沙門氏菌表型異質性的研究進展

翟立公,蔡秋慧,李港回,黃菊,彭鋼,魏照輝,王俊穎

(安徽科技學院 食品工程學院,安徽 滁州,233100)

沙門氏菌(Salmonella)作為一種可引起動物腸胃炎、傷寒、敗血癥等癥狀的食源性致病菌,在不同宿主體內由于環境和壓力的不同,引發的病癥也存在著廣泛的差異[1]。目前對于沙門氏菌主要的治療方法是抗生素抗菌療法,隨著大量抗生素的使用,沙門氏菌不斷提升自身的適應性和致病性,出現了耐藥性和毒力等方面的表型異質性,甚至是多重耐藥和泛耐藥性的出現[2],對于當下的公共健康安全造成了嚴重威脅。

作為沙門氏菌等微生物在復雜多變的環境下的一種特性,表型異質性使不同環境和食品中分離出的沙門氏菌細胞有了不同的基因調控和表達,造成細胞群體間的差異,衍生出不同的表型特征。沙門氏菌進入宿主體內后,克服宿主的免疫防御系統,與原腸道微生物進行競爭才能夠引起感染。目前國內關于沙門氏菌表型異質性的研究相對甚少,本文總結了表型異質性的產生機制,從發現、宿主、策略和表型特征4個方面進行闡述,為將來尋找更優方法控制沙門氏菌以及其他致病菌的研究提供思路,深入了解沙門氏菌表型異質性的發展及其在發病機制中的作用,以便開發新的和更強大的治療方法。

1 表型異質性的產生

沙門氏菌群體間的表型異質性擁有著一系列復雜的來源,例如基因、細胞、細胞周期狀態以及環境等因素。異質性所指是在相同宏觀條件下個體同基因之間的變異性,這種變異性源于操縱子的調節以及隨機性,而產生的主要原因則是來自基因表達的噪聲和突變[3]。產生噪音以及突變的可能原因有:不同細胞對不同的組織微環境反應的結果;由部分轉錄因子的波動與正反饋回路相結合,共同形成基因表達所引起的結果。當病原體與宿主接觸時,個體細胞間可以通過相互抵觸和/或協同作用來提高整個群體的適應能力,引發不同程度的宿主反應,能夠有助于提高亞群群體對抗生素療法的耐受能力[4-6]。

不同的分子機制也可以引起表型異質性,分子因素產生的主要機制分為2種:一種是環境波動或者不同濃度;另一種是遺傳差異,由同源重組產生的遺傳區域的多種遺傳表現,這也可以解釋部分細胞之間表型差異的觀察結果[7]。當異質性涉及到遺傳機制,則分為2種:一種是沙門氏菌自身的進化遺傳機制,在沒有基因突變的情況下發生變異,例如,啟動子調控區DNA重復序列的擴張和收縮以隨機或可逆的方式對基因表達進行打開或者關閉[8];另一種是腸道沙門氏菌特異性位點重新組合的DNA片段倒位產生開/關轉錄狀態,為了控制位點特異性重組酶,DNA重排也可以被視為一種引起異質性的隨機機制,但這種機制極易受到生理或環境的影響[9]。

當沙門氏菌進入宿主體內后,其基因的不同表現有助于沙門氏菌的持久性、增殖、入侵和傳播等方面。面對環境的變化,某個基因的正反饋回路而產生的不同狀態形成了雙穩態,而雙穩態表達可以幫助沙門氏菌成功感染宿主,2個基因之間的相互激活或者抑制是維持異質性機制的根源,因此也賦予了沙門氏菌種群在不同宿主下更多的表型多樣性[10]。研究表明,雙穩態表達導致鼠傷寒沙門氏菌在感染期間為了成功定殖感染,其沙門氏菌致病島1(Salmonellapathogenicity island 1,SPI-1)分化出2種亞群:有毒性表型和無毒性表型[11]。有毒亞群生長緩慢,無毒亞群則增長快速。盡管大部分基因的表達受到嚴格調控,但仍然有部分基因可以進行異質表達,并且使基因分為“開/關”(ON/OFF)2種亞群的狀態[12]。

2 宿主作用

沙門氏菌感染宿主期間,因為宿主環境的多樣化與宿主敏感性和特異性的不同,形成具有不同程度炎癥的區域。免疫系統檢測到入侵的病原體,宿主通過調節基因表達、藥源檢測和免疫記憶等方式建立適當的防御反應[6]。先天免疫反應的強度因宿主組織、細胞類型和感染階段形成了不同強度的免疫系統,導致毒力基因表達差異顯著。腸道內的微生物群在面對沙門氏菌的“入侵”時,首先限制了沙門氏菌從腸道獲得的營養供應,用來阻止病原體生長,構成免疫防御,為了適應宿主體內限制造成的波動環境,突破免疫帶來的局限,最大程度達到致病性,沙門氏菌病原體只能轉變出更具有適應性的代謝能力,用來規避由宿主介導的對營養物攝取的限制[13]。

同樣由于宿主自身的敏感性與特異性,營養供應也表現出相應地異質性,這一特征使沙門氏菌在宿主體內的營養限制和應激蛋白的不同亞群同樣也產生了異質性。作為在沙門氏菌病感染期間造成抗生素治療失敗多樣化原因之一,異質性能夠幫助部分病原體逃避針對性治療。大多數抗生素在進行治療時,只有單一靶點對沙門氏菌進行滅殺,而產生了異質性變化的沙門氏菌亞群也可能會導致治療效果的靶點發生變化,抗生素治療對于靶點的作用也可能會因為靶點的變化使療效效果折損甚至失效[14],這一特點可以通過蛋白質組學和代謝組學進行驗證。

3 表型異質性策略體現

從目前的部分動物感染實驗中發現,往往只能觀察到感染中某個節點的整體表型和基因型。而觀察異質性對于毒力、耐藥、生長等表型的影響卻是一個長期觀察的結果,還需比較群體中個體的變化,通過增殖和存活等特征才能明確其生物學意義[15]。在這樣的長期研究中,發現“賭注對沖”和“分工”2種模式是沙門氏菌異質性發生作用的主要策略。

3.1 “賭注對沖”策略

沙門氏菌在被攝入宿主體內之后,部分細胞將因為雙穩態表達產生不同作用的2種表型亞群,一部分亞群表達優化當前環境形成的表型,另一部分亞群的表達用于承受環境波動帶來的壓力。病原體從外部進入宿主從腸道轉移到更深的組織中,當受到免疫系統的攻擊時,由承受壓力的那一部分亞群進行“犧牲”來完成對沖策略完成生態優勢[16]。在面對抗生素的治療或者免疫系統的攻擊時,有一部分細胞種群無法被根除,這部分細胞叫做持久性細胞,它們生長緩慢,對抗生素具有表型耐受性,但無法遺傳耐藥性,更能在面對來自抗生素的威脅時存活下來,等待治療結束后重新再次生長繁殖[17]。如圖1所示,當細胞群體面臨抗生素的威脅,正常生長細胞在“對沖”模式下被殺死,持久性細胞則會存活下來直到抗生素脅迫結束?？股刂委熃Y束后,持久性細胞恢復正常生長,又會重新建立由持久細胞和正常生長細胞組成的種群。

圖1 持久性細胞與正常生長細胞“對沖”模型Fig.1 The “hedging” model of persistent cells vs. normal growth cell

3.2 “分工”策略

當單個細胞不能同時執行多種功能時,分工策略使得相關的表型在群體中劃分出不同的職能[18]。通過分工合作增強了沙門氏菌群體的適應度,每個亞群同時按需分工,提高了群體的適應性。例如,感染功能通常對于單個細菌來執行是不可能的,但當沙門氏菌在亞群中劃分職能分工合作時,就可以提升效率完成感染[19]。分工的優勢在于不需要過分考慮環境波動帶來的顛覆性影響,需要的是各亞群的相互協作確保沙門氏菌在環境中能夠順利存活。如圖2所示,SPI-1ON亞群侵入盲腸黏膜,在“犧牲”部分的自己使腸道發生炎癥,抑制腸道原微生物群的生長,SPI-1OFF沙門氏菌亞群則進入腸道不斷生長,形成分工策略的典型例子[20]。

圖2 SPI-1“分工”模型Fig.2 A model of “division of labor” for SPI-1

對于賭注對沖,“犧牲”部分細胞來成全整個病原體的穩定性,毒力基因就可能支持病原體在通過腸道并到達新宿主或者占據宿主體內新生態位。分工也是如此,因為2種亞群會有一種適合造成宿主體內慢性感染,可能無法被免疫系統或者藥物檢測出來,負責生長;而另一種由于具有侵襲的能力,負責感染[21]。賭注對沖的作用體現在波動的環境中提供耐受性,分工的作用體現于亞群之間的相互作用,大多數產生表型異質性的細胞并不是嚴格意義上的只使用一種策略去生存,而是將“賭注對沖”與“分工”結合,而這將最大限度的提升沙門氏菌在宿主體內的生存能力。

4 表型異質性基本特征

沙門氏菌進入宿主體內就開始了毒力因子的表達。進入腸道后,沙門氏菌首先面對的就是來自腸道低pH值的滅殺,耐酸反應之后進入小腸開始定殖[22]。進入小腸之后,沙門氏菌的鞭毛開始進行表達,鞭毛的結構細長并且彎曲,能對腸上皮細胞進行黏附和侵襲,將沙門氏菌推向其他營養更為富集的地方。隨后,利用SPI-1編碼的Ⅲ型分泌系統1(type Ⅲ secretion system 1,T3SS-1)將效應蛋白易位到上皮細胞中,這些效應蛋白使上皮細胞的DNA進行重排,導致膜皺褶和病原體被含沙門氏菌的液泡(Salmonellacontaining vacuole,SCV)吞噬。SCV中的低pH酸性液泡將會酸化自身的細胞質,而后打開了沙門氏菌致病性島2(SPI-2)的開關,SPI-2編碼的Ⅲ型分泌系統2(type Ⅲ secretion system 2,T3SS-2)將效應蛋白易位到SCV膜上并進行易位[23]。生物被膜的主要調節因子CsgD作為沙門氏菌的生物被膜主要組成與控制基因,可以調節沙門氏菌生物被膜相關基質化合物的表達,也利用著自身的雙穩態表達形成表型異質性的一部分[24]。脂多糖層能夠防止抗生素或其他對沙門氏菌不利的小分子進入沙門氏菌的細胞質中[25],也將展開異質表達。具有雙穩態表達的沙門氏菌毒力基因及其表型機制,見表1。

表1 雙穩態表達的沙門氏菌毒力基因Table 1 Salmonella genes with bistable expression

4.1 鞭毛

鞭毛擁有著復雜的結構和表達的調控系統。鞭毛結構中的fliC是構成鞭毛絲的主要結構亞基,參與了沙門氏菌鞭毛蛋白一系列致病過程。鞭毛基因在轉錄和轉錄后水平受到環境和鞭毛發育信號的調節[41]。

由于鞭毛基因的雙穩態表達,fliC和fljBA基因可以交替表達,鞭毛蛋白的合成就有了2種表型的變化[26]。當fljBA處于“開”狀態時,fljA基因與fljB共同轉錄,fljBA啟動子允許轉錄fljB,編碼fljB鞭毛蛋白,以及fljA、fliC的轉錄和翻譯阻遏。當fljAB處于“關”狀態時,即使沒有產生fljB或fljA,也會轉錄fliC基因。對于沙門氏菌來說,相較于fljB的表達,fliC的表達在腸道定殖方面更具有優勢[42]。鞭毛蛋白產生差異表達的是由hin轉化酶介導的DNA倒位的結果,當啟動子朝向fljBA操縱子時,合成了FljB鞭毛蛋白,fljA和fljC直接相互作用發生轉錄之后抑制fliC表達。由于hin介導的基因倒置,fljB和fljA都不會被轉錄,因此會解除對fljC抑制并且允許合成FljC鞭毛蛋白[43](圖3)。因此,沙門氏菌在鞭毛細胞做侵襲時做了2個亞群用來應對環境壓力:用作侵襲準備的表達 FliC的亞群和促進生存的 FljB 亞群。

圖3 腸炎沙門氏菌的fljB-fliC相位變化機制圖Fig.3 Mechanism of the phase change of fljB-fliC in Salmonella enteritidis

4.2 菌毛

菌毛是從細菌細胞表面延伸出來的蛋白質結構,有利于黏附到非生物和生物表面在病原體中,所以菌毛能夠幫助沙門氏菌定殖宿主組織[44]。菌毛中包含:與Peyer補丁連接的Lpf操縱子、與腸上皮細胞結合Pef操縱子、用于附著于盲腸上皮的std操縱子和編碼I型菌毛的fim操縱子[27]。這些纖維操縱子在受到相變的影響作用下,能夠同時有著各自的機制維持著沙門氏菌的表型異質性。

fimOFF和fimON亞群的形成是驅動fim操縱子轉錄的啟動子的 DNA 片段倒置控制而形成的。在Fim基因簇中含有fimZ、fimY和fimW三個調節基因和一個由fimU編碼的tRNA組成,另外一個對I型菌毛起負調節作用調控基因stm0551位于fimY和fimW之間。FimZ和FimY都能單獨地正向激活fimA啟動子(PfimA),并且FimY-FimZ可以產生蛋白復合物用來調節其他菌毛基因,FimW可以抑制fimZ的轉錄,用于下調fim基因表達。而fimU的缺失可以抑制FimY的翻譯,抑制Ⅰ型菌毛的產生[28,44]。

pef操縱子位于沙門氏菌毒力質粒上,PefI抑制pef表達,pef的轉錄受Dam甲基化和轉錄因子Lrp的控制[29]。在位于pef啟動子上游調節區內的3個GATC位點形成不同的甲基化模式決定了基因表達譜。HdfR蛋白是std操縱子表達的重要原料,HdfR以依賴于Dam甲基化的方式結合std啟動子,從而阻斷std上游調節區域2個GATC位點的甲基化。當GATC處于非甲基化狀態時,會加強與HdfR結合從而激活轉錄[30]。Lpf操縱子的雙穩態表達是因為細胞在不同位置、不同組織造成的相變引起的,因此形成了不同的表達調控而引起異質性。特別是LpfA與宿主細胞的交互作用,是控制開/關轉換的重要因素[31]。

4.3 SPI-1,SPI-2

沙門氏菌的致病島是其重要的毒力特征,沙門氏菌通過SPI-1編碼的T3SS-1,將特定的作用蛋白轉移到上皮細胞[32]。在功能上,SPI-1構成了沙門氏菌的侵襲功能,尤其是SPI-1ON亞群入侵上皮細胞,因為生長緩慢,同時也具有更高的耐受性。SPI-1ON能夠將效應子轉移到上皮細胞上,使他們被SCV吞噬后便開始裂解,從而將自身釋放到受感染的上皮細胞中的細胞質中,使SPI-1OFF在這種炎癥反應中受益[18]。SPI-1的雙穩態表達將SPI-1視作感染期間的“分工”,同時也是抗生素威脅下的“對沖”。有研究表明,鞭毛調節系統中的FliZ可能有助于SPI-1的雙穩態,同時也是SPI-1表達的激活劑[33]。由于鞭毛表達是有著雙穩態表達產生的相位變化,因此 SPI-1分成2種亞群:SPI-1ON,具有運動性和侵入性的沙門氏菌細胞亞群;SPI-1OFF,亞群是非運動和非侵入性的。

SPI-2與SPI-1的侵襲能力與異質性表達并不一樣,但是SPI-2編碼的Ⅲ型分泌系統T3SS-2與T3SS-1部分功能卻一樣,同樣能夠將編碼在SPI-2之外進行易位。T3SS-2表達由SPI-2編碼的雙組分調節系統SsrA/SsrB進行調節,易位的效應子以及雙組分調節系統負責將效應蛋白輸送到宿主細胞種,該系統不僅控制其自身的表達,還控制分泌裝置和分泌效應子的表達[34],它們可以大致分為ssa基因、ssr基因、ssc基因和sse基因四類[35]。SsrB結合并調節自身啟動子和與上游SsrA基因對應的啟動子的轉錄[36],并且SsrB可以通過解除H-NS抑制激活基因,也可以直接刺激轉錄[37]。

2種T3SS都分泌單獨的效應蛋白庫,在功能上,T3SS-1與SPI-1構成沙門氏菌的侵入性,T3SS-2與SPI-2則構成細胞內的致病性與耐受性。

4.4 生物被膜

生物被膜是微生物的組織結構,往往黏附在生物或非生物表面上并包裹在自己生產的細胞外基質中。沙門氏菌的生物被膜由卷曲纖維、纖維素、蛋白質和細胞外DNA的基質組成,包裹著細菌簇[45]。而CsgD作為鼠傷寒沙門氏菌的生物被膜主要組成與控制基因,可以調節沙門氏菌生物被膜相關基質化合物的表達,也利用著自身的雙穩態表達形成表型異質性的一部分[38]。

即便處于相同的應激條件下,CsgDON和CsgDOFF也能產生差異表達,形成生物被膜的異質性[46]。主要通過轉錄差異會形成了2種不同細胞譜系:第一種是聚集細胞,由c-di-GMP,氨基酸和碳水化合物代謝途徑基因形成的轉錄,對環境的變化具有更高的抵抗力;第二種是浮游細胞,浮游細胞具有侵襲性,毒性以及高活動性。形成的2種特殊細胞類型,浮游細胞適應毒力,聚集細胞則適應持久性,而這也正是體現了對沖策略[47]。CsgD激活csgBA操縱子,然后該操縱子編碼產生所需的蛋白質[48]。由于CsgD的表達和活性受c-di-GMP的直接控制,因此細胞內c-di-GMP細胞略微不同的差異都可能會導致生物膜形成顯著差異。

4.5 脂多糖

脂多糖是介導沙門氏菌生物膜形成的關鍵組分,與生物被膜和鞭毛一樣,脂多糖分子是鼠傷寒沙門氏菌用來觸發炎癥反應的病原相關分子模式。單個脂多糖分子由外膜的外小葉中的類脂A、核心寡糖、o-抗原共價連接組成[49]。o-抗原的修飾可以幫助沙門氏菌逃避宿主免疫系統,opvAB由細胞的2個質膜蛋白組成,是o-抗原的操縱子之一[25],opvAB操縱子前面的調節區域包含4個OxyR 蛋白結合位點和4個GATC甲基化位點,OxyR和Dam甲基轉移酶調控了opvAB的表達。在“打開”狀態下,OxyR蛋白在第2和第4個GATC位點進行結合,而第1和第3位點則形成甲基化;在“關閉”狀態下,觀察到相反的甲基化模式,第2和第4 GATC位點被甲基化。利用賭注對沖的策略,opvON種群可以在噬菌體的威脅下存活,威脅解除之后則再次產生opvOFF種群[25,40]。

與opvAB操縱子在調控中的相似是噬菌體P22的gtrABC(糖轉移酶)操縱子,它也能夠在細胞溶原化時修飾鼠傷寒沙門氏菌的o-抗原。在“打開”狀態下,第1和第2 GATC位點的甲基化,而切換到“關閉”狀態時,第3和第4個位點則發生甲基化[50]。

4.6 肌醇作用

肌醇是土壤中豐富的多元醇,其磷酸化形式被植物利用作為儲磷分子[51]。肌醇降解途徑由酶、轉運蛋白和調節劑組成,受其影響,鼠傷寒沙門氏菌能夠在以肌醇為唯一碳源的培養基中生長[52]。肌醇的降低是一種特殊的適應手段,它能夠幫助鼠傷寒沙門氏菌通過突破腸道中的營養限制來完成自身健康的生長。因此,這種方法有助于鼠傷寒沙門氏菌在其宿主生物中的存活、定殖、增殖和持久性。此外,肌醇的雙穩態表達產生2個亞群,其中一個可以增殖,而另一個亞群則不生長。

控制肌醇雙穩定性的主要參與者可能是IolR,它是在沒有肌醇的情況下iol基因的轉錄抑制因子[41]。有研究表明,IolR作為降解途徑的主要調節因子,在沒有肌醇的情況下可以抑制表達;如果存在碳酸氫鹽,或者不存在IolR,或者是細胞已經適應肌醇的最小介質的情況下,滯后期會極大的縮短,最終雙穩態表型被消除[53]。最近的一項研究表明,雙穩態主要與IolR和iol基因啟動子之間的相互作用有關[52]。因此,iol基因的表達是對于沙門氏菌的“抑制”,因為“打開”狀態下的細胞在競爭性生長中并不具有優勢。

5 結語

因為表型異質性的存在,由沙門氏菌引起的疾病治療方法變得多樣化,不同表型有不同的治療方案,目前的治療方法是廣泛使用抗生素,但是效果不斷下降,耐藥性卻得到了提升,甚至形成了多重耐藥性。隨著不斷適應高抗菌藥物濃度的亞群進化,如不及時進行干預,沙門氏菌對抗菌藥物耐藥性及適應性將不斷增加,屆時就會嚴重影響用藥選擇及治療效果,而沙門氏菌自身的進化機制使得我們需要更進一步的了解單細胞在群體中的作用?；虮磉_的異質性作為大部分細菌的本身特征,是可以由細菌自行選擇的。對于目前的研究來說,表型異質性可能是一種本身固有且未被充分認知的毒力特性,對于毒力因子來說,不同表達是否會影響到各毒力因子之間的關系以及是否影響到沙門氏菌繁殖后代細胞的生存仍然是一個未知數。感染過程中產生的異質性是由宿主免疫反應引起的還是它預先存在于亞群中以阻止環境壓力,這些問題仍值得探索研究。繼續研究異質性將對充分了解體內細菌種群動態,鼓勵開發快速清除感染的抗菌療法至關重要。未來單細胞技術的發展將使我們對異質性有更加全面的認識,也方便學者更好地、深入地解析異質性帶來的影響。