乳糖酶,具有催化半乳糖和葡萄糖之間β-糖苷鍵功能,也參與合成半乳糖化產物或低聚半乳糖。根據基因序列、結構、底物特異性和反應機理不同,β-半乳糖苷酶分為糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)GH1、GH2、GH35和GH42家族。大部分已報道的微生物來源的β-半乳糖苷酶屬于GH2和GH42家族。

β-半乳糖苷酶來源廣泛,主要來源于微生物,如細菌、酵母和絲狀真菌。其中,酵母菌、霉菌是商業化β-半乳糖苷酶的主要來源,有曲霉菌屬(Aspergillus)和克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)[4]。不同來源的β-半乳糖苷酶在酶學特征上存在較大差異。一般霉菌來源β-半乳糖苷酶的最適pH值為2.5～5.4,最適溫度最高達到50 ℃。霉菌來源的β-半乳糖苷酶是胞外酶,便于應用于水解乳糖。相反,酵母菌來源的β-半乳糖苷酶是胞內酶,乳糖先通過透性酶轉運至細胞內再被水解代謝[5]。來自乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶最適pH值為4.8,最適溫度是50 ℃;來自脆壁克魯維酵母和黑曲霉的β-半乳糖苷酶的最適pH值為4.0～4.5,pH值為3.0～7.0時較為穩定,最適溫度為55 ℃[6]。乳酸菌作為一般認為安全的微生物,也是β-半乳糖苷酶的較好來源。從植物乳桿菌BFP32中所分離得到的β-半乳糖苷酶的最適溫度為60～65 ℃;從德氏乳桿菌和母乳中篩選出的發酵乳桿菌中的β-半乳糖苷酶的最適溫度為40 ℃[7-8]。從保加利亞乳桿菌L2和嗜熱鏈球菌S2 中分離出來的β-半乳糖苷酶,在42 ℃條件下發酵脫脂乳6 h時,其乳糖分解率均高于65%,乳糖殘存量均低于2%[9]。MAISCHBERGER等[10]在戊糖乳桿菌中篩選的β-半乳糖苷酶的最適pH值為7.5,最適溫度為55 ℃;以乳糖為底物,最適pH值為8.0,最適溫度為60～65 ℃。從乳酸菌篩選出的β-半乳糖苷酶的活性相對高,但是,在中溫或高溫條件下其酶活性和水解乳糖能力相對高。

1.2 β-半乳糖苷酶的催化機制

1.2.1 分解乳糖的作用機制

乳糖不耐癥在世界多數地區都存在,亞洲地區成年人中有乳糖不耐癥占70%以上[2]。目前,乳制品用β-半乳糖苷酶預先處理后,乳制品中的乳糖含量可降低70%～80%。利用β-半乳糖苷酶生產低乳糖牛奶等乳制品成為解決乳糖不耐受問題最有效的途徑[3]。除此之外,水解乳糖可減少由于乳糖的低溶解度而引起的結晶問題,并增加了乳制品的甜度。β-半乳糖苷酶對乳糖的水解分為糖基化和去糖基化兩個步驟(圖1-a)。首先是糖基化,乳糖通過催化反應將其分解成葡萄糖和酶-半乳糖共價中間復合物。其次是去糖基化,葡萄糖分離后使半乳糖的異頭碳原子與水分子中的羥基基團生成半乳糖分子,從而達到把乳糖水解成為葡萄糖和半乳糖的目的[11]。

1.2.2 合成低聚半乳糖的作用機制

由半乳糖連接成聚合度為2～9的,通常在還原端含有一個葡萄糖單位的低聚糖為低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶還可在人體內通過轉糖苷作用生成低聚半乳糖,作為一種膳食纖維,它在腸道內作為增殖因子僅被雙歧桿菌利用,卻不會被腐敗細菌利用,可大大減少腸道有害毒素的產生,對預防便秘和腹瀉有很重要的作用[12]。與其他熟知的功能性低聚糖(如低聚果糖和低聚異麥芽糖)相比,低聚半乳糖是唯一能夠被人體全部腸道益生菌利用的益生元。并且,低聚半乳糖具有輕微甜味,是蔗糖甜味的30%～60%。轉半乳糖化是β-半乳糖苷酶的固有性質,在乳糖水解過程中會形成低聚糖。將乳糖的半乳糖部分轉移到含有羥基的受體分子中,可產生具有不同聚合度和不同糖苷鍵的低聚糖。合成低聚半乳糖有以下3個步驟:1)釋放葡萄糖殘基,剩下的酶與半乳糖基殘基復合體以進一步反應;2)將該復合體轉移到含有羥基的受體中,溶液中低濃度的乳糖會刺激水分子充當受體并產生半乳糖;3)含有高濃度乳糖溶液中的乳糖作為受體,并與該復合物結合,最終產生低聚半乳糖[13](圖1-b)。生產低聚半乳糖的商業化β-半乳糖苷酶來自于乳酸克魯維酵母、環狀芽孢桿菌、兩岐雙歧桿菌、米曲霉、嗜熱鏈球菌等[14]。RABIU等[15]在各種雙歧桿菌(如角雙歧桿菌、兩雙歧桿菌BB-12、青年雙歧桿菌ANB-7、嬰兒雙歧桿菌DSM-20088、假長雙歧桿菌DSM-20099)的純培養物中提取β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖。PANESAR等[16]研究了對底物配比、乳糖初始濃度、溫度等因素對β-半乳糖苷酶催化乳糖轉半乳糖化生成低聚半乳糖的影響。但β-半乳糖苷酶的轉糖苷活性低,并且由于同時存在底物水解反應,導致產物往往包括多樣化糖苷聚合度及糖苷鍵構成類型,并最終限制了低聚半乳糖合成量和純度。

a-水解乳糖;b-合成低聚半乳糖圖1 β-半乳糖苷酶催化水解乳糖和合成低聚半乳糖的機理Fig.1 Mechanisms of β-galactosidase catalyzed hydrolysis of lactose and synthesis of galactooligosaccharide

2 適冷β-半乳糖苷酶

2.1 適冷β-半乳糖苷酶的來源及特性

酶的催化活性及穩定性受溫度的明顯影響。根據溫度對酶的活性及穩定性的影響,將酶分成適冷酶、中溫酶和高溫酶。適冷酶是一類在低溫(一般在0～30 ℃)條件下具有高催化活性的酶,并且可降低結合過程中酶的變構作用和催化底物變化所需要的活化能,因此,適冷酶在低溫時需要較少的能量就能完成催化過程。適冷酶的最適反應溫度與嗜溫酶相比要低20～30 ℃。目前,適冷β-半乳糖苷酶主要從適冷微生物中分離得到,這些微生物從極地、深海、高山地區等地方篩選,如節桿菌屬(Arthrobacter)、動物球菌屬(Planococcus)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、副球菌屬(Paracoccus)、噬鹽古細菌(Halorubrumlacusprofundi)[17-20],其酶學性質如表1所示。除了來自Arthrobactersp.C2-2的β-半乳糖苷酶具有六聚體結構、來自副球菌屬32 d的具有二聚體以外,適冷β-半乳糖苷酶一般都屬于GH2家族,具有四聚體結構[17,19,30]。有些適冷微生物含有2種或多種編碼β-半乳糖苷酶的基因,屬于不同的家族。比如,節桿菌屬含有2種β-半乳糖苷酶,分別屬于GH2和GH42家族;適冷桿菌(Cryobacteriumsp.LW097)含有4種β-半乳糖苷酶,其中1種屬于GH35、3種屬于GH42[29]。這些適冷性β-半乳糖苷酶的篩選,主要通過含有X-gal的培養基來進行篩選,β-半乳糖苷酶可以分解X-gal形成藍色化合物。根據不同微生物選擇不同培養基,如YPD培養基中或者乳清培養基加入X-gal[34-35]。

表1 不同微生物來源適冷β-半乳糖苷酶的酶學性質Table 1 Enzymatic characteristics of β-galactosidase from different microorganisms

除了從天然適冷菌中分離出適冷性β-半乳糖苷酶,可以通過DNA重組技術和基因突變的技術獲得具有適冷性能的β-半乳糖苷酶。CIELISKI等[36]在大腸桿菌中表達了來自擬交替單胞菌(Pseudoalteromonas) 22b的β-半乳糖苷酶,觀察到90%的牛奶乳糖在30 ℃下約6 h和15 ℃下28 h內被水解[36]。來自伊氏堿性乳桿菌(Alkalilactibacillusikkense)的低溫β-半乳糖苷酶,該重組酶在0 ℃時活性能夠保持60%,在10 ℃或更低溫度下穩定100 h以上[37]。此外,在冷休克蛋白(cspD2)基因啟動子的控制下,從鹽藍菌(Halorubrumlacusprofundi)中擴增并克隆了嗜極 β-半乳糖苷酶基因,并在鹽紅菌(Halorubrumsp.NRC-1)中表達,表達量提高20倍,經純化后在4 ℃條件下能夠保持10%的酶活性[20]。NIE等[34]在畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達了皺紋乳桿菌(LactobacilluscrispatusB470)的異二聚體β-半乳糖苷酶,并對重組β-半乳糖苷酶進行了純化,也在20～30 ℃下保持20%的活性。從節桿菌(Alteromonassp.ML117)分離的β-半乳糖苷酶在大腸桿菌中的表達,在10 ℃條件下24 h內能夠降解牛奶中86%的乳糖[38]。來自海洋交替單胞菌(Alteromonassp.QD01)的β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中表達時,金屬離子促進了β-半乳糖苷酶的活性。該酶的最適 pH 值和溫度分別為 8.0 和 40 ℃,30 ℃時維持60%的酶活性[39]。WANG等[40]構建了一個土壤宏基因組文庫,并成功分離到一個新的 β-半乳糖苷酶基因,并在畢赤酵母中表達和純化,純化后的酶在 38 ℃和pH=7.0 時表現出最高的酶活性,并在 0 ℃ 條件下可維持11%的活性,被認為是適冷β-半乳糖苷酶。

乳酸菌是多種發酵食品的發酵劑。目前,關于乳酸菌中適冷β-半乳糖苷酶的研究極少,只有羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)L461和L103[41]。因此,通過基因突變或蛋白質結構變化提高β-半乳糖苷酶的耐冷性也是一個新的研究方向。

2.2 適冷β-半乳糖苷酶的適冷機制

目前,研究已報道關于適冷酶結構的一些變化:如酶分子具有更大的柔韌性和較小的功能域;減少了亞基表面之間的相互作用并增加了暴露于溶劑中的疏水殘基的數量;酶的活性中心更容易接近底物,且酶與底物的親和力更大等[42]。與中溫酶、高溫酶相比,適冷酶的催化腔中所有反應側鏈的序列都具有高度保守型,這表明酶的催化機制并沒有發生改變。但是,與同種酶的中溫酶和高溫酶相比,適冷酶的一級序列和高級結構存在差異,如甘氨酸含量增加,脯氨酸和精氨酸含量減少,鹽橋、芳香環相互作用和疏水作用減弱;分子間、亞基間以及結構域間的相互作用減弱;與溶液間的相互作用增強;環狀結構增加,使蛋白質分子具有較高的柔韌性和較低的熱穩定性[43]。酶活性位點的親和性改變也是適冷酶的一種特點,具有大的、開放式的催化裂口[44]。雖然適冷酶的親和機理尚未清楚,但一些研究表明,適冷酶可在低能量消耗狀態下與底物親和,酶的構象改變。因此,適冷酶分子的整體結構變化對適冷酶在低溫下的催化效果起到重要作用。

一般情況下,溫度降低10 ℃,酶的反應速度會降低2～3倍。研究表明,與中溫和高溫酶相比,適冷酶可以降低反應活化能,在低溫下的催化速率(kcat)增加,其Km有所下降。然而,一般適冷酶在低溫下的活性提高是通過優化Km值來實現,其通過改變蛋白質序列及結構增加蛋白質的柔韌性。MANGIAGALLI等[45]通過減弱鹽橋、芳香環相互作用和疏水作用及降低金屬結合親和力的方法提高適冷酶的活性。適冷酶與中溫和高溫酶相比,在低溫下具有較高的比活力和較低的最適催化溫度(Topt,20～45 ℃)。雖然有些適冷酶的Topt與嗜熱酶同系物沒有差別[46]。尤其是,適冷酶的失活溫度低于蛋白質的變性溫度(Tm),這表明酶的活性中心比整體結構更不耐熱[47]。然而,中溫和高溫酶的失活溫度與蛋白質變性溫度相同(Topt=Tm)。此外,與中溫酶和高溫酶相比,適冷酶具有較低的熱穩定性。FELLER[48]測定來自適冷、中溫和高溫微生物的α-淀粉酶分別在50 ℃下完全失活的時間,其中適冷酶60 min后完全失去活性,而中溫和高溫酶100 min后還保持60%和90%的活性。

適冷酶與中溫酶同系物之間的特性比較如圖2所示。

a-最適反應溫度;b-熱穩定性;c-蛋白質在折疊/伸展轉變的 差示掃描量熱法圖譜;d-圓二色光譜或熒光光譜法圖2 適冷酶與中溫酶同系物的特性分析Fig.2 Characteristic analysis of a homologue of cold-adaptive enzyme and mesophilic enzyme

圖2-a比較了適冷酶和中溫酶的最適反應溫度,表示適冷酶在低溫下更活躍,適冷酶的最適溫度在20～45 ℃,而中溫酶在50～60 ℃。圖2-b比較了特定溫度下的酶的熱穩定性,適冷酶的熱穩定性低,在Topt溫度下,酶活性能維持90 min左右。相比之下,中溫酶和高溫酶在相同溫度下可維持更長時間。圖2-c和2-d用差示掃描量熱法和圓二色光譜或熒光光譜法測定了蛋白質在折疊/伸展轉變時的熱量。適冷酶具有較低的Tm值、量熱焓(ΔHcal)[49]。

3 適冷β-半乳糖苷酶的優點及工業化應用

在食品生產中利用適冷酶的最大優點是能夠保護耐冷性生物活性成分。適冷β-半乳糖苷酶主要用于乳糖的水解和低聚糖的生產。β-半乳糖苷酶主要用來治療乳糖不耐受癥,處理加工牛乳、乳清,生產低乳糖牛奶和乳制品。

3.1 適冷β-半乳糖苷酶在低乳糖和無乳糖乳制品工業中的應用

β-半乳糖苷酶被廣泛用于生產無乳糖乳制品,是專門為消化系統中缺乏β-半乳糖苷酶的乳糖不耐受患者設計的。此外,β-半乳糖苷酶用于冰淇淋和煉乳生產,以避免乳糖結晶,并提高這些產品的甜度和奶油味[3]。無乳糖牛奶是在牛奶儲存期間(分批過程)或在超高溫處理(無菌過程)之后添加可溶性β-半乳糖苷酶生產的(圖3)。在無乳糖乳制品生產工業中,理想化的β-半乳糖苷酶在4～8 ℃具有較高的酶活性,且能夠耐受Na+、Ca2+、葡萄糖的抑制[50]。目前,用于低溫水解乳糖的適冷β-半乳糖苷酶來自于交替單胞菌屬、低溫桿菌、路氏腸桿菌(Enterobacterludwigii)、歐文氏菌屬微生物(Erwiniaamylovora)等[51]。含有適冷β-半乳糖苷酶的菌株可以在低于30 ℃的溫度下以乳糖作為唯一碳源生長,如假交替單胞菌DFR1和DFR6可以在添加1%乳糖的營養肉湯中生長,因此特性該菌株也被應用于大規模水解乳糖[6]。WIERZBICKA-WOS等[31]從副球菌屬32 d中分離出來的適冷β-半乳糖苷酶,也適用于在冷藏溫度下水解牛奶中的乳糖。FAN等[18]將來自耐冷菌拉恩氏菌屬R3的編碼適冷β-半乳糖苷酶的基因在大腸桿菌中表達,發現該酶在4 ℃下也具有高活性,可分解冷藏牛奶中的乳糖,并在巴氏殺菌時失活,最大限度保存牛奶的營養成分。適冷β-半乳糖苷酶在低溫下可水解牛奶中的乳糖保持原有味道,也提高對乳糖不耐癥人群的營養價值。此外,適冷β-半乳糖苷酶乳糖水解能力高,可縮短水解時間,也可以減少細菌污染的風險。因此,在較低溫度和較大pH范圍下具有高活性的耐冷β-半乳糖苷酶,對于降低成本、節約能源,具有重要的應用價值。

3.2 適冷β-半乳糖苷酶在奶酪乳清乳糖分解中的應用

奶酪乳清是奶酪制作過程的主要副產品之一。乳清是酪蛋白凝聚和凝乳分離后得到的液體相,含有乳糖、蛋白質、脂類和礦物鹽。乳清在生產中常常被當做廢液直接排放,不僅浪費資源,而且污染環境。乳清可作為微生物發酵或化學修飾生產高價值化合物的乳糖來源。在此情況下,先用β-半乳糖苷酶進行預處理,以獲得葡萄糖和半乳糖,更適合作為微生物生長的底物(圖3)。但目前利用適冷β-半乳糖苷酶水解乳清的研究極少,來自擬交替單胞菌的適冷β-半乳糖苷酶水解乳清中的乳糖生產低熱量天然甜味劑——D-塔格糖。在此過程中,乳糖在23 ℃下進行水解,不需要額外的進行冷卻或加熱工藝[22]。

圖3 適冷β-半乳糖苷酶在低乳糖或無乳糖牛奶和 奶酪乳清中分解乳糖的應用Fig.3 Application of cold-adapted β-galactosidase in lactose hydrolysis of low-lactose or non-lactose milk and cheese whey

3.3 適冷β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖合成中的應用

低聚半乳糖是一種益生元,可以促進有益的腸道細菌(如乳桿菌或雙歧桿菌)的生長,抑制病原菌在胃腸道中的定殖。并且,在化妝品和食品工業中分別用作添加劑和甜味劑。來自南極細菌Alteromonassp., 南極節桿菌屬的適冷β-半乳糖苷酶可應用于低聚半乳糖的合成[52-53]。此外,可利用來自節桿菌屬的適冷β-半乳糖苷酶合成各種寡糖,如乳果糖、低聚木糖、低聚阿拉伯糖[53]。

4 展望

目前,對β-半乳糖苷酶的特性分析研究較多,也廣泛應用于乳糖的水解和低聚半乳糖的合成。具有較高β-半乳糖苷酶活性的菌株有利于提高食品中乳糖的水解率,減少乳糖不耐受的影響,合成低聚半乳糖刺激人體小腸中有益細菌的增殖。由于實際乳制品生產操作在低溫下進行,在低溫下具有較高酶活性的適冷β-半乳糖苷酶的研究和應用也越來越多。然而,適冷β-半乳糖苷酶研究不夠成熟。目前,適冷β-半乳糖苷酶主要從極地、深海、高山地區等地方篩選出的適冷微生物中分離得到。與同種酶的中溫酶和高溫酶相比,分析它們的結構特征推理耐冷機制,可將其小規模的應用到乳糖、乳清的水解和低聚半乳糖合成中。對適冷β-半乳糖苷酶,從以下幾點進行深入研究:1)挖掘更多的適冷β-半乳糖苷酶的微生物菌株。乳酸菌是各種乳制品中的主要微生物,可作為適冷β-半乳糖苷酶的主要微生物?？赏ㄟ^將耐冷微生物的β-半乳糖苷酶基因導入到乳酸菌中,獲得帶有適冷β-半乳糖苷酶的乳酸菌,應用到發酵食品中。也可通過對乳酸菌中的β-半乳糖苷酶基因或氨基酸序列進行突變或蛋白質結構變化提高其耐冷性。2)通過分子技術提高適冷β-半乳糖苷酶在低溫下的活性及熱穩定性研究。體外蛋白質定向改造是獲得適冷酶的一種新型方法。LAYE等[54]最新研究對南極耐鹽性β-半乳糖苷酶的幾個氨基酸進行突變,改變蛋白質的水合層提高耐冷性。研究顯示,很多與耐冷性有關的蛋白質結構特性尚未發現,需要不斷研究耐冷蛋白質及其機制進行研究。3)擴大適冷β-半乳糖苷酶的應用范圍。適冷β-半乳糖苷酶可應用于煉乳、酸奶等乳制品加工中。在煉乳加工過程中,水解乳糖使得濃縮時避免結晶,產品更細膩、減少蔗糖用量。制造低乳糖酸奶,可加速和提高發酵效率,使酸奶具有獨特的風味。